Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno v obecné metodě 2.6.12, a připraví se ještě stonásobné a tisícinásobné zředění v tlumivém roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0. Stanoví se nejpravděpodobnější počet bakterií, jak je uvedeno při stanovení celkového počtu živých aerobních mikroorganismů (2.6.12) za použití živné půdy R ve zkumavce nebo v jiné vhodné nádobě s malou Durhamovou zkumavkou. Opatrně se promíchá a inkubuje se 24 h až 48 h při 45,5 °C až 46,5 °C. Zkumavky, které zčernají od sirníku železitého a v nichž je Durhamova zkumavka naplněna plynem (nejméně v jedné desetině objemu), indikují přítomnost Clostridium perfringens. Nejpravděpodobnější počet Cl. perfringens se odečte z tabulky 2.6.12-1.

Ke kontrole se použijí tyto kmeny:

pro 1. metodu: Clostridium sporogenes, např.	ATCC 19404 (NCTC 532, CIP 79.3, CCM 4409, CNCTC Cl 66/79),
pro 2. metodu: Clostridium perfringens, např.	ATCC 13124 (NCIB 6125, NCTC 8237, CIP 103 409, CCM 4435, CNCTC Cl 68/83).

Je-li to nutné, použije se Clostridium sporogenes ke kontrole selektivity a anaerobních podmínek.

Následující část se uvádí pro informaci a jako návod, netvoří závaznou část lékopisu.

Doporučené živné půdy a roztoky

Následující roztok a živné půdy byly shledány dostatečnými pro účely, pro které jsou v lékopise předepsány pro zkoušku na mikrobiální znečištění. Jiné půdy mohou být použity, mají-li podobné výživné a selektivní vlastnosti pro mikroorganismy, které se mají zjišťovat.

Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0

Dihydrogenfosforečnan draselný	3,6 g
Hydrogenfosforečnan sodný dihydrát	7,2 g
Chlorid sodný	4,3 g
Pepton (z masa nebo kaseinu)	1,0 g
Voda	1000 ml

Mohou se přidat povrchově aktivní látky nebo látky inaktivující protimikrobní účinek, jako např.:

Polysorbát 80	1 g/l až 10 g/l.

Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)

Pankreatický hydrolyzát kaseinu	17,0 g
Papainový hydrolyzát sóji	3,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Hydrogenfosforečnan draselný	2,5 g
Glukosa monohydrát	2,5 g
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 mm v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)

Pankreatický hydrolyzát kaseinu	15,0 g
Papainový hydrolyzát sóji	5,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Agar	15,0 g
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky)

Pepton (z masa a kaseinu)	10,0 g
Glukosa monohydrát	40,0 g
Agar	15,0 g
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 5,6 ± 0,2. Sterilizuje se 15 mm v autoklávu při 121 °C. Bezprostředně před použitím se přidá 0,10 g sodné soli benzylpenicillinu a 0,10 g tetracyklinu na 1 l půdy ve formě sterilního roztoku, nebo se přidá 50 mg chloramfenikolu na 1 l půdy před sterilizací.

Tekutá půda D (laktosová půda)

Masový výtažek	3,0 g
Pankreatický hydrolyzát želatiny	5,0 g
Laktosa monohydrát	5,0 g
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,9 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C a ihned se ochladí.

Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae)

Pankreatický hydrolyzát želatiny	10,0 g
Glukosa monohydrát	5,0 g
Sušená hovězí žluč	20,0 g
Dihydrogenfosforečnan draselný	2,0 g
Hydrogenfosforečnan sodný dihydrát	8,0 g
Zeleň brilantní	15 mg
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,2 ± 0,2. Zahřívá se 30 min při 100 °C a ihned se ochladí.

Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, violetí krystalovou a červení neutrální)

Kvasničný výtažek	3,0 g
Pankreatický hydrolyzát želatiny	7,0 g
Žlučové soli	1,5 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Glukosa monohydrát	10,0 g
Agar	15,0 g
Červeň neutrální	30 mg
Violeť krystalová	2 mg
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,4 ± 0,2. Zahřeje se k varu; nelze zahřívat v autoklávu.

Tekutá půda G (MacConkeyova půda)

Pankreatický hydrolyzát želatiny	20,0 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Sušená hovězí žluč	5,0 g
Červeň bromkresolová	10 mg
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda H (MacConkeyův agar)

Pankreatický hydrolyzát želatiny	17,0 g
Pepton (z masa a kaseinu)	3,0 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Žlučové soli	1,5 g
Agar	13,5 g
Červeň neutrální	30 mg
Violeť krystalová	1 mg
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,1 ± 0,2. Za stálého třepání se povaří 1 min a pak se sterilizuje 15 min v autoklávu při 121 °C.

Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a zelení brilantní)

Pepton	8,6 g
Sušená hovězí žluč	8,0 g
Chlorid sodný	6,4 g
Uhličitan vápenatý	20,0 g
Tetrathionan draselný	20,0 g
Zeleň brilantní	70 mg
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby bylo po zahřátí 7,0 ± 0,2. Zahřeje se právě k varu. Nelze opakovaně zahřívat.

Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar)

Masový výtažek	10,0 g
Pepton z masa	10,0 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Citronan sodný	20,0 g
Citronan železitý	1,0 g
Deoxycholan sodný	5,0 g
Agar	13,5 g
Červeň neutrální	20 mg
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,3 ± 0,2. Povaří se 1 min, ochladí na 50 °C a rozplní se do Petriho misek. Nelze zahřívat v autoklávu.

Agarová půda K (deoxycbolanový agar s xylosou a lysinem)

Xylosa	3,5 g
L-lysin	5,0 g
Laktosa monohydrát	7,5 g
Sacharosa	7,5 g
Chlorid sodný	5,0 g
Kvasničný výtažek	3,0 g
Červeň fenolová	80 mg
Agar	13,5 g
Desoxycholan sodný	2,5 g
Thiosíran sodný	6,8 g
Citronan amonno-železitý	0,8 g
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,4 ± 0,2. Zahřeje se k varu, ochladí na 50 °C a rozplní se do Petriho misek. Nelze zahřívat v autoklávu.

