Legalize
Legalize / Česká republika / Vyhláška

Vyhláška Ministerstva životního prostředí, kterou se stanoví metody pro zjišťování fyzikálně-chemických a chemických vlastností chemických látek a chemických přípravků a vlastností chemických látek a chemických přípravků nebezpečných pro životní prostředí

Typ Vyhláška
Publikace 1998-12-22
Naposledy aktualizováno 1999-01-01
Stav Platný
Zdroj e-Sbírka
článků 2
Historie novel JSON API

Podle metody (recirkulační nebo průtokové zařízení) a druhu ryb.

Voda:

Viz 1. 6. 1. 2.

Osvětlení:

12 až 16 hodin světla denně.

Koncentrace rozpuštěného kyslíku:

Nejméně 80 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem.

Krmení:

Třikrát týdně nebo jednou denně; vysazení krmení 24 hodin před začátkem experimentu.

Po aklimatizační době 48 hodin se sleduje mortalita a používají se tato kritéria:

celá obsádka ryb se musí vyřadit;

dobu chovu je třeba prodloužit o dalších 7 dní. Pokud nedojde k dalším případům úhynu, je rybí obsádka pro zkoušku použitelná, jinak nikoli;

rybí obsádka je pro zkoušku použitelná.

Všechny ryby je třeba nasadit nejméně na 7 dnů před použitím pro zkoušku do vody stejné kvality a stejné teploty, jaká se má používat při zkoušce.

Před vlastní zkouškou je možno provést zkoušku předběžnou. Tato předběžná zkouška poskytuje informace o rozsahu koncentrací pro vlastní zkoušku.

Mimo zkoušky s různými koncentracemi zkoušené látky je třeba provést kontrolní zkoušky bez zkoušené látky a kontrolní zkoušky s nosičem, pokud se nějaký použije, avšak bez zkoušené látky.

V závislosti na fyzikálních a chemických vlastnostech zkoušené látky se zvolí statický, semistatický či průtokový systém a dbá se na dodržení kritérií kvality.

Ryby se exponují zkoušené látce, jak je popsáno dále:

Trvání: 96 hodin

Počet jedinců: Nejméně 7 na každou koncentraci.

Nádrže: Vhodný objem vzhledem k doporučenému počtu ryb (obsádce)

Počet ryb: Jako největší množství ryb se ve statickém a semistatickém uspořádání doporučuje 1,0 g.l^-1, v průtokovém uspořádání je možné množství větší.

Koncentrace při zkoušce: Nejméně 5 různých koncentrací, které jsou odstupňovány činitelem nepřevyšujícím 2,2 a které pokrývají rozsah 0 % až 100 % mortality.

Voda: Viz 1. 6. 1. 2.

Osvětlení: 12 až 16 hodin světla denně.

Teplota: Podle druhu ryb (příloha 2), kolísající v mezích ± 1 °C při každé jednotlivé zkoušce.

Koncentrace rozpuštěného kyslíku: Ne nižší než 60 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem při dané teplotě.

Krmení: Žádné.

Ryby se kontrolují po prvních 2 - 4 hodinách a dále nejméně každých 24 hodin. Ryby se považují za mrtvé, jestliže při dotyku ocasní ploutve nedochází k žádné reakci a nejsou-li patrné žádné dýchací pohyby. Mrtvé ryby je třeba odstranit ihned jakmile se zpozorují, a je třeba o tom učinit záznam.

Zaznamenávají se všechny zjevné abnormality (např. ztráta rovnováhy, změny v plavání, v dýchací funkci, v pigmentaci atd.).

Měření pH, obsahu rozpuštěného kyslíku a teploty je nutné provádět denně.

Limitní zkouška

S využitím postupů popsaných v této metodice se může provést limitní zkouška při koncentraci 100 mg.l^-1 za účelem prokázání skutečnosti, že LC50 je vyšší než tato koncentrace.

Jestliže je povaha zkoušené látky taková, že nelze ve vodě dosáhnout koncentrace 100 mg.l^-1, měla by být provedena limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1. 6. 1. 1).

Limitní zkouška by měla být prováděna na 7 až 10 rybách a při stejném počtu ryb v kontrolách. (Podle binomické teorie použití 10 ryb s nulovým úhynem znamená 99,9 % pravděpodobnost, že LC50 je větší než 100 mg.l^-1. Žádný úhyn ve zkouškách na 7, 8 nebo 9 rybách znamená nejméně 99 % pravděpodobnost, že LC50 je větší než koncentrace použitá v limitní zkoušce.

Jestliže dojde k úhynům, musí se provést úplné zkoušení. Jsou-li pozorovány subletální účinky, musí být zaznamenány.

Na pravděpodobnostní lognormální papír se pro každou doporučenou a skutečně prověřovanou délku expozice (24, 48, 72 a 96 hodin) vynese úhyn proti koncentraci.

Pokud je to možné, mělo by se pro každou délku expozice stanovit LC50 a hranice spolehlivosti (p = 0,05). Tyto hodnoty se zaokrouhlí na jedno, případně dvě desetinná místa.

V případech, kdy je úhel stoupání křivky závislosti procenta úhynů na koncentraci látky příliš strmý a hodnoty LC50 nelze vypočítat, stačí grafický odhad těchto hodnot.

Když dvě po sobě jdoucí koncentrace odlišené činitelem 2,2 vyvolávají úhyn 0 a 100 % je zřejmé, že LC50 se nachází mezi těmito hodnotami.

Pokud není možné udržet stabilitu nebo homogenitu studované látky, je třeba to zmínit ve zprávě z experimentu a interpretace výsledků by měla být opatrná.

Pokud je to možné, obsahuje závěrečná zpráva následující informace:

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council, C(81) 30 final and updates.

(2) AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio- Static and Flow Through methods - NFT 90-303 June 1985.

(3) AFNOR Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri - Static and Flow Through methods - NFT 90-305 June 1985.

(4) ISO 7346/1, /2 a /3 - Water Quality - Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton - Buchanan - Teleostei, Cypridinae). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.

(5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien für Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden - Part II 1974.

(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L(15).

(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.

(8) NEN 6506 - Water - Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata.

(9) Environmental Protection Agency. Methods for the Acute Toxicity Tests with Fish, Macroinvertebrates and Amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms. Ecological Research Series EPA - 660 - 75 - 009, 1975.

(10) Enviromental Protection Agency,. January, Environmental Monitoring and Support Laboratory, Office of Research and Development. EPA - 600/4 - 78 - 012, 1978.

(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979.

(12) Standard methods for the Examination of Water and Wastewater. 14th edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.

(13) Commission of the European Communities, Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. CEE Study D. 8368, 22 March 1979.

(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamt zum akuten Fisch - Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. A simplified method for evaluating dose effects experiments. J. Pharm. Exp. Therap., Vol. 96, 1949, s. 99.

(16) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U. K., 1978.

(17) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity, Water Res., 1969, vol. 3, 793 - 821.

(18) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, vol. 4, 3 - 32.

(19) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84.

(20) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.

PŘÍLOHA 1

Upravená voda

Příklad vhodné zřeďovací vody

Všechny chemikálie musí být analytické čistoty.

Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 µS.cm^-1.

Destilační přístroj nesmí obsahovat žádné měděné části.

Základní roztoky:

CaCl2. 2H2O - dihydrát chloridu vápenatého 11, 76 g

Rozpustí se ve vodě a doplní se vodou na 1 litr.

MgSO4.7H2O - heptahydrát síranu hořečnatého 4, 93g

Rozpustí se ve vodě a doplní se vodou na 1 litr.

NaHCO3 - hydrogenuhličitan sodný 2, 59 g

Rozpustí se ve vodě a doplní se vodou na 1 litr.

KCl - chlorid draselný 0, 23 g

Rozpustí se ve vodě a doplní se vodou na 1 litr.

Upravená zřeďovací voda

Smísí se po 25 ml všech čtyř základních roztoků a doplní vodou na 1 litr. Provzdušňuje se tak dlouho, až koncentrace rozpuštěného kyslíku odpovídá koncentraci nasycení vzdušným kyslíkem.

Hodnota pH musí činit 7,8 ± 0,2.

Pokud je třeba, upraví se pH pomocí NaOH (hydroxidem sodným) nebo HCl (kyselinou chlorovodíkovou).

Tato zřeďovací voda se nechá 12 hodin stát bez dalšího provzdušňování.

Úhrn iontů Ca a Mg v tomto roztoku činí 2,5 mmol.l^-1. Poměr iontů Ca: Mg činí 4 : 1 a poměr iontů Na: K činí 10 : 1. Celková alkalita tohoto roztoku činí 0,8 mmol.l^-1.

Odchylná příprava zřeďovací vody nesmí změnit složení ani vlastnosti vody.