Agarová půda L (agar se zelení brilantní, červení fenolovou, laktosou a sacharosou)

Pepton (z masa a kaseinu)	10,0 g
Kvasničný výtažek	3,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Sacharosa	10,0 g
Agar	20,0 g
Červeň fenolová	80 mg
Zeleň brilantní	12,5 mg
Voda	1000 ml

Povaří se 1 min. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,9 ± 0,2. Bezprostředně před použitím se sterilizuje 15 min v autoklávu při 121 °C, ochladí se na 50 °C a rozplní se do Petriho misek.

Agarová půda M (agarová půda se třemi cukry a železem)

Masový výtažek	3,0 g
Kvasničný výtažek	3,0 g
Pepton (z masa a kaseinu)	20,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Sacharosa	10,0 g
Glukosa monohydrát	1,0 g
Citronan amonno-železitý	0,3 g
Thiosíran sodný	0,3 g
Červeň fenolová	25 mg
Agar	12,0 g
Voda	1000 ml

Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,4 ± 0,2. Rozplní se do zkumavek do 1/3 jejich výšky, sterilizuje se v autoklávu 15 min při 121 °C a ochladí se v takové poloze, při které má půda dostatečnou hloubku a šikmý povrch.

Agarová půda N (cetrimidový agar)

Pankreatický hydrolyzát želatiny	20,0 g
Chlorid hořečnatý	1,4 g
Síran draselný	10,0 g
Cetrimid	0,3 g
Agar	13,6 g
Voda	1000 ml
Glycerol	10,0 ml

Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,2 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda O (Baird-Parkerův agar)

Pankreatický hydrolyzát kaseinu	10,0 g
Masový výtažek	5,0 g
Kvasničný výtažek	1,0 g
Chlorid lithný	5,0 g
Agar	20,0 g
Glycin	12,0 g
Pyruvan sodný	10,0 g
Voda	950 ml

Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,8 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C, ochladí se na 45 °C až 50 °C a přidá se 10 ml sterilního roztoku teluričitanu draselného (10 g/l) a 50 ml emulze vaječného žloutku.

Živná půda P (obohacená půda pro klostridia)

Masový výtažek	10,0 g
Pepton	10,0 g
Kvasničný výtažek	3,0 g
Rozpustný škrob	1,0 g
Glukosa, monohydrát	5,0 g
Cysteiniumchlorid	0,5 g
Chlorid sodný	5,0 g
Octan sodný	3,0 g
Agar	0,5 g
Voda	1000 ml

Agar se nechá nabobtnat a rozpustí se zahřátím k varu za stálého míchání. Je-li třeba, upraví se pH tak, aby po sterilizaci bylo asi 6,8. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Půda Q (Columbia agar)

Pankreatický hydrolyzát kaseinu	10,0 g
Peptický hydrolyzát masa	5,0 g
Pankreatický hydrolyzát srdce	3,0 g
Kvasničný výtažek	5,0 g
Kukuřičný škrob	1,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Agar podle schopnosti tvořit gel	10,0 až 15,0 g
Voda	1000 ml

Agar se nechá nabobtnat a rozpustí se zahřátím k varu za stálého míchání. Je-li třeba, upraví se pH tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C. Ochladí se na 45 °C až 50 °C; je-li třeba, přidá se gentamiciniumsulfat v množství odpovídajícím 20 mg báze gentamicinu a rozplní se do Petriho misek.

Půda R (laktoso-siřičitanová půda)

Pankreatický hydrolyzát kaseinu	5,0 g
Kvasničný výtažek	2,5 g
Chlorid sodný	2,5 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Cysteiniumchlorid	0,3 g
Voda	1000 ml

Po rozpuštění se upraví pH na 7,1 ± 0,1 a rozplní se po 8 ml do zkumavek délky 160 mm a průměru 16 mm a obsahujících malou Durhamovu zkumavku. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C a uchovává se při 4 °C. Před použitím se půda zahřívá 5 min ve vodní lázni a ochladí se. Do každé zkumavky se přidá 0,5 ml roztoku disiřičitanu sodného (12 g/l) a 0,5 ml roztoku citronanu železito-amonného (10 g/l). Oba roztoky se připraví v čas potřeby a filtrují se přes membránový filtr (0,45 μm).

Neutralizační činidla

Neutralizační činidla se mohou použít k neutralizaci protimikrobních účinků. Mohou se přidat k tlumivému roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 přednostně před sterilizací. Jestliže se použijí, prokáže se jejich účinnost a že nejsou pro mikroorganismy toxické.

Typický neutralizační roztok má následující složení:

Polysorbát 80	30 g
Lecitin vaječný	3 g
Histidin hydrochlorid	1 g
Pepton (z masa nebo kaseinu)	1 g
Chlorid sodný	4,3 g
Dihydrogenfosforečnan draselný	3,6 g
Hydrogenfosforečnan sodný dihydrát	7,2 g
Voda	1000 ml

Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Pokud má roztok nedostatečnou neutralizační schopnost, může se zvýšit množství polysorbátu 80 nebo lecitinu. Jako alternativa se mohou přidat inaktivující látky uvedené v tabulce 2.6.13-2.

Tab. 2.6.13-2 Látky inaktivující protimikrobní účinky, které se mohou přidat k tlumivému roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0

Druh protimikrobní látky	Inaktivující látka	Koncentrace	Poznámka
Fenoly	Laurylsulfat sodný Polysorbát 80 a lecitin Vaječný žloutek	4 g/l 30 g/l a 3 g/l 5 ml/l až 50 ml/l	Přidává se po sterilizaci tlumivého roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0
Organické sloučeniny rtuti	Thioglykolat sodný	0,5 g/l až 5 g/l
Halogeny	Thiosíran sodný	5 g/l
Kvartérní amoniové sloučeniny	Vaječný žloutek	5 ml/laž 50 ml/l	Přidává se po sterilizaci tlumivého roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0
2.6.14 Bakteriální endotoxiny
---	---

Pět metod uvedených v tomto článku je určeno ke zjištění, zda koncentrace endotoxinu v přípravku, který má v lékopise článek obsahující limit pro bakteriální endotoxiny, vyhovuje tomuto limitu. Výrobci, kteří mají v úmyslu se přesvědčit, zda-li např. jejich výrobní postupy snižují koncentraci endotoxinu v přípravku během výroby, nejsou vázáni postupy uvedenými v tomto článku.

Ve zkoušce na bakteriální endotoxiny se používá lyzát z amebocytů ostrorepa, Limulus polyphemus (LAL test). Po přidání roztoku s obsahem endotoxinů k roztoku lyzátu vzniká ve směsi zákal, sraženina nebo gel. Rychlost reakce závisí na koncentraci endotoxinu, hodnotě pH a teplotě. K reakci je nutná přítomnost určitých dvojmocných kationtů, enzymatický komplex podporující srážení a srážlivý protein, které jsou obsaženy v lyzátu. Štěpení chromogenního peptidu v roztoku lyzátu po aktivaci endotoxiny obsaženými v roztoku lze též použít ke stanovení koncentrace endotoxinů z koncentrace uvolněného barviva.

V této kapitole je popsáno pět následujících metod:

Metoda A. Gelová metoda: limitní zkouška

Metoda B. Semikvantitativní gelová metoda

Metoda C. Turbidimetrická kinetická metoda

Metoda D. Chromogenní peptidová kinetická metoda

Metoda E. Chromogenní peptidová metoda konečného bodu

Jestliže je v článku uvedena zkouška na endotoxiny bez uvedení metody, provede se zkoušení gelovou metodou A, která byla pro přípravek validována. Jinak se zkouška provádí metodou validovanou pro přípravek a uvedenou v článku.

V článcích jsou uvedeny požadavky na bakteriální endotoxiny jako limitní koncentrace endotoxinu; přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže neobsahuje více endotoxinu, než je limitní koncentrace. Splnění tohoto požadavku může být ale doloženo jedině důkazem, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než limitní koncentrace endotoxinu.

Zkouška se provádí způsobem, který vylučuje mikrobiální kontaminaci.

Před provedením zkoušky na endotoxiny na zkoušeném přípravku je nutno ověřit:

• zda použité zařízení neadsorbuje endotoxiny,

• hodnotu lambda (λ) použitého lyzátu. Lambda je definována jako deklarovaná citlivost lyzátu uvedená na obalu (gelová metoda) nebo nejnižší koncentrace endotoxinu použitá při přípravě standardní křivky (kvantitativní metoda),

• nepřítomnost interferujících faktorů.

Je-li třeba, očistí se laboratorní zařízení od endotoxinů.

Není-li v článku pro přípravek, který je analyzován, uvedeno jinak, uplatňují se u všech pěti metod stejné požadavky popsané pro metodu A až metodu E.

V této stati jsou označením zkumavka míněny všechny druhy nádob, včetně jamek mikrotitrační destičky.

Ve zkoušce se používá tento referenční přípravek a tato zkoumadla.

Referenční endotoxin BRP. Je kalibrován v mezinárodních jednotkách (m.j.) porovnáním s mezinárodním standardem.

Lyzát z amebocytů limula. Je vyroben podle požadavků odpovědné autority země výrobce. Lyzát se rozpustí podle návodu. U každé šarže se ověří deklarovaná citlivost (λ,); ta je uvedena v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru.

Voda pro LAL. Voda má požadovanou jakost, jestliže dává negativní výsledek v podmínkách předepsaných pro zkoušku na endotoxiny ve zkoušeném přípravku. Je možno ji připravit trojnásobnou destilací vody na přístroji vybaveném účinným zařízením, které zabraňuje hromadění kapek, nebo jinými prostředky dávajícími vodu požadované jakosti.

Kyselina chlorovodíková pro LAL 0,1 mol/l a hydroxid sodný pro LAL 0,1 mol/l. Připravují se z kyseliny chlorovodíkové R a hydroxidu sodného R a vody pro LAL. Obě látky jsou vhodné pro zkoušku, jestliže po úpravě pH na 6,0 až 8,0 dávají v podmínkách zkoušky negativní výsledek.

Není-li uvedeno jinak, ve zkoušce se pro přípravu roztoků a ředění použije voda pro LAL.

Gelové metody

Metody A a B jsou založeny na tvorbě pevného gelu v roztoku obsahujícím bakteriální endotoxiny po smíchání a inkubaci s lyzátem. U obou metod je požadováno ověřit citlivost lyzátu udanou výrobcem podle postupu uvedeného v části Citlivost lyzátu a prokázat nepřítomnost interferujících faktorů podle postupu uvedeného v části Interferující faktory.

Metody A a B se odlišují v tom, že metoda A ověřuje, zda oba vzorky zkoušeného přípravku obsahují méně endotoxinu, než je limit koncentrace endotoxinu uvedený v odpovídajícím článku, zatímco v metodě B se koncentrace endotoxinu ve zkoušeném přípravku stanoví semikvantitativně a geometrický průměr ve zkoušeném přípravku koncentrace endotoxinu je nižší, než je limit koncentrace endotoxinu uvedený v lékopisném článku.

Následující části: Postup, Citlivost lyzátu a Interferující faktory se používají u obou metod A a B.

Postup. Odpovídající objem lyzátu se nakape do všech zkumavek nebo jiných vhodných nádob (např. podložní sklo) vyhřátých na teplotu 37 °C ± 1 °C. V dostatečně dlouhých intervalech umožňujících odečtení jednotlivých výsledků se k jednotlivým lyzátům přidá stejný objem zkoušeného roztoku a ihned se opatrně smíchá s lyzátem. Reakční směs se za vyloučení vibrací a odpařování vody inkubuje po konstantní dobu, která byla stanovena experimentálně (obvykle 20 min až 60 min) a poté se odečtou výsledky. Jako pozitivní reakce se hodnotí tvorba pevného gelu, který se neporuší při opatrném převrácení nádoby. Výsledek je negativní, jestliže se takový gel nevytvoří.