PŘÍLOHA 2

Druhy ryb doporučené pro zkoušku

Doporučený druh Doporučený rozsah teplot při zkoušce (°C) Doporučená celková délka ryb (cm)
Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton - Buchanan) Danio pruhované 20 až 24 3,0 ± 0,5
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) 20 až 24 5,0 ± 2,0
Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linne 1758) Kapr 20 až 24 6,0 ± 2,0
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Schlegel 1850) Halančík japonský 20 až 24 3,0 ± 1,0
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters 1859) Živorodka duhová (gupka) 20 až 24 3,0 ± 1,0
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Linne 1758) Slunečnice modrá 20 až 24 5,0 ± 2,0
Salmo gairdneri (Teleostei, Salmonidae) (Richardson 1836) Pstruh (americký duhový) 13 až 17 6,0 ± 2,0
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae) (Linne 1758) Jelec jesen 20 až 24 6,0 ± 2,0

Získávání

Výše uvedené druhy ryb lze snadno chovat a/nebo jsou po celý rok lehce dostupné. Dají se chovat v zařízeních pro chov ryb nebo v laboratoři za podmínek kontroly nemocí a parazitů, takže jsou zdravé a známého původu. Tyto druhy ryb lze získat v mnoha částech světa.

PŘÍLOHA 3

Příklad křivky závislosti mortality na koncentraci

Příklad stanovení LC50 na pravděpodobnostním papíře

[image omitted]

II AKUTNÍ TOXICITA PRO DAFNIE

Účelem této zkoušky je stanovit střední účinnou koncentraci zkoušené látky pro imobilizaci (EC50) dafnií ve sladkovodním prostředí. Před začátkem experimentu je třeba mít v co nejúplnější míře k dispozici údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi páry, o chemické stabilitě, o disociační kontantě a o biologické rozložitelnosti zkoušené látky.

Jak při plánování, tak i při interpretaci výsledků zkoušek je třeba brát v úvahu další údaje, jako např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, druh a procentuální podíl významných nečistot, přítomnost a množství přídavných látek, jakož i rozdělovací koeficient n-oktanol/voda.

Požadavek předpisů na stanovení LC50 pro dafnie se naplňuje stanovením EC50, jak je popsáno v této zkušební metodě.

Ve smyslu této zkušební metody se rozumí akutní toxicitou imobilizace dafnií střední efektivní (účinnou) koncentrací (EC50). Je to taková koncentrace (vztaženo na výchozí koncentraci), která imobilizuje 50 % dafnií zkušební skupiny během doby působení (doby expozice).

Neschopnost plavání - imobilizace

Za neschopné plavání se považují ty dafnie, které po lehkém pohybu experimentální nádobou nevykazují během 15 sekund žádné plavací pohyby.

Veškeré koncentrace zkoušené látky se vyjadřují jako hmotnost na objem (mg.l^-1) nebo hmotnost na hmotnost (mg.kg^-1).

Aby se prokázalo, že se reakce zkušebních dafnií za experimentálních podmínek v laboratoři podstatně nezměnila je možné provést kontrolní zkoušku s referenční látkou.

Referenční látky nejsou pro tuto zkoušku stanoveny.

Souhrn výsledků okružního testu laboratoří EHS s použitím 4 různých látek je uveden v příloze 2.

Aby se prokázalo, že EC50 je vyšší než 100 mg.l^-1, může se provést limitní zkouška.

Dafnie se vystaví na 48 hodin účinku zkoušené látky přidané v různých koncentracích do vody. Použije-li se doba kratší, zdůvodní se ve zprávě.

Za jinak stejných experimentálních podmínek a v odpovídajícím rozmezí zkoušených koncentrací působí různé koncentrace dané zkoušené látky na schopnost plavání dafnií rozdílně. Při různých koncentracích se pak po uplynutí zkušební doby objeví vždy určité procentuální podíly dafnií neschopných plavání. Koncentrace způsobující neschopnost plavání u 0 % resp. 100 % se získají přímo pozorováním, zatímco hodnota EC50 pro 48 hodin se získá, pokud je to možné, výpočtem.

Při této metodě se používá statický postup. Experimentální roztoky se tedy během doby expozice neobnovují.

Kritéria kvality se vztahují na limitní i úplnou zkoušku.

Imobilizace v kontrolních skupinách nesmí přesáhnout 10 % na konci zkoušky.

Dafnie v kontrolních skupinách nesmí být zachyceny na povrchu vody.

Je žádoucí, aby koncentrace rozpuštěného kyslíku ve zkušebních nádobách zůstala vyšší než 3 mg.l^-1 po celou dobu zkoušky. Za žádných okolností nesmí poklesnout pod 2 mg.l^-1.

Koncentrace zkoušených látek by se měla udržet v rozmezí 80 % původních koncentrací po celou dobu trvání zkoušky.

U látek, které se lehce rozpouštějí ve zkušebním médiu a dávají stabilní roztoky (netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují či se neadsorbují), se počáteční koncentrace může pokládat za ekvivalentní nominální koncentrací. To, že se koncentrace udržela na určité úrovni po celou dobu zkoušky a že kritéria kvality byla dodržena musí být dokladováno.

Pro látky, které jsou:

(i) slabě rozpustné ve zkušebním médiu, nebo

(ii) schopné vytvářet stabilní emulze nebo disperze, nebo

(iii) nestabilní vodné roztoky,

musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená na začátku zkoušky. Koncentrace musí být stanovována po určitém období ustálení, ale před vnesením dafnií.

Ve všech případech se musí provádět další měření koncentrace během zkoušky za účelem stanovení aktuální expoziční koncentrace a kontroly dodržení kritérií kvality.

pH by se nemělo změnit o více než 1 jednotku.

Základní roztoky v požadovaných koncentracích se připraví rozpuštěním zkoušené látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1. 6. 1. 2.

Zvolené zkoušené koncentrace se připraví zředěním základního roztoku. Když se zkoušejí vysoké koncentrace, látka se může rozpustit přímo ve vodě.

Látky by měly být zkoušeny až do hranice jejich rozpustnosti. U některých látek (např. s nízkou rozpustností ve vodě, nebo vysokým Pow , nebo spíše tvořících stabilní disperze než pravé roztoky ve vodě) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší než je hranice rozpustnosti, abychom si zajistili, že bude dosažena maximální rozpustná/stabilní koncentrace. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícím okysličení vody, atd).

Pro přípravu základních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě se mohou použít ultrazvuková dispergace, organická rozpouštědla či emulgační látky. Když jsou použity pomocné látky měly by všechny zkoušené vzorky a koncentrace, včetně kontrol obsahovat těchto látek stejné množství. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném případě by neměla přesáhnout 100 mg.l^-1 zkoušeného média.

Zkouška by se měla provádět bez korekcí pH. Dochází-li k výrazné změně pH, doporučuje se provést znovu zkoušku s korekcí pH a výsledky zaznamenat. V těchto případech by měla být hodnota pH základního roztoku přizpůsobena pH rozpouštědla (vody), pokud neexistují specifické důvody tak neučinit. Přednost se dává použití HCl a NaOH. Přizpůsobení pH nesmí ovlivnit významně koncentraci zkoušené látky v základním roztoku. Vznik chemické reakce nebo fyzikální precipitace ve zkušebním médiu jako následek přizpůsobení pH se musí zaznamenat.

Pro tuto zkoušku je možné používat každou vodu vhodnou ke kultivaci dafnií, ať je to přírodní nebo upravená voda (viz příloha 1, literatura (2): ISO 6341).

Aby nebylo nutné aklimatizovat dafnie na experimentální podmínky, doporučuje se pro kultivaci používat stejnou vodu jako pro zkoušku.

Používají se obvyklé přístroje a vybavení experimentálních pracovišť. Části, které přicházejí do styku se zkoušenými roztoky mají být nejlépe celé ze skla:

Přednost se dává druhu Daphnia magna. Povolen je také druh Daphnia pulex. Jedinci musí být na začátku zkoušky mladší než 24 hodin, laboratorně odchovaní, bez zjevných nemocí, známého původu (např. chov - předchozí ošetření, manipulace).

Před vlastní zkouškou je možné provést předběžnou zkoušku. Touto předběžnou zkouškou se zjišťují informace o rozsahu koncentrací, které je možné použít ve vlastní zkoušce.

Mimo zkoušky s různými koncentracemi zkoušené látky je třeba provést kontrolní zkoušku bez zkoušené látky a kontrolní zkoušku s nosičem, pokud se nějaký při zkoušení používá.

Dafnie se exponují zkoušené látce, jak je popsáno dále:

Doba:

Nejlépe 48 hodin.

Počet jedinců:

Nejméně 20 na každou koncentraci, nejlépe rozděleně ve 4 skupinách po 5 dafniích nebo ve 2 skupinách po 10 dafniích.

Množství média:

Nejméně 2 ml zkušebního roztoku na 1 dafnii.

Koncentrace při zkoušce:

Zkušební roztok je třeba připravit bezprostředně před nasazením dafnií, pokud možno jen s vodou jako jediným rozpouštědlem. Koncentrace se připraví jako geometrická řada s činitelem nepřevyšujícím 2,2. Spolu s kontrolní zkouškou je třeba použít koncentrace, které dostačují k vyvolání 0 % a 100 % neschopnosti plavání, jakož i řadu koncentrací mezi těmito hodnotami, umožňující výpočet hodnoty EC50 pro 48 hodin.

Voda: Viz 1. 6. 1. 2.

Světlo: Žádoucí je cyklus světla a tmy.

Teplota: Teplota musí být v rozmezí od 18 °C do 22 °C. Pro každou jednotlivou zkoušku má však zůstat konstantní v mezích ± 1 °C.

Provzdušňování: Zkušební roztoky je třeba provzdušňovat jen lehce. Nesmí být provzdušňovány probubláváním.

Krmení: Žádné.

Na konci zkoušky je třeba stanovit pH a obsah rozpuštěného kyslíku pro kontrolní zkoušky a pro každou koncentraci. Hodnota pH zkušebních roztoků se nesmí změnit.

Těkavé sloučeniny je třeba zkoušet v uzavřených nádobách naplněných po okraj, dostatečně velkých, aby se vyloučil nedostatek kyslíku.

Dafnie se pozorují nejpozději po 24 hodinách a znovu po 48 hodinách expoziční doby.

Limitní zkouška

S využitím postupů popsaných v této metodice se může provádět limitní zkouška při 100 mg.l^-1 za účelem prokázání faktu, že EC50 je vyšší než tato koncentrace.

Jestliže je povaha zkoušené látky taková, že nelze dosáhnout ve vodě koncentrace 100 mg.l^-1, měla by být provedena limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) v použitém médiu (viz také bod 1. 6. 1. 1).

Limitní zkouška by měla být prováděna na 20 dafniích, rozdělených do 4 skupin, se stejným počtem v kontrolní skupině. Jestliže dojde k imobilizaci, musí se provést úplné zkoušení.

Neschopnost plavání pro každou koncentraci po 24 a 48 hodinách expoziční doby se vynese na papír s pravděpodobnostním rastrem proti koncentraci. Body se propojí přímkou. Odečte se koncentrace, která odpovídá 50 %-nímu účinku.

Pro každou dobu pozorování se stanoví standardními metodami, pokud to dovolují získané údaje, EC50 a rozsah její spolehlivosti (P = 0,05); výsledky se zaokrouhlují na jedno nebo nejvýše na dvě významná místa ( příklad zaokrouhlování na dvě místa: 170 pro 173,5; 0,13 pro 0,127; 1,2 pro 1,21)

Pokud je průběh křivky závislosti účinku na koncentraci pro výpočet EC50 příliš strmý, stačí grafický odhad této hodnoty.

Vyvolávají-li dvě po sobě následující koncentrace, které se liší o činitele 2,2, neschopnost plavání 0 % a 100 %, pak je to postačujícím průkazem toho, že EC50 leží v této oblasti.

Pokud se pozoruje, že není možné zachovat stabilitu nebo homogenitu zkoušené látky, je to třeba uvést ve zprávě z experimentu a příslušným způsobem to zohlednit při interpretaci výsledků.

Závěrečná zpráva má, je-li to možné, obsahovat:

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 202. Decision of the Council, C (81) 30 final.

(2) International Standard ISO, Water Quality - Determination of inhibition of mobility od Daphnia magna Straus, ISO 6341 - 1989.

(3) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera - crustacea ) NFT 90 301(January 1983).

(4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamt zum akuten Fisch - Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) a (L 11).

(6) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U. K., 1978.

(7) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. A simplified method for evaluating dose effects experiments. J. Pharm. Exp. Therap., Vol. 96, 1949, s. 99.

(8) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity, Water Res., 1969, vol. 3, 793 - 821.

(9) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, vol. 4, 3 - 32.

(10) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84

(11) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.

PŘÍLOHA 1

Upravená voda

Příklad vhodné zřeďovací vody (podle ISO 6341)

Všechny chemikálie musí být analytické čistoty.

Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 µS.cm^-1.

Destilační přístroj nesmí obsahovat žádné měděné části.

Základní roztoky:

CaCl2.2H2O - dihydrát chloridu vápenatého Rozpustí se ve vodě a doplní se vodou na 1 litr. 11, 76 g
MgSO4.7H2O - heptahydrát síranu hořečnatého Rozpustí se ve vodě a doplní se vodou na 1 litr. 4, 93g
NaHCO3 - hydrogenuhličitan sodný Rozpustí se ve vodě a doplní se vodou na 1 litr. 2, 59 g
KCl - chlorid draselný Rozpustí se ve vodě a doplní se vodou na 1 litr. 0, 23 g

Upravená zřeďovací voda

Smísí se po 25 ml všech čtyř základních roztoků a doplní se vodou na 1 litr. Provzdušňuje se tak dlouho, až koncentrace rozpuštěného kyslíku odpovídá koncentraci nasycení vzdušným kyslíkem.

Hodnota pH musí činit 7,8 ± 0,2.

Pokud je třeba, upraví se pH pomocí NaOH (hydroxidem sodným) nebo HCl (kyselinou chlorovodíkovou).

Tato zřeďovací voda se nechá 12 hodin stát bez dalšího provzdušňování.

Úhrn iontů Ca a Mg v tomto roztoku činí 2,5 mmol.l^-1. Poměr iontů Ca: Mg činí 4 : 1 a poměr iontů Na: K činí 10 : 1. Celková alkalita tohoto roztoku činí 0,8 mmol.l^-1.

Odchylná příprava zřeďovací vody nesmí změnit složení ani vlastnosti vody.

PŘÍLOHA 2

Souhrn výsledků EEC kruhového testu prováděného v roce 1978 (2).

Upozornění: účelem tohoto kruhového testu bylo stanovení EC50 24 hod.

Použité látky:

1) Dichroman draselný

2) Kyselina tetrapropylbenzensulfonová

3) Kyselina tetrapropylbenzensulfonová, sodná sůl

4) Kyselina trichloro-2, 4, 5 - fenoxyoctová, draselná sůl

Látka Počet účastnících se laboratoří Počet výsledků EC50 24 hod. mg.l-1
1 46 129 1,5
2 36 108 27
3 31 84 27
4 32 72 770

PŘÍLOHA 3

Příklad závislosti procenta imobilizace dafnií na koncentraci zkoušené látky

Příklad stanovení EC50 s použitím log-probitového papíru

[image omitted]

III ZKOUŠKA INHIBICE RŮSTU ŘAS

Cílem zkoušky je určení vlivu látky na růst jednobuněčných zelených řas. Relativně krátkodobé pokusy (72 hodin) mohou být použity na zhodnocení účinků na několik generací řas. Tato metoda může být upravena pro použití na několika druzích řas, přičemž protokol o zkoušce musí obsahovat popis metodiky.

Metoda je vhodná zejména pro stabilní látky rozpustné za podmínek zkoušky ve vodě.

Metoda je použitelná pro látky, které přimo neinterferují s měřením růstu řas. Pokud je to možné, je žádoucí mít ještě před začátkem testu informace o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, o chemické stabilitě, o disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti odbouratelnosti látky

Jak při plánování zkoušky, tak při interpretaci výsledků by měly být brány v úvahu další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty látky, podstata a procento znečištění látky, přítomnost a množství aditiv, rozdělovací koeficient n-oktanol/voda).

Hustota buněk: počet buněk na 1 ml.

Růst: zvyšování hustoty buněk během doby trvání zkoušky.

Rychlost růstu: přírůstek hustoty buněk za jednotku času.

EC50: koncentrace zkoušené látky, která inhibuje růst buněk nebo snižuje růstovou rychlost o 50 % ve srovnání s kontrolou.

NOEC (no observed effect concentration): je nejvyšší zkoumaná koncentrace, při které nedochází k žádnému statisticky zjistitelnému snížení růstu nebo růstové rychlosti ve srovnání s kontrolou.

Referenční látka může být použita jako prostředek na ověření faktu, že za laboratorních podmínek zkoušky se citlivost zkušebních organizmů významně nezměnila.

Použití referenční látky je nutné uvést do protokolu o zkoušce. Jako referenční látka může být použit dichroman draselný, ale jeho barva může ovlivnit kvalitu a intenzitu světla dostupného buňkám a také spektrofotometrická měření. Dichroman draselný byl použit v mezinárodních mezilaboratorních zkouškách (viz.(3) a příloha 2).

Za účelem prokázání, že EC50 je vyšší než 100 mg.l^-1 je možné provést limitní zkoušku při této koncentraci.

Exponencielně rostoucí kultury vybraných zelených řas jsou vystaveny účinku různých koncentrací zkoušené látky za definovaných podmínek.

Zkoušené roztoky se inkubují 72 hodin, během nichž se měří hustota buněk v každém roztoku přinejmenším každých 24 hodin. Je stanovována inhibice růstu ve vztahu ke kontrolní kultuře.

Kritéria kvality se vztahují na limitní zkoušku i na úplnou zkoušku.

Hustota buněk v kontrolních kulturách by se měla zvýšit přinejmenším šestnáctkrát za 3 dny.

Koncentrace zkoušených látek by se měla udržet v rozmezí 80 % původní koncentrace po celou dobu trvání zkoušky.