Citlivost lyzátu. Připraví se nejméně čtyři sériová dvojnásobná ředění referenčního endotoxinu BRP tak, aby v jednotlivých ředěních byla dosažena koncentrace 2 λ, λ, 0,5 λ a 0,25 λ, kde λ je deklarovaná citlivost použitého lyzátu. Alespoň poslední ředění každé série dává negativní výsledek. Postupem uvedeným v části Postup zkoušky se zkouší všechna ředění a negativní kontrolní roztok, kterým je voda pro LAL. Vypočítá se průměr logaritmů nejnižší koncentrace endotoxinu, u které byla v každé sérii ředění zjištěna pozitivní reakce. Antilogaritmus tohoto průměru vyjadřuje citlivost lyzátu. Pokud se její hodnota neliší více než dvojnásobně od hodnoty deklarované, je uvedená citlivost potvrzena a používá se ve všech zkouškách prováděných s tímto lyzátem.

Interferující faktory. pH roztoku má být v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. Zpravidla mívá pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Je-li třeba, upraví se pH vzorku před přidáním lyzátu kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l nebo hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l nebo vhodným tlumivým roztokem. Postupuje se stejně, jak je popsáno v části Citlivost lyzátu, ale připraví se ředění referenčního endotoxinu BRP v neošetřených vzorcích zkoušeného přípravku, ve kterých již není endotoxin zjistitelný. Tyto vzorky se použijí ve zředění nepřesahujícím nejvyšší účinné ředění (MVD), které se vypočítá ze vzorce:

MVD=limitní koncentrace endotoxinucitlivost lyzátu,

kde jsou obě hodnoty vyjádřeny v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru.

Jestliže je limitní koncentrace endotoxinu v jednotlivém lékopisném článku uvedena v mezinárodních jednotkách endotoxinu v miligramu přípravku nebo v mezinárodní jednotce přípravku, vynásobí se limit endotoxinu koncentrací přípravku ve zkoušeném roztoku (v miligramech v mililitru nebo v mezinárodních jednotkách zkoušeného přípravku v mililitru), aby se získala limitní koncentrace endotoxinu v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru zkoušeného přípravku. Výše popsaný postup násobení se použije u roztoků přípravků připravených rozpuštěním podle návodu uvedeného na obalu.

Jestliže se citlivost lyzátu stanovená v přítomnosti zkoušeného přípravku neliší více než dvojnásobně od citlivosti stanovené bez přítomnosti zkoušeného přípravku, pak přípravek neobsahuje faktory, které interferují v experimentálních podmínkách, a může se zkoušet bez dalších úprav. V opačném případě, kdy zkoušený přípravek působí inhibici nebo aktivaci, se interferující faktory odstraní vhodným způsobem, jako je ředění, filtrace, neutralizace, dialýza nebo přidání látek schopných uvolnit adsorbované endotoxiny. Použití citlivějšího lyzátu umožňuje vyšší ředění zkoušeného přípravku a usnadňuje tak odstranění interference.

Jestliže zkoušený přípravek nevyhovuje zkoušce v ředění nižším, než je MVD, zkouška se opakuje za použití MVD.

Ultrafiltraci je možno použít tehdy, jestliže interferující faktory procházejí filtrem s nominálním separačním limitem odpovídajícím relativní molekulové hmotnosti 10 000 až 20 000. Je možno použít asymetrické membránové filtry z triacetatcelulosy, které se však musí přezkoušet na přítomnost složek způsobujících falešně pozitivní výsledky. Látky zachycené na filtru, které obsahují endotoxin, se opláchnou vodou pro LAL nebo vhodným tlumivým roztokem a endotoxiny se získají ve vodě pro LAL nebo ve vhodném tlumivém roztoku. Pro každý zkoušený přípravek je stanoven zkoušený objem a konečný objem pro zpětné uvolnění endotoxinu.

Pro ověření, že zvolený způsob účinně odstraňuje interferenci a přitom neodstraňuje endotoxiny, se zkouška na interferující vlivy opakuje se zkoušeným přípravkem, ke kterému se přidá referenční endotoxin BRP a použije se jeden ze zvolených způsobů na odstranění interferujících faktorů.

METODA A. GELOVÁ METODA (LIMITNÍ ZKOUŠKA)

Zkouška na endotoxin ve zkoušeném přípravku. Provádí se dvojmo, jak je popsáno v části Postup zkoušky, při použití takového ředění, které nepřevyšuje maximální účinné ředění zkoušeného přípravku, který v případě nutnosti byl ještě podroben některému ze způsobů odstraňujících interferující faktory.

Zároveň se zkouší negativní kontrola tvořená z vody pro LAL a dvě pozitivní kontroly, které obsahují referenční endotoxin BRP v koncentraci odpovídající dvojnásobku deklarované citlivosti lyzátu a z nichž jedna obsahuje zkoušený přípravek (podrobený, je-li třeba, postupu k odstranění interferujících faktorů po přidání referenčního endotoxinu) v koncentraci použité ve zkoušce. Zkoušku lze hodnotit, jestliže negativní a obě pozitivní kontroly dávají odpovídající výsledek.

Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže obě zkoušené směsi dávají negativní výsledek. Zkoušený přípravek nevyhovuje zkoušce, jestliže obě zkoušené směsi dávají pozitivní výsledek. Jestliže je pozitivní výsledek pouze v jedné zkoušené směsi ave druhé negativní, zkouška se opakuje; zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže v obou zkoušených směsích je zjištěn negativní výsledek.