U látek, které se lehce rozpouštějí ve zkušebním médiu a dávají stabilní roztoky (netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují či adsorbují), se počáteční koncentrace může pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. To, že se koncentrace udržela na určité úrovni po celou dobu zkoušky a že kritéria kvality byla dodržena, musí být dokladováno.

Pro látky, které jsou:

(i) slabě rozpustné ve zkušebním médiu, nebo

(ii) schopné vytvářet stabilní emulze nebo disperze, nebo

(iii) nestabilní vodné roztoky,

musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená na začátku zkoušky. Koncentrace musí být stanovována po jejím ustálení.

Ve všech případech se musí provádět další měření koncentrace během zkoušky za účelem stanovení aktuální expoziční koncentrace a kontroly dodržení kritérií kvality.

Je známo, že podstatná část zkoušené látky se může během zkoušky zabudovat do biomasy řas. Proto by se za účelem prokázání dodržení kritérií kvality mělo brát v úvahu jak množství látky inkorporované do biomasy řas, tak látka v roztoku (nebo, když to není technicky možné změřit, ve vodním sloupci). Protože však stanovení koncentrace látky v biomase řas může představovat technické obtíže, dodržení kritérií kvality může být prokázáno změřením nejvyšší koncentrace látky ve zkušební nádobě bez řas a stanovením koncentrace v roztoku (nebo, jestliže to není technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku a na konci zkoušky.

Základní roztoky požadované síly jsou připravovány rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo vodě podle odstavce 1. 6. 1. 2.

Zvolené koncentrace jsou připravovány přidáním odpovídajícího množství látky k předkulturám řas (viz příloha 1).

Látky by měly být zkoušeny až do hranice jejich rozpustnosti. Abychom si zajistili, že bude dosažena maximální rozpustná/stabilní koncentrace je možné u některých látek (např. s nízkou rozpustností ve vodě, nebo vysokým Pow, nebo spíše tvořících stabilní disperze než pravé roztoky ve vodě) provést zkoušku při koncentraci vyšší než je hranice rozpustnosti,. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícím okysličení vody, atd).

Pro přípravu základních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě se mohou použít ultrazvuková dispergace, organická rozpouštědla či emulgační látky. Když jsou použity pomocné látky měly by všechny zkoušené vzorky a koncentrace, včetně kontrol obsahovat těchto látek stejné množství. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném případě by neměla přesáhnout 100 mg.l^-1 zkoušeného média.

Zkouška by se měla provádět bez korekcí pH. Dochází-li k výrazné změně pH, doporučuje se provést znovu zkoušku s korekcí pH a výsledky zaznamenat. V těchto případech by měla být hodnota pH základního roztoku přizpůsobena pH rozpouštědla (vody), pokud neexistují specifické důvody tak neučinit. Přednost se dává použití HCl a NaOH. Přizpůsobení pH nesmí významně ovlivnit koncentraci zkoušené látky v základním roztoku. Vznik chemické reakce nebo fyzikální precipitace ve zkušebním médiu jako následek přizpůsobení pH se musí zaznamenat.

Voda by měla být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 µS.cm^-1.

Destilační aparát nesmí obsahovat měděné části.

Doporučováno je následující médium:

Připraví se čtyři zásobní roztoky dle následující tabulky. Tyto roztoky se sterilizují membránovou filtrací nebo autoklávováním a skladují se v temnu při 4 °C. Zásobní roztok č. 4 by se měl sterilizovat pouze membránovou filtrací. Ředěním těchto roztoků se získají konečné živné koncentrace zkušebních roztoků.

Živiny Koncentrace. základních roztoků Konečné koncentrace zkušebních roztoků
Zásobní roztok č. 1: makroživiny
NH4Cl 1,5 g.l-1 15 mg.l-1
MgCl2.6H2O 1,2 g.l-1 12 mg.l-1
CaCl2.2H2O 1,8 g.l-1 18 mg.l-1
MgSO4.7H2O 1,5 g.l-1 15 mg.l-1
KH2PO4 0,16 g.l-1 1,6 mg.l-1
Zásobní roztok č. 2: Fe - EDTA
FeCl3.6H2O 80 mg.l-1 0,08 mg.l-1
Na2EDTA.2H2O 100 mg.l-1 0,1 mg.l-1
Zásobní roztok č. 3: stopové prvky
H3BO3 185 mg.l-1 0,185 mg.l-1
MnCl2.4H2O 415 mg.l-1 0,415 mg.l-1
ZnCl2 3 mg.l-1 3.10-3mg.l-1
CoCl2.6H2O 1,5 mg.l-1 1,5.10-3mg.l-1
CuCl2.2H2O 0,01 mg.l-1 1.10-5 mg.l-1
Na2MoO4.2H2O 7 mg.l-1 7.10-3mg.l-1
Zásobní roztok č. 4: NaHCO3
NaHCO3 50 g.l-1 50 mg.l-1

Po provzdušnění by mělo mít živné médium hodnotu pH přibližně 8.

Při průměrných hladinách zkoušených roztoků se doporučuje použít světelnou intenzitu v rozmezí 60 - 120 µE.m^-2. s^-1 (35 - 70.10^18 fotonů . m^-2.s^-1) při měření vhodným zařízením v rozsahu 400 - 700 nm. Při měření intenzity luxmetry je vyhovující oblast 6000 - 10 000 lx. Této světelné intenzity lze dosáhnout umístěním čtyř až sedmi 30 W zářivek univerzálního bílého typu (barevná teplota přibližně 4 300 K) ve vzdálenosti 0,35 m od kultury řas.

Předpokládá se, že použité druhy zelených řas jsou rychle rostoucí, vhodné pro kultivaci a zkoušení. Doporučovány jsou zejména následující druhy:

Poznámka:

ATCC = American Type Culture Collection (U.S.A)

CCAP = Culture Centre of Algae and Protozoa (U.K.)

SAG = Collection of algal culture (Göttingen, F.R.G.)

Použití jiného druhu řas musí být uvedeno ve zprávě.

Koncentrační rozmezí, ve kterém je účinky látek nejlépe zjišťovat, se určí orientační zkouškou.

Dva způsoby měření růstu (biomasa a rychlost růstu) mohou poskytovat zcela rozdílné míry inhibice růstu; v orientační vyhledávací zkoušce se použijí oba, aby mohlo být umožněno se ubezpečit, že geometrický růst koncentrace dovolí odhadnout jak EbC50 tak Er C50.

Počáteční hustota buněk

Doporučuje se, aby počáteční hustota buněk řasy Selenastrum capricornutum a řasy Scenedesmus subspicatus ve zkušebních roztocích byla přibližně 10^4 buněk.ml^-1. Použije-li se jiný druh řasy, měla by být počáteční hustota biomasy srovnatelná.

Koncentrace zkoušené látky

Do zkoušky se nasazuje nejméně pět různých koncentrací zkoušené látky v geometrické řadě s koeficientem nepřevyšujícím 2,2. Nejnižší použitá koncentrace by neměla vykazovat žádný pozorovatelný účinek na růst řas. Nejvyšší zkoušená koncentrace by měla omezit růst ve srovnání s kontrolní zkouškou nejméně o 50 %, nejlépe když zastaví růst zcela.

Opakování a kontroly

Plán zkoušky musí zahrnovat tři opakování každé zkušební koncentrace, tři kontroly a je-li použita pomocná látka též tři kontroly s přídavkem této látky. Je-li pro to důvod, může být plán zkoušky upraven tak, že se použije více koncentračních úrovní a sníží se počet opakování zkoušky v každé nasazené koncentraci.

Provedení zkoušky

Zkušební roztoky o určité koncentraci zkoušené látky se připraví smícháním naředěného množství zásobního roztoku zkoušené látky s roztokem živin, inokula a vody (viz příloha).

Kultivační baňky se protřepají a umístí se do kultivačního zařízení. Řasové buňky se udržují v suspenzi třepáním, mícháním nebo probubláváním vzduchem, čímž se zlepšuje výměna plynů a zmenšují se změny pH zkušebních roztoků. Kultury se inkubují při teplotě 21 - 25 °C udržované s přesností ± 2 °C.

Hustota buněk se v každé baňce odečítá nejméně po 24, 48 a 72 h po zahájení zkoušky. Používá-li se k měření hustoty buněk jiné metody než je jejich přímé počítání použije se jako srovnávací vzorek filtrovaný řasový roztok obsahující příslušnou koncentraci zkoušené chemikálie.

pH se měří na začátku zkoušky a po 72 hodinách.

Hodnota pH by se neměla během zkoušky změnit víc jak o 1,5 jednotky.

Zkoušení těkavých látek

V současné době neexistuje obecně přijatelný způsob zkoušení těkavých látek. Je-li známo, že má látka tendenci se snadno vypařovat, mohou být použity uzavřené kultivační nádoby se zvětšeným parním prostorem. Při stanovování objemu parního prostoru kultivačních baněk se musí zohlednit potřeba odvodu CO2 ze zkoušeného roztoku. Byla navržena řada variant této metody (4).

Měla by být vyvinuta snaha o stanovení množství zkoušené látky, která v roztoku zůstala. V každém případě by měly být výsledky zkoušení těkavých látek v uzavřených systémech mimořádně opatrně.

Limitní zkouška

S využitím postupů popsaných v této metodice se může provádět limitní zkouška při 100 mg.l^-1 za účelem prokázání skutečnosti, že EC50 je vyšší než tato koncentrace.

Jestliže je povaha zkoušené látky taková, že nelze ve vodě dosáhnout koncentrace 100 mg.l^-1, měla by být provedena limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1. 6. 1. 1).

Limitní zkouška by měla být prováděna minimálně ve třech vzorcích se stejným počtem kontrol. Limitní zkouškou by měly být stanoveny obě měřítka růstu (biomasa a rychlost růstu).

V případě, že se limitní zkouškou prokáže pokles růstu biomasy nebo rychlosti růstu o 25 % a více ve srovnání s kontrolními vzorky, je nutné provést úplné zkoušení.

Naměřené hustoty buněk ve zkušební kultuře a v kontrolách jsou spolu s příslušnými koncentracemi a sledovanými parametry zapisovány do tabulek. Sestrojí se růstová křivka pro každou zkoušenou koncentraci a kontrolu v podobě grafu střední hustoty buněk v závislosti na čase.

Vztah mezi koncentrací a účinkem je stanovován dvěma následujícími postupy. Některé látky mohou při nízkých koncentracích stimulovat růst. V úvahu by měla být brána jenom data indikující inhibici mezi 0 a 100 %.

Plocha mezi růstovou křivkou a vodorovnou čarou N = No se vypočítá podle následující rovnice:

A= N1- N2 2 . t1+ N1+ N2- 2No2 .t2- t1+…+Nn-1+ Nn- 2N02. (tn- tn-1)

kde je

A - plocha

No - počet buněk.ml^-1 v čase to (na počátku zkoušky)

N1 - změřená hustota buněk v čase t1

Nn - změřená hustota buněk v čase tn

t1 - doba prvního měření od počátku zkoušky

tn - doba n-tého měření od počátku zkoušky

n - počet měření od počátku zkoušky

Inhibice růstu v % (IA) pro každou koncentraci zkoušené látky se vypočítá podle rovnice:

Ia= Ac- AtAc . 100

kde

Ac = plocha mezi růstovou křivkou kontrolní zkoušky a horizontální linií N = N0,

At = plocha mezi růstovou křivkou při koncentraci t a horizontální linií N = N0.

Hodnoty Ia se nanesou na semilogaritmický nebo na semilogaritmicko-probitový papír proti jednotlivým koncentracím. Po vynesení bodů na papír se tyto spojí od oka nebo vypočtenou regresní přímkou.

Hodnota EC50 se odečítá na průsečíku regresní čáry a rovnoběžky s osou x v bodě Ia = 50 %. Abychom tuto hodnotu označili jednoznačně podle použité metody vyhodnocení doporučuje se použít symbol EbC50. Důležité je, že hodnota EbC50 je spojena s označením příslušné exposiční doby tj. EbC50 (0-72h).

Průměrná specifická rychlost růstu (µ) pro exponenciálně rostoucí kultury se vypočte jako:

μ= 1nNn-1nN0tn - t0

kde t0 je čas počátku zkoušky.

Procento inhibice specifické rychlosti růstu při každé koncentraci zkoušené látky (Iµt) se vypočte podle vzorce:

Iμt= μc- μtμc . 100

kde

µc = průměrná specifická rychlost růstu kontrol,

µt = průměrná specifická rychlost růstu při koncentraci t.

Snížený průměrný růst v % ve srovnání s kontrolní hodnotou, při všech koncentracích zkoušené látky se nanese proti logaritmu koncentrace. Z takto vzniklého grafického znázornění lze odečíst hodnoty EC50. Pro přesné označení bodu EC50, zjištěného touto metodou se doporučuje použít symbol ErC50. Musí se uvést časy pozorování, tzn. hodnoty vztažené k dobám 0 - 72 h se označí symbolem ErC50 (0 - 72 h).

Poznámka: Specifická rychlost růstu je logaritmický výraz, nepatrné změny rychlosti růstu mohou odpovídat velkým změnám biomasy. Hodnoty EbC a ErC jsou proto numericky nesrovnatelné.

Hodnota NOEC se stanoví vhodnou statistickou metodou pro mnohočetné srovnávání vzorků (např. analýza variance a Dunnettův test) s využitím jednotlivých hodnot ploch oblastí pod růstovými křivkami A (viz bod 2. 1) nebo specifických rychlostí růstu µ (viz bod 2. 2).

Ve zprávě je dobré uvést, pokud možno následující údaje:

(1) OECD, Paris 1981, Test Guideline 201

(2) Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag"Hemmung der Zellvermehrung bei der Grünalge Scenedesmus subspicatus", v: Rudolph/Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.

(3) ISO 8692 - Water quality - Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.

(4) S. Galassi and M. Vighi - Chemosphere, 1981, vol. 10, 1123 - 1126.

PŘÍLOHA 1

Příklad postupu pro kultivaci řas

Obecně

Účelem kultivace dále popsaným postupem je získání řasových kultur pro zkoušky toxicity.

Metody použité k tomuto účelu musí zaručit, aby kultury řad nebyly infikovány bakteriemi (ISO 4833).

Za určitých okolností mohou být žádoucí i axenické kultury, avšak základem jsou jednodruhové kultury.

Aby nemohlo dojít ke kontaminaci bakteriemi a jinými řasami, provádějí se všechny pracovní kroky za sterilních podmínek.

Postupy při získání řasových kultur

Příprava živných roztoků (média)

Médium může být připraveno zředěním koncentrovaných základních roztoků živin. K získání pevného média se přidává 0,8 % agaru. Použité médium by mělo být sterilní. Sterilizace autoklávem může vést ke ztrátě NH3.

Kmenová kultura

Kmenové kultury jsou malé kultury řas, které se přenášejí pravidelně do čestvého média. Slouží jako výchozí zkušební materiál. Nejsou-li kultury pravidelně používány, vyočkovávají se na šikmý agar a pak se přenášejí nejméně jednou za dva měsíce do čerstvého média.

Kmenové kultury se pěstují v Erlenmayerových baňkách obsahujících vhodné medium (přibližně objem 100 ml). Jsou-li řasy inkubovány při teplotě 20 °C a stálém osvětlení, musí se přenášet každý týden.

Při přeočkování se přenese sterilní pipetou do baňky s čerstvým mediem takové množství „staré“ kultury, aby výchozí koncentrace činila u rychle rostoucího druhu řas asi 1/100 koncentrace kultury staré.

Rychlost růstu daného druhu řas lze odečíst z růstové křivky. Z této růstové křivky lze odhadnout hustotu, při níž musí být kultura přenesena do čerstvého média. K tomu musí dojít před fází odumírání kultury.

Předkultura

Účelem předkultur je poskytnout dostatečné množství řas potřebných pro naočkování zkušebních kultur. Předkultura se inkubuje za zkušebních podmínek a použije se ještě během exponenciálního růstu, to znamená obvykle po třídenní inkubační lhůtě. Obsahují-li kultury řas deformované nebo abnormální buňky, musí se vyhodit.

PŘÍLOHA 2

ISO 8692 - Kvalita vody - Růstová inhibiční zkouška na sladkovodních řasách Scenedesmus subspicatus uvádí výsledky mezilaboratorních zkoušek dichromanu draselného provedených 16 laboratořemi.

Průměry (mg.l-1) Rozsah (mg.l-1)
ErC50 (0 - 72 hod) 0,84 0,60 - 1,03
EbC50 (0 - 72 hod) 0,53 0,20 - 0,75

IV STANOVENÍ SNADNÉ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI

I OBECNÉ ÚVAHY

I. 1 ÚVOD

Je popsáno šest zkušebních metod, které umožňují vyhledávací posouzení snadné biologické rozložitelnosti chemických látek v aerobním vodním prostředí:

(A) Úbytek rozpuštěného organického uhlíku (DOC)

(B) Modifikovaná vyhledávací zkouška OECD - úbytek DOC

(C) Uvolňování oxidu uhličitého (CO2) (modifikovaná Sturmova zkouška)

(D) Manometrická respirometrie

(E) Zkouška v uzavřených lahvičkách

(F) Zkouška MITI (Ministerstvo zahraničního obchodu a průmyslu - Japonsko)

Obecné a společné úvahy pro všech šest zkoušek jsou uvedeny v části I metody. Specifické body jednotlivých metod jsou uvedeny v částech II až VII. Přílohy obsahují definice, vzorce a orientační poznámky.

Mezilaboratorní srovnávací pokus OECD, provedený v roce 1988, ukázal, že uvedené metody poskytují shodné výsledky. V závislosti na fyzikálním charakteru zkoušené látky však může být v daném případě nejvhodnější určitá konkrétní metoda.