METODA B. SEMIKVANTITATIVNÍ GELOVÁ METODA

Stanovení endotoxinů ve zkoušeném přípravku. Je-li třeba, vzorky určené ke zkoušení se zpracují postupem odstraňujícím interferující faktory. Připraví se tyto roztoky:

• a) dva samostatně připravené roztoky zkoušeného přípravku v ředění použitém ke kontrole odstranění interferujích faktorů. Použije se voda pro LAL k přípravě dvou nezávislých sériových ředění zkoušeného vzorku po čtyřech zkumavkách v koncentraci 1, 1/2, 1/4 a 1/8 ve vztahu k ředění, se kterým byla provedena kontrola na odstranění interferujících faktorů,

• b) dvě řady po čtyřech zkumavkách obsahující vodu pro LAL a referenční endotoxin BRP v koncentraci 2 λ, λ, 1/2 λ, a 1/4 λ,

• c) dvojici zkumavek se zkoušeným přípravkem v samostatně připraveném ředění, které bylo použito ke kontrole na interferující faktory a s referenčním endotoxinem BRP o koncentraci 2 λ,

• d) voda pro LAL (jako negativní kontrola).

Zkouška se provede postupem uvedeným v části Citlivost lyzátu. Zkoušku lze hodnotit, jsou-li splněny tři následující podmínky:

• výsledek v roztoku (d) je negativní,

• výsledky v roztocích (c) jsou pozitivní,

• geometrický průměr koncentrace endotoxinu v roztocích (b) je v rozmezí 1/2 λ až 2 λ.

Pro každé ředění (a) se stanoví nejnižší koncentrace přípravku, která dává pozitivní výsledek, tedy obsahuje 1 m.j. endotoxinu v mililitru. Jestliže byl původní roztok zkoušeného přípravku ředěn faktorem d1 aby vyhověl zkoušce na interferující faktory, a tento roztok byl dále ředěn faktorem d2 k získání nejnižší koncentrace s pozitivním výsledkem, pak množství endotoxinu v m.j./ml v původním roztoku zkoušeného přípravku se rovná λ x d1 x d2. Vypočítá se geometrický průměr ze dvou výsledků obou ředění (a). Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže geometrický průměr koncentrací endotoxinu je nižší než limitní koncentrace endotoxinu uvedená v příslušném článku.

Kinetické metody

Obě metody, turbidimetrická kinetická (metoda C) a chromogenní peptidová kinetická metoda (metoda D) používají lineární regresi logaritmu odpovědi na logaritmu koncentrace endotoxinu. Způsob provedení je uveden v části Postup pro každou metodu zvlášť; části Ověření parametrů standardní křivky, Interferující faktory a Stanovení endotoxinu ve zkoušeném přípravku jsou vhodné jak pro turbidimetrickou kinetickou metodu, tak pro chromogenní peptidovou kinetickou metodu.

METODA C. TURBIDIMETRICKÁ KINETICKÁ METODA

Postup. Vhodným zařízením se měří reakční čas potřebný k dosažení předem určeného stupně zákalu v roztoku, ke kterému byl vhodným způsobem přidán lyzát Koncentrace endotoxinu v roztoku se vypočítá z logaritmu reakčního času a kalibrační křivky. Postup pro přípravu kalibrační křivky je uveden v části Ověření parametrů standardní křivky.

Rychlost změny zákalu v lineární části regresní křivky se též může použít ke stanovení koncentrace endotoxinu.

METODA D. CHROMOGENNÍ PEPTIDOVÁ KINETICKÁ METODA

Postup. Měří se reakční čas potřebný k dosažení předem určené intenzity zbarvení po uvolnění barviva z vhodného chromogenního peptidu komplexem endotoxin-lyzát; zbarvení se stanoví spektrofotometricky při vhodné vlnové délce. Koncentrace endotoxinu v roztoku se odvodí z logaritmu reakčního času pomocí kalibrační křivky. Postup pro přípravu kalibrační křivky je uveden v části Ověření parametrů standardní křivky.

METODA C A METODA D

Ověření parametrů standardní křivky. Požaduje se vždy při použití nové šarže lyzátu nebo při změně podmínek, které by mohly ovlivnit výsledek zkoušky.

Připraví se nejméně dvě samostatné řady, každá nejméně o čtyřech koncentracích referenčního endotoxinu BRP v požadovaném rozsahu. Limity uvedené výrobcem by se neměly překročit. Použije se nejméně jedna koncentrace na jednu jednotku v logaritmické stupnici a jako negativní kontrola voda pro LAL. Do každé zkumavky se přidá stejný objem lyzátu a u metody D vhodné množství chromogenního peptidu. Měří se reakční čas, jak bylo uvedeno výše.

Pro každou zkumavku se stanoví logaritmus reakčního času jako funkce logaritmu koncentrace endotoxinu a analyzuje se regrese logaritmu reakčního času na logaritmu koncentrace endotoxinu za použití standardní metody (metoda nejmenších čtverců).

Regresní křivka má signifikantní sklon a je signifikantně lineární; obojí na 95% hladině významnosti pro rozmezí koncentrací endotoxinu uvedené výrobcem lyzátu.

Stanoví se počet logaritmicky stejně vzdálených koncentrací, pro které je regresní křivka lineární. Je-li tímto číslem trojice (λ1, λ2, λ3), použije se druhá koncentrace λ2 jako λm ve zkoušce na interferující faktory a ve stanovení endotoxinů ve zkoušeném přípravku. Jestliže je toto číslo rovno 4 nebo 5, použije se v tomto případě třetí koncentrace λ3 jako λm.

Kromě těchto požadavků se dodržují všechny další zkoušky nebo požadavky uvedené výrobcem lyzátu.

Interferující faktory. Připraví se čtyři samostatná ředění roztoku obsahujícího referenční endotoxin BRP v koncentraci λm a zkoušený přípravek ředěný faktorem vypočítaným podle vzorce:

limitní koncentrace endotoxinuλm.

Hodnota pH roztoku má být v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. Zpravidla je pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Je-li třeba, upraví se pH vzorku před přidáním lyzátu kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l nebo hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l nebo vhodným tlumivým roztokem. Zkouška se provede se čtveřicí roztoků a vypočítá se průměrná koncentrace endotoxinu jako antilogaritmus průměrné logaritmické koncentrace endotoxinu.