I. 2 VÝBĚR VHODNÉ METODY

Pro volbu nejvhodnější metody jsou nezbytné informace o rozpustnosti, o tenzi par a o adsorpční charakteristice dané chemické látky. Pro výpočet teoretických hodnot a ověření naměřených hodnot parametrů, např. TSK, TCO2 , DOC, TOC, CHSK (viz přílohy 1 a 2) je nutné znát chemickou strukturu nebo vzorec.

Zkoušené chemické látky, jejichž rozpustnost ve vodě činí alespoň 100 mg.l-1, je možné zkoušet všemi metodami za předpokladu, že jsou netěkavé a neadsorbují se. Pro látky málo rozpustné ve vodě, těkavé nebo adsorbovatelné jsou vhodné metody uvedeny v tabulce 1. Způsob, kterým je třeba zacházet s látkami málo rozpustnými ve vodě a těkavými, je popsán v příloze 3. Mírně těkavé látky je možné zkoušet metodou úbytku DOC, pokud ve zkušebních nádobách (které musí být vhodně uzavřeny) existuje dostatečně velký prostor pro plyn. V tomto případě musí být provedena abiotická kontrola pro podchycení případné fyzikální ztráty.

Pro interpretaci získaných výsledků, zejména pokud jsou výsledky nízké nebo marginální, se vyžadují informace o čistotě nebo relativních podílech hlavních složek zkoušeného materiálu.

Pro volbu vhodných koncentrací pro zkoušku mohou být velmi užitečné informace o toxicitě zkoušené chemické látky pro bakterie (příloha 4). Tyto informace mohou mít zásadní význam pro správnou interpretaci nízkých hodnot biologického rozkladu.

Tabulka 1: Použitelnost zkušebních metod

| Zkušební metoda | Analytická metoda | Vhodnost pro látky | | | | málo rozpustné | těkavé | absorbující | | | | --- | --- | --- | --- | --- | | IV - A | DOC | - | - | +/- | | IV - B | DOC | - | - | +/- | | IV - C | Respirometrie: vývin CO2 | + | - | + | | IV - D | Manometrická respirometrie: vývin CO2 | + | +/- | + | | IV - E | Respirometrie: rozpuštěný kyslík | +/- | + | + | | IV - F | Respirometrie: spotřeba kyslíku | + | +/- | + |

I. 3 REFERENČNÍ LÁTKY

Pro ověření postupu se zkoušejí souběžně se studovanou látkou referenční chemické látky, které splňují kritéria snadné biologické rozložitelnosti.

Vhodnými chemickými látkami jsou anilin (čerstvě předestilovaný), octan sodný a benzoan sodný. Tyto referenční chemické látky se uvedenými metodami všechny rozkládají i když se záměrně nepřidá žádné inokulum.

Bylo navrženo hledat referenční chemickou látku, která by byla pohotově rozložitelná, avšak vyžadovala by přidání inokula. Byl navržen hydrogenftalát draselný. O této látce je třeba ještě získat více údajů, než ji bude možné přijmout jako referenční látku.

V respirometrických zkouškách mohou příjem kyslíku ovlivnit látky obsahující dusík v důsledku nitrifikace (viz přílohy 2 a 5).

I. 4 PRINCIP ZKUŠEBNÍCH METOD

Roztok nebo suspenze zkoušené látky v minerálním prostředí se naočkuje a inkubuje v aerobních podmínkách v temnu nebo v difúzním světle. Množství DOC připadající ve zkoušeném roztoku na inokulum je třeba udržovat ve srovnání s DOC připadajícím na zkoušenou látku co nejnižší. Endogenní aktivita inokula se zohlední na základě paralelní slepé zkoušky s inokulem, avšak bez zkoušené látky. Přitom endogenní aktivita buněk v přítomnosti zkoušené látky neodpovídá přesně aktivitě v endogenní kontrolní zkoušce. Za účelem kontroly postupu se provádí souběžně zkouška s referenční látkou.

Obecně řečeno po rozkladu následuje stanovení parametrů jako DOC, tvorba CO2 a příjem kyslíku. Měření se provádí v dostatečně častých intervalech, aby bylo možné identifikovat začátek a konec biologického rozkladu. Měření automatickými respirometry je kontinuální. Někdy se měří doplňkově k jinému parametru DOC, avšak obvykle pouze na začátku a na konci zkoušky. Je rovněž možné použít specifickou chemickou analýzu, kterou se vyhodnotí primární rozklad zkoušené látky nebo se stanoví koncentrace kteréhokoli vzniklého meziproduktu (ve zkoušce MITI povinné).

Zkouška normálně trvá 28 dní. Měření je však možné ukončit před uplynutím 28 dní, tj. jakmile křivka biologického rozkladu dosáhla na základě nejméně tří stanovení fáze vodorovného průběhu. Měření je také možné prodloužit i po 28 dnech, vyplývá-li z křivky, že biologický rozklad začal, avšak že v 28. den nebylo ještě dosaženo vodorovné části křivky.

I. 5 KRITÉRIA KVALITY

I. 5. 1 Reprodukovatelnost

Vzhledem k charakteru biologického rozkladu a směsných populací bakterií používaných jako inokula je nutné provádět stanovení nejméně dvojmo.

Je běžnou zkušeností, že čím vyšší je koncentrace mikroorganizmů přidaných na počátku do zkušebního média, tím menší jsou rozdíly mezi replikovanými měřeními. Okružní zkoušky rovněž ukázaly, že mezi výsledky získanými různými laboratořemi mohou být velké rozdíly, avšak u snadno biologicky rozložitelných sloučenin se obvykle dosahuje dobré shody.

I. 5. 2 Platnost zkoušky

Zkouška se považuje za platnou, je-li rozdíl krajních hodnot výsledků replikovaných měření rozkladu zkoušené látky na vodorovné části křivky, buď na konci zkoušky nebo na konci 10-denního okénka, podle toho, která z těchto eventualit přichází v úvahu, menší než 20 %, a dosáhl-li procentuální stupeň rozkladu referenční látky úrovně snadné biologické rozložitelnosti do 14 dní. Není-li splněna kterákoli z těchto podmínek, je nutné měření opakovat. Vzhledem k náročnosti metod neznamenají nízké hodnoty nutně, že studovaná látka není v podmínkách životního prostředí biologicky rozložitelná, ale ukazují, že k zajištění biologického rozkladu je třeba více práce.

Jestliže ve zkoušce toxicity, zahrnující jak studovanou látku, tak referenční chemickou látku, došlo během 14 dnů k méně než 35 % rozkladu (na bázi DOC) nebo k méně než 25 % rozkladu (na bázi TSK nebo TCO2), je možné zkoušené chemické látky považovat za inhibující (viz také přílohu 4. Sérii měření je třeba opakovat, pokud možno s nižší koncentrací studované chemické látky a (nebo) vyšší koncentrací inokula, avšak ne s koncentrací vyšší než 30 mg tuhých látek v litru.

I. 6 VŠEOBECNÉ POSTUPY A PŘÍPRAVY

Obecné podmínky pro zkoušky jsou přehledně uvedeny v tabulce 2. Aparatury a další experimentální podmínky, specifické pro jednotlivé metody, jsou popsány dále v kapitolách pro tyto příslušné metody.

I. 6. 1 Zřeďovací voda

Používá se deionizovaná nebo destilovaná voda, prostá inhibujících koncentrací toxických látek (např. iontů Cu^-). Voda smí obsahovat nejvýše 10 % obsahu organického uhlíku, vneseného zkoušenou látkou. Aby se vyloučily vysoké hodnoty ve slepých pokusech je nutná vysoká čistota vody pro zkoušky. Ke kontaminaci může dojít přítomnými nečistotami ze studované látky a z iontoměnných pryskyřic a rozkladnými látkami z bakterií a řas. Pro každou sérii měření je třeba používat pouze jednu šarži vody, která byla předem překontrolována analýzou DOC. Tato kontrola není nutná u zkoušky v uzavřených lahvičkách, spotřeba kyslíku vodou však musí být nízká.