Jestliže je průměrná koncentrace endotoxinu nejméně 50 % hodnoty λm zkoušený přípravek neobsahuje faktory, které by interferovaly s lyzátem v podmínkách zkoušky, a vzorky tohoto přípravku se mohou zkoušet bez dalších úprav k vyloučení interferujících faktorů.

Je-li průměrná koncentrace endotoxinu nižší než 50 % hodnoty λm je nutno odstranit interferující faktory, jak je uvedeno v metodě A. Jestliže průměrná koncentrace přesahuje nej vyšší koncentraci v lineární části regresní křivky, zkouška se opakuje za použití vyššího ředícího faktoru pro zkoušený přípravek vypočítaného podle vzorce:

limitní koncentrace endotoxinuλm,

kde λl < λmˊ < λm

Stanovení endotoxinů ve zkoušeném přípravku. Nejprve se, je-li to třeba, odstraní ze zkoušeného přípravku interferující faktory. Hodnota pH roztoku má být v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. Zpravidla je pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Je-li třeba, upraví se pH vzorku před přidáním lyzátu kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l nebo hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l nebo vhodným tlumivým roztokem.

Připraví se tyto roztoky:

• a) dvojice samostatně připravených roztoků zkoušeného přípravku ve stejném ředění jaké bylo použito ke kontrole odstranění interferujících faktorů,

• b) dvojice samostatně připravených roztoků obsahujících referenční endotoxin BRP v koncentraci λm nebo λmˊ podle toho, která je třeba, a zkoušený přípravek v ředění, jak je uvedeno v bodě a),

• c) tři logaritmicky stejně vzdálené koncentrace referenčního endotoxinu BRP pokrývající lineární část regresní křivky. Každé ředění se připraví dvakrát,

• d) voda pro LAL jako negativní kontrola.

Provede se zkouška postupem uvedeným v části Ověření parametrů standardní křivky. Vypočítá se koncentrace endotoxinu pro každou dvojici roztoků (a) a (b) pomocí regresní křivky připravené z kontrolní série (c).

Zkoušku lze hodnotit, jestliže jsou splněny tři následující podmínky:

• výsledek negativní kontroly (d) nepřevyšuje limit pro slepou hodnotu naměřenou při validaci citlivosti lyzátu,

• výsledky kontrolní série (c) vyhovují požadavkům uvedeným v Ověření parametrů standardní křivky,

• množství endotoxinu, vypočítané z geometrického průměru koncentrace endotoxinu v roztocích (b) po odečtení geometrického průměru koncentrace endotoxinu roztoků (a), je vyšší než 50 % a nižší než 200 %. Vypočítá se množství v procentech jako podíl výsledku po odečtení λm nebo λmˊ (podle toho, která hodnota byla použita) a výsledek se násobí 100.

Zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže koncentrace každého z dvojice roztoků (a) je nižší než λm nebo λmˊ mezinárodních jednotek endotoxinu v mililitru podle toho, která hodnota byla použita. Jestliže koncentrace endotoxinu jednoho z dvojice roztoků je nižší a druhá vyšší než tento limit, zkouška se opakuje. Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže oba roztoky (a) vyhovují limitu.

METODA E. CHROMOGENNÍ PEPTIDOVÁ METODA KONEČNÉHO BODU

Postup. Při vhodné vlnové délce se měří spektrometrem koncentrace barviva uvolněného po inkubaci z roztoku obsahujícího endotoxin, lyzát a chromogenní peptid. Koncentrace endotoxinu se vypočítá z absorbace při zvolené vlnové délce pomocí kalibrační křivky připravené postupem uvedeným v části Ověření parametrů standardní křivky.

Ověření parametrů standardní křivky. Požaduje se vždy při použití nové šarže lyzátu nebo při změně podmínek, které by mohly ovlivnit výsledek zkoušky.

Připraví se čtyři samostatné řady referenčního endotoxinu BRP ve vodě pro LAL tak, aby přesahovala rozmezí uvedené výrobcem lyzátu; rozmezí má obsahovat limit (λ) deklarovaný výrobcem. Použije se kontrolní roztok připravený podle návodu výrobce lyzátu.

Do každé zkumavky se přidají předepsaná množství lyzátu a chromogenního peptidu a směs se inkubuje po dobu stanovenou výrobcem.

Reakce se zastaví a měří se absorbance při vhodné vlnové délce.

Pro každou zkumavku v každé čtveřici ředění se do grafu zaznamená absorbance každé koncentrace jako funkce koncentrace endotoxinu a analyzuje se regrese absorbance na koncentraci použitím standardní analytické metody (metoda nejmenších čtverců). Regresní křivka má signifikantní sklon a je lineární, obojí na 95% hladině významnosti pro rozmezí koncentrací endotoxinu uvedených výrobcem lyzátu. Vypočítá se koncentrace endotoxinu λm, což je aritmetický průměr nejvyšší (λh) a nejnižší (λl) koncentrace endotoxinu, při které je regresní křivka lineární. Všechny hodnoty se uvedou v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru.

Kromě těchto požadavků se dodržují všechny další zkoušky nebo požadavky uvedené výrobcem lyzátu.

Interferující faktory. Připraví se čtyři samostatná ředění roztoku obsahujícího referenční endotoxin BRP v koncentraci λm a zkoušený přípravek ředěný faktorem vypočítaným podle vzorce:

limitní koncentrace endotoxinuλm,

Hodnota pH roztoku má být v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. Zpravidla je pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Je-li třeba, upraví se pH vzorku před přidáním lyzátu kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l nebo hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l nebo vhodným tlumivým roztokem.

Zkouška se provede se čtveřicí roztoků a vypočítá se průměrná koncentrace endotoxinu.

Jestliže je průměrná koncentrace endotoxinu nejméně 50 % a nejvýše 200 % hodnoty λm, zkoušený přípravek neobsahuje faktory, které by interferovaly s lyzátem v podmínkách zkoušky, a vzorky tohoto přípravku mohou být zkoušeny bez dalších úprav k vyloučení interferujících faktorů.

Je-li průměrná koncentrace endotoxinu nižší než 50 % nebo vyšší než 200 % hodnoty λm, je nutno odstranit interferující faktory, jak je uvedeno v metodě A.

Jestliže průměrná koncentrace přesahuje nejvyšší koncentraci v lineární části regresní křivky, zkouška se opakuje za použití vyššího ředícího faktoru pro zkoušený přípravek vypočítaného podle vzorce:

limitní koncentrace endotoxinuλm,

kde λl < λmˊ < λm.

Stanovení endotoxinu ve zkoušeném přípravku. Nejprve se, je-li to třeba, odstraní ze zkoušeného přípravku interferující faktory. Hodnota pH roztoku má být v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. Zpravidla je pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Je-li třeba, upraví se pH vzorku před přidáním lyzátu kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l nebo hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l nebo vhodným tlumivým roztokem.

Připraví se tyto roztoky:

• a) dva samostatně připravené roztoky zkoušeného přípravku v ředění použitém ke kontrole odstranění interferujících faktorů,

• b) dva samostatně připravené roztoky obsahující referenční endotoxin BRP v koncentraci λm nebo λmˊ podle toho, která je třeba, a zkoušený přípravek v ředění, jak je uvedeno v bodě a),

• c) dvojice roztoků referenčního endotoxinu BRP o koncentraci λh a dvojice roztoků o koncentraci λl,

• d) voda pro LAL jako negativní kontrola.

Provede se zkouška postupem uvedeným v části Ověření parametrů standardní křivky. Po inkubaci se ve všech roztocích (a), (b), (c) a (d) změří absorbance. Absorbance roztoků (c) a (d) se použije pro výpočet regresní křivky a vypočítá se koncentrace endotoxinu v roztocích (a) a (b). Zkoušku lze hodnotit, jestliže jsou splněny tři následující podmínky:

• výsledek negativní kontroly (d) nepřevyšuje limit pro slepou hodnotu naměřenou při validaci citlivosti lyzátu,

• výsledky kontrolních roztoků (c) vyhovují požadavkům pro kalibrační křivky použité pro ověření citlivosti lyzátu,

• množství endotoxinu, vypočítané z aritmetického průměru koncentrací endotoxinu v roztocích (b) po odečtení aritmetického průměru koncentrace endotoxinu roztoků (a), je vyšší než 50 % a nižší než 200 %. Vypočítá se procento množství v procentech jako podíl výsledku po odečtení λm nebo λmˊ podle toho, která hodnota byla použita, a výsledek se násobí 100.

Zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže koncentrace každého z dvojice roztoků (a) je nižší než λm nebo λmˊ mezinárodních jednotek endotoxinu v mililitru podle toho, která hodnota byla použita. Jestliže koncentrace endotoxinu jednoho z dvojice roztoků je nižší a druhá vyšší než tento limit, zkouška se opakuje. Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže oba roztoky (a) vyhovují limitu.

Následující část je uvedena pro informaci a jako návod, netvoří závaznou součást lékopisu.

Zkouška na bakteriální endotoxin: směrnice

• 1. Úvod

Endotoxiny pocházející z gramnegativních bakterií jsou nejčastější příčinou toxických reakcí přisuzovaných kontaminaci farmaceutických přípravků pyrogenními látkami; pyrogenní účinnost endotoxinů je mnohem vyšší než účinnost jiných pyrogenních látek. Endotoxiny jsou lipopolysacharidy. Ačkoli množství pyrogenních látek s odlišnou strukturou je malé, obecně platí, že nepřítomnost bakteriálních endotoxinů v přípravku je známkou absence pyrogenních složek za předpokladu, že lze vyloučit přítomnost neendotoxinových pyrogenních látek.

Přítomnost endotoxinů v přípravku může být zakryta faktory interferujícími s reakcí mezi amebocytárním lyzátem a endotoxiny. Proto analytik, chce-li nahradit zkoušku na pyrogenní látky na králících, která je požadována lékopisným článkem, zkouškou na endotoxin, prokáže, že přípravek lze zkoušet validovaným způsobem, který může obsahovat postup na odstranění interferujících faktorů.

Jak je uvedeno ve zkoušce na bakteriální endotoxiny, je třeba mít dostatečné informace o následujících aspektech dříve, než bude zkouška se vzorkem uznána za validovanou:

• 1.1 Prokáže se vhodnost materiálů ke zkoušce. Má se prokázat nepřítomnost endotoxinu ve vodě pro LAL a v ostatních zkoumadlech a má se ověřit citlivost lyzátu, aby se ověřila citlivost deklarovaná výrobcem.

• 1.2 Protože zkoušený přípravek může ve zkoušce interferovat, přezkouší se citlivost lyzátu v nepřítomnosti i v přítomnosti zkoušeného přípravku. Mezi oběma hodnotami citlivosti se nezjistí signifikantní rozdíl.

Zkouška na bakteriální endotoxin uvádí též způsob odstranění interferujících faktorů (viz Gelové metody); v případě interference se po použití takového postupu provede další zkouška, aby se ověřilo, zda použitá metoda skutečně neutralizovala nebo odstranila interferenci.

Jestliže zkoušený vzorek nevyhovuje zkoušce (pozitivní výsledek), je možno zkoušku opakovat. Zřejmé nevyhovění přípravku požadavkům zkoušky může být způsobeno chybou v jeho přípravě, ředěním nebo jinou náhodnou laboratorní kontaminací.

V této části jsou vysvětleny důvody pro požadavky obsažené ve zkoušce na bakteriální endotoxiny a potom je pojednáno o odečítání a interpretaci výsledků.

Nahrazení lékopisné zkoušky na pyrogenní látky prováděné na králících LAL testem v podstatě představuje použití alternativní metody analýzy, a proto vyžaduje validaci. Některé pokyny k jejímu provedení jsou uvedeny v této části.

Referenční metoda na stanovení bakteriálních endotoxinů je uvedena v článku daného přípravku; není-li metoda uvedena, použije se jako referenční metoda A. Má-li se použít jiná než referenční metoda, musí analytik prokázat, že tato metoda je vhodná pro přípravek a dává výsledky, které jsou shodné s výsledky získanými referenční metodou (viz též část 11).

Ačkoliv ve zkoušce na bakteriální endotoxiny je určen jako zdroj lyzátu druh Limulus polyphemus, je možno aktivní lyzát též získat z blízce příbuzných druhů, jako je rod Tachypleus. Výraz ”amebocytární lyzát” se v textu používá pro označení validovaného amebocytárního lyzátu bez ohledu na jeho biologický původ.

• 1. Metoda

Ačkoliv přidání endotoxinu k roztoku amebocytárního lyzátu může vést ke vzniku zákalu, sraženiny nebo gelu, pouze vznik gelu byl zvolen jako rozhodující u prvního typu zkoušky na bakteriální endotoxiny. Výhodou byla jednoduchost založená na rozhodnutí, zda přípravek vyhovuje nebo nevyhovuje na základě prostým okem patrné tvorby nebo nepřítomnosti gelu. Kvantitativní metody uvedené jako metody C, D, E byly vyvinuty později: vyžadují více přístrojového vybavení, ale jsou vhodnější pro automatické zkoušení velkého počtu vzorků jednoho přípravku.

Endotoxiny se mohou adsorbovat na povrch zkumavek nebo pipet z určitých plastů nebo typů skla. Uvolnění látek z plastických materiálů může vyvolat interferenci. Proto se mají používané materiály kontrolovat; složení následujících šarží zkumavek nebo pipet se mohou mírně lišit, a proto se doporučuje, aby laboratorní pracovník opakoval takové zkoušení u každé nové šarže materiálů.

Zatímco výsledky zkoušky na pyrogenní látky na králících jsou závislé na dávce pyrogenu, výsledky zkoušky na bakteriální endotoxiny závisí na koncentraci endotoxinu ve směsi. Rozhodnutí použít zkoušku na bakteriální endotoxiny jako limitní zkoušku je dáno tím, že za prvé musí být definována prahová koncentrace endotoxinu pro zkoušený přípravek a za druhé analytik provádějící zkoušku má vědět, kdy je koncentrace endotoxinu v přípravku pod nebo nad hranicí této prahové hodnoty. Kvantitativními metodami C, D, E je stanovení koncentrace endotoxinu ve zkoušeném vzorku jednoduché, ale v rutinní kontrole kvality je základním požadavkem otázka, zda-li tato koncentrace je nebo není vyšší než požadovaný limit.

Při stanovování prahové koncentrace endotoxinu u zkoušeného přípravku je nutno brát zřetel na lidskou dávku přípravku, s cílem mít jistotu, že pokud je koncentrace endotoxinu v přípravku pod prahovou hodnotou, pak výsledná maximální dávka podaná odpovídajícím způsobem za hodinu neobsahuje dostatečné množství endotoxinu k rozvoji toxické reakce.

Jestliže je koncentrace endotoxinu v přípravku přesně rovna prahové hodnotě, dojde ke vzniku gelu jako v případě, kdy je koncentrace endotoxinu mnohem vyšší a přípravek nevyhoví zkoušce, protože nelze rozlišit mezi koncentrací přesně se rovnající prahové koncentraci a mezi koncentrací vyšší. Pouze v případě, kdy nedojde ke vzniku gelu, může analytik rozhodnout, že koncentrace endotoxinu nepřesáhla koncentraci prahovou.

U pevných přípravků je třeba prahovou koncentraci endotoxinu na jednotku hmotnosti nebo mezinárodní jednotku přípravku převést na koncentraci endotoxinu v mililitru zkoušeného roztoku, neboť zkoušku lze provádět pouze u roztoků. Přípravky, které existují pouze v tekutém stavu, jako jsou infuzní roztoky, jsou uvedeny dále.

Stanovení prahové koncentrace endotoxinu v mezinárodních jednotkách endotoxinu v jednotce přípravku (jednotka hmotnosti nebo mezinárodní jednotka) vyžaduje definovat:

M = maximální dávka přípravku pro dospělé vyjádřená v jednotkách hmotnosti nebo mezinárodních jednotkách na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu, pokud se podává zamýšleným způsobem. Při stanovení maximální dávky pro dospělé se má použít hmotnost 70 kg pro dospělou osobu. Dětská dávka na kilogram hmotnosti za hodinu se má použít jen v případě, jeli vyšší než odpovídající dávka pro dospělé,

K = maximální dávka endotoxinu v mezinárodních jednotkách endotoxinu na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu, kterou může pacient dostat předepsaným způsobem bez nežádoucích účinků (Tabulka 2.6.14-1).

Předpokládá se ke zkoušení roztok obsahující c mg (nebo mezinárodních jednotek) přípravku v mililitru. Potom objem M/c ml je objem obsahující maximální dávku M. Jestliže tento objem obsahuje K mezinárodních jednotek endotoxinu, bude výsledek zkoušky pozitivní.

Proto limitní koncentrace endotoxinu (ELC) v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru, jež je shodná s prahovou koncentrací endotoxinu v miligramu nebo v mezinárodní jednotce přípravku v pevném stavu, je rovna:

ELC=K.cM,

v němž značí:

K - nejvyšší přijatelnou dávku endotoxinu v mezinárodních jednotkách na kilogram hmotnosti za hodinu,

c - koncentraci roztoku v miligramech nebo mezinárodních jednotkách přípravku v mililitru,

M - maximální dávku přípravku v miligramech nebo mezinárodních jednotkách na kilogram hmotnosti za hodinu.

U přípravků, které jsou již v tekuté formě, se vyjádří maximální dávka pro dospělého