Tabulka 2: Experimentální podmínky v jednotlivých zkouškách

| Zkouška | Úbytek DOC | Uvolňování CO2 | Manometrická respirometrie | Modifikovaná vyhledávací OECD zkouška | Uzavřené lahvičky | Zkouška MITI (I) | | C 4. - A | C 4. - C | C 4. - D | C 4. - B | C 4. - E | C 4. - F | | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | Koncentrace zkoušené látky: | | | | | | | | mg.l-1 | | | 100 | | 2 - 10 | 100 | | mg DOC.l-1 | 10 - 40 | 10 - 20 | | 10 - 40 | | | | mg ThOD.l-1 | | | 50 - 100 | | 5 - 10 | | | Koncentrace inokula | ≤ 30 mg.-1l SL nebo ≤ 100 ml výtoku.l-1 | 0,5 ml sekund. výtoku.l-1 | ≤ 5 ml výtoku.l-1 | 30 mg.l-1 SL | | | | (buňky.l-1) | | (107 - 108) | | (105) | (104 - 106) | (107 - 108) | | Koncentrace prvku v minerálním médiu (mg.l-1) | | | | | | | | P | 116 | 11,6 | 29 | | | | | N | 1,3 | 0,13 | 1,3 | | | | | Na | 86 | 8,6 | 17,2 | | | | | K | 122 | 12,2 | 36,5 | | | | | Mg | 2,2 | 2,2 | 6,6 | | | | | Ca | 9,9 | 9,9 | 29,7 | | | | | Fe | 0,05 - 0,1 | 0,05 - 0,1 | 0,15 | | | | | pH | 7,4 ± 0,2 | nejlépe 7,0 | | | | | | teplota | 22 ± 2 °C | 25±1 °C | | | | | | DOC = rozpuštěný organický uhlík | | | SL = suspendované látky | | | | | ThOD = teoretická spotřeba kyslíku | | | | | | |

I. 6. 2 Zásobní roztoky minerálních složek

Pro přípravu zkušebních roztoků se připravují zásobní roztoky o vhodných koncentracích minerálních složek. Níže uvedené zásobní roztoky je možné použít (při různých zřeďovacích faktorech) pro metody úbytku DOC, pro modifikovanou vyhledávací metodu OECD, pro metodu uvolňování CO2, pro manometrickou respirometrii a pro uzavřené láhvičky.

Zřeďovací faktory a specifická příprava minerálního media pro zkoušku MITI jsou uvedeny v kapitolách pro jednotlivé zkoušky.

Zásobní roztoky:

Zásobní roztoky se připravují s použitím činidel analytické čistoty.

(a) dihydrogenorthofosforečnan draselný, KH2PO4 8,50 g

monohydrogenorthofosforečnan didraselný, K2 HPO4, 21,75 g

dihydrátmonohydrogenorthofosforečnan disodný Na2HPO 4 .2H2O 33,40 g

chlorid amonný, NH4Cl 0,50 g

Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. pH roztoku musí být 7,4.

(b) chlorid vápenatý bezvodý, CaCl 2 27,50 g

nebo dihydrát chloridu vápenatého, CaCl 2.2H2O 36,40 g

Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

(c) heptahydrát síranu hořečnatého, MgSO4.7H2O 22,50 g

Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

(d) hexahydrát chloridu železitého, FeCl3.6H2O 0,25 g

Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

Poznámka: Aby nebylo nutné připravovat tento roztok bezprostředně před použitím, přidá se jedna kapka koncentrované kyseliny chlorovodíkové nebo 0,4 g disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) na 1 litr.

I. 6. 3 Zásobní roztoky chemických látek

Pokud je rozpustnost vyšší než 1 g.l^-1, rozpustí se například 1 - 10 g (podle potřeby) zkoušené nebo referenční látky v deionizované vodě a doplní se na 1 litr. Jinak se připravují zásobní roztoky v minerálním médiu, nebo se chemická látka přidá přímo do minerálního média. Pokud se týká práce s méně rozpustnými chemickými látkami, viz přílohu 3. Ve zkoušce MITI (metoda IV-F) nelze používat ani rozpouštědla, ani emulgační činidla.

I. 6. 4 Inokula

Inokulum je možné získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod (nechlorovaných), z povrchových vod a půd, nebo jako jejich směsi. Používá-li se aktivovaný kal ve zkoušce úbytku DOC, uvolňování CO2 a manometrické respirometrie, je třeba jej odebírat z čistírny nebo z laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. U inokulí z jiných zdrojů byl zjištěn větší rozptyl výsledků. V modifikované vyhledávací zkoušce OECD a ve zkoušce v uzavřených lahvičkách je třeba zředěnější inokulum bez vloček kalu. Nejvhodnějším zdrojem je voda z druhého stupně čistírny domovních odpadních vod nebo z laboratorní jednotky. Pro zkoušku MITI se inokulum získává ze směsi zdrojů a je popsáno v kapitole o této zkoušce.

I. 6. 4. 1 Inokulum z aktivovaných kalů

Je třeba odebrat čerstvý vzorek aktivovaného kalu z aerační nádrže čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. Je-li třeba, odstraní se hrubé částice filtrací jemným sítem a kal se udržuje v aerobních podmínkách.

Alternativním způsobem je odsazení nebo zcentrifugování (např. při 1 100 g po dobu 10 min.) po odstranění hrubých částic. Voda nad usazeninou se slije. Kal je možno promýt minerálním médiem. Koncentrovaný kal se suspenduje v minerálním médiu na koncentraci 3 - 5 g suspendovaných tuhých látek na litr a provzdušňuje se až do použití.

Kal je třeba odebrat z dobře pracující konvenční čistírny. Je-li nutné kal odebrat z čistírny s vysokým prosazením nebo předpokládá-li se, že obsahuje inhibitory, je třeba jej promýt. Znovu suspendovaný kal se po důkladném promíchání nechá usadit nebo se zcentrifuguje, voda nad usazeninou se slije a promytý kal se opět suspenduje v nové dávce minerálního média. Tento postup se opakuje, až se kal považuje za prostý přebytečného substrátu nebo inhibitoru.

Po dokonalém suspendování nebo z neupravovaného kalu se odebere těsně před použitím vzorek pro stanovení sušiny suspendovaných tuhých látek.

Další alternativou je homogenizace aktivovaného kalu (3 - 5 g suspendovaných látek v litru). Kal se zpracuje v mechanickém mísiči po dobu 2 min. při střední rychlosti. Promíchaný kal se nechá usadit po dobu 30 min nebo v případě potřeby déle a kapalina se slije pro použití jako inokulum v koncentraci 10 ml.l^-1 minerálního média.

I. 6. 4. 2. Jiné zdroje inokula

Inokulum je možné získat z výstupu druhého stupně čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky, pracujících převážně s domovními odpadními vodami. Odebere se čerstvý vzorek a během přepravy se udržuje v aerobních podmínkách. Nechá se po dobu 1 hodiny usadit nebo se zfiltruje přes hrubý filtrační papír a slitá kapalina nebo filtrát se udržuje v aerobních podmínkách až do použití. Tohoto typu inokula je možné použít až 100 ml na 1 litr média. Dalším zdrojem inokula je povrchová voda. V tomto případě se odebere vzorek vhodné povrchové vody, např. říční nebo jezerní, a uchovává se v aerobních podmínkách až do použití. V případě potřeby se inokulum zkoncentruje filtrací nebo zcentrifugováním.

I. 6. 5 Předběžné kondiciování inokula

Inokula je možné předběžně kondicionovat na experimentální podmínky, ale ne předběžně adaptovat na zkoušenou látku. Předběžná kondicionace spočívá v aeraci aktivovaného kalu v minerálním médiu nebo výstupu z druhého stupně čistírny po dobu 5 - 7 dní při teplotě zkoušky. Předběžné kondicionování někdy zlepší přesnost zkušebních metod snížením hodnot ze slepých pokusů. Předběžně kondicionovat inokulum MITI se nepovažuje za nutné.

I. 6. 6 Abiotické kontrolní zkoušky

V případě potřeby se kontroluje možný abiotický rozklad zkoušené látky stanovením úbytku DOC, příjmu kyslíku nebo tvorby oxidu uhličitého ve sterilních kontrolních pokusech bez inokula. Sterilizace se provádí filtrací membránou (0,2 - 0,45 µm) nebo přidáním vhodné toxické látky v příslušné koncentraci. Používá-li se membránové filtrace, odebírají se vzorky asepticky za účelem zachování sterility. Pokud nebyla předem vyloučena adsorpce zkoušené látky, musí zkoušky, kterými se sleduje biologický rozklad podle úbytku DOC, zejména při použití inokula z aktivovaného kalu, zahrnovat abiotický kontrolní pokus, který byl naočkován a intoxikován.

I. 6. 7 Počet nasazených baněk

Počet použitých nádob (nasazených pokusů) v typické zkoušce je uveden v kapitolách pro jednotlivé zkoušky.

Lze používat tyto typy nasazených nádob:

Zkoušená suspenze: obsahuje zkoušenou látku a inokulum

Slepá zkouška s inokulem: obsahuje pouze inokulum

Kontrola postupu: obsahuje referenční látku a inokulum

Abiotická sterilní kontrola: sterilní, obsahuje zkoušenou látku (viz 1.6.6)

Kontrola pro adsorpci: obsahuje zkoušenou látku, inokulum a sterilizační činidlo

Kontrola toxicity: obsahuje zkoušenou látku, referenční látku a inokulum

Stanovení ve zkoušené suspenzi a slepý pokus s inokulem se musí povinně provádět souběžně. Stanovení v ostatních nádobách se doporučuje provádět rovněž souběžně.

To však nemusí být vždy možné. Je třeba zajistit, aby se odebíral dostatečný počet vzorků nebo se prováděl dostatečný počet odečtů pro vyhodnocení procenta úbytku v 10-denním okénku.

I. 7 VÝSLEDKY A JEJICH VYHODNOCENÍ

Při výpočtu Dt , procentního úbytku, se používají střední hodnoty z dvojích měření daného parametru v obou zkušebních nádobách a ze slepého pokusu pro inokulum. Příslušné vzorce jsou uvedeny dále v kapitolách pro jednotlivé zkoušky. Průběh rozkladu se znázorní graficky a označí se 10-denní okénko. Vypočte a uvede se procentní úbytek dosažený na konci 10-denního okénka a hodnota pro vodorovnou část křivky nebo na konci zkoušky podle toho, která z nich je vhodnější.

V respirometrických zkouškách mohou látky obsahující dusík ovlivnit příjem kyslíku v důsledku nitrifikace (viz příloha 2 a 5).

I. 7. 1 Rozklad zjišťovaný na základě stanovení DOC

Za účelem posouzení platnosti zkoušky (viz I.5.2) se musí v každém časovém okamžiku, ve kterém se odebral vzorek, vypočítat odděleně pro každou nádobu obsahující zkoušenou látku, pomocí středních hodnot dvojic měření DOC, procentní rozklad, Dt,. Vypočte se podle rovnice:

Dt= 1- C1- CbtC0- Cbo . 100

kde:

Dt = procento rozkladu v čase t,

Co = střední počáteční koncentrace DOC v naočkovaném kultivačním médiu obsahujícím zkoušenou látku (mg DOC.l^-1),

Ct = střední koncentrace DOC v naočkovaném kultivačním médiu obsahujícím zkoušenou látku v čase t (mg DOC.l^-1),

Cbo = střední počáteční koncentrace DOC ve slepém naočkovaném minerálním médiu (mg DOC.l^-1),

Cbt = střední koncentrace DOC ve slepém naočkovaném minerálním médiu v čase t (mg DOC.l^-1).

Všechny koncentrace se zjišťují experimentálně.

I. 7. 2 Rozklad měřený pomocí specifické analýzy

Je-li možné získat specifické analytické údaje, vypočte se primární biologický rozklad z rovnice:

Dt= (Sb- Sa)Sb . 100

kde:

Dt = procento rozkladu v čase t, obvykle 28 dní,

Sa = zbylé množství zkoušené látky v médiu s inokulem na konci pokusu (mg),

Sb = zbylé množství zkoušené látky ve slepém pokusu s vodou/médiem, do kterých byla přidána pouze zkoušená látka (mg).

I. 7. 3 Abiotický rozklad

Používá-li se abiotická sterilní kontrolní zkouška, vypočte se procentní abiotický rozklad podle rovnice:

% abiotickéhorozkladu=Cs(o)-Cs(t)Cs(o).100

kde:

Cs(o) = koncentrace DOC ve sterilní kontrolní zkoušce v den 0

Cs(t) = koncentrace DOC ve sterilní kontrolní zkoušce v den t

I. 8 PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce má obsahovat, je-li to možné, tyto údaje:

IV. A ZKOUŠKA ÚBYTKU DOC

II. 1 PRINCIP METODY

Změřený objem naočkovaného minerálního média, obsahujícího známou koncentraci zkoušené látky (10 - 40 mg DOC.l^-1 ) jako jmenovitý jediný zdroj organického uhlíku, se provzdušňuje v temnu nebo v difúzním světle při 22 ± 2 °C.

Rozklad se sleduje v častých intervalech během 28-denního období analýzou DOC. Stupeň biologického rozkladu se vypočítá tak, že se koncentrace rozloženého DOC (opravená na koncentraci v kontrolní zkoušce s inokulem) vyjádří jako procento koncentrace přítomné na začátku. Stupeň primárního biologického rozkladu je rovněž možné vypočítat z doplňkové chemické analýzy, provedené na začátku a na konci inkubace.

II. 2 POPIS METODY

II. 2. 1 Aparatura

(a) Erlenmeyerovy baňky, např. od 250 ml do 2 l, podle objemu potřebného pro analýzu DOC.

(b) Třepačka pro umístění Erlenmeyerových baněk, buď s automatickou regulací teploty nebo používaná v místnosti s konstantní teplotou, a s dostatečným výkonem pro udržení aerobních podmínek ve všech baňkách.

(c) Filtrační aparatura s vhodnými membránami.

(d) Analyzátor DOC.

(e) Přístroj pro stanovení rozpuštěného kyslíku.

(f) Odstředivka.

II. 2. 2 Příprava minerálního média

Příprava zásobních roztoků viz I. 6. 2.

Smísí se 10 ml roztoku (a) s 800 ml zřeďovací vody, přidá se 1 ml roztoků (b) až (d) a doplní se na 1 l zřeďovací vodou.

II. 2. 3 Příprava a předběžná kondicionace inokula

Inokulum je možné získat z řady zdrojů: aktivovaný kal; splaškové odpadní vody; povrchové vody; půda nebo směs z uvedených typů.

Viz I. 6. 4, I. 6. 4. 1, I. 6. 4. 2 a I. 6. 5.

II. 2. 4 Příprava baněk

Je například možné naplnit podíly po 800 ml minerálního média do 2 l Erlenmeyerových baněk a do jednotlivých baněk přidat dostatečná množství zásobních roztoků zkoušné a referenční látky tak, aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10 - 40 mg DOC.l^-1. Zkontrolují se hodnoty pH a případně se upraví na 7,4. Baňky se naočkují aktivovaným kalem nebo jiným zdrojem inokula (viz I. 6. 4), aby se získala výsledná koncentrace nejvýše 30 mg suspendovaných tuhých látek na litr. Připraví se rovněž kontrolní zkoušky s inokulem v minerálním médiu, avšak bez zkoušené nebo referenční látky.

V případě potřeby se použije jedna nádoba ke kontrole možného inhibičního efektu zkoušené látky naočkováním roztoku, který v minerálním médiu obsahuje srovnatelná množství jak zkoušené tak referenční látky.

Je-li třeba, použije se rovněž další, sterilní, baňka s roztokem dané chemické látky bez inokula (viz I. 6. 6) ke kontrole zda je zkoušená chemická látka rozkládána abioticky.

Existuje-li dále podezření, že se zkoušená látka významně adsorbuje na skle, kalu apod., provede se předběžný odhad pravděpodobného rozsahu adsorpce a tím vhodnosti zkoušky pro danou látku (viz tabulku 1). Použije se baňka obsahující zkoušenou látku, inokulum a sterilizační činidlo.

Obsah všech baněk se doplní minerálním médiem na 1 l a po promíchání se z každé baňky odebere vzorek pro stanovení počáteční koncentrace DOC (viz příloha 2, odst.4). Ústí baněk se zakryjí např. hliníkovou fólií tak, aby byla možná volná výměna vzduchu mezi baňkami a okolní atmosférou. Pak se nádoby umístí do třepačky a zahájí se zkouška.

II. 2. 5 Počet baněk v typické zkoušce

Baňka 1 a 2: Zkoušená suspenze

Baňka 3 a 4: Slepý pokus s inokulem

Baňka 5: Kontrola postupu

Pokud možno a je-li třeba:

Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola

Baňka 7: Kontrola adsorpce

Baňka 8: Kontrola toxicity

Viz také bod I. 6. 7.

II. 2. 6 Provedení zkoušky

Během zkoušky se ve známých časových intervalech stanoví dvojmo koncentrace DOC v každé baňce, a to dostatečně často, aby bylo možné určit začátek 10-denního okénka a procentní úbytek na konci 10-denního okénka. Pro každé stanovení je třeba odebírat pouze minimální nutné množství zkoušené suspenze.

Před odběrem vzorků se případně nahradí ztráty odpařováním z baněk přidáním potřebného množství zřeďovací vody (I. 6. 1). Před odběrem vzorků je třeba kultivační médium dobře promíchat a zajistit, aby látky ulpělé na stěnách nádob přešly do roztoku nebo suspenze. Ihned po odběru je třeba vzorky zfiltrovat přes membránu nebo zcentrifugovat (viz přílohu 2.4). Zfiltrované resp. zcentrifugované vzorky je třeba analyzovat týž den, jinak je možné je přechovávat nejdéle 48 hodin při 2 - 4 °C nebo po delší dobu při teplotě nižší než - 18 °C.

II. 3 VÝSLEDKY A ZPRÁVA

II. 3. 1 Zpracování výsledků

Procentní rozklad v čase t se vypočte, jak je uvedeno v bodě I. 7. 1. (stanovení DOC) nebo případně v bodě I. 7. 2. (specifická analýza).

Všechny výsledky se uvedou na přiložených přehledech dat.

II. 3. 2 Platnost výsledků

Viz bod I. 5. 2.

Čtení tohoto dokumentu nenahrazuje čtení příslušného vydání Sbírky zákonů. Neneseme odpovědnost za případné nepřesnosti vyplývající z převodu originálu do tohoto formátu.

Tento text je zveřejněn za vlastních podmínek opětovného použití zdroje e-Sbírka, nikoli pod licencí Legalize ani pod licencí volného díla. e-Sbírka
volné dílo (úřední díla podle § 3 písm. a) zákona č. 121/2000 Sb., autorského zákona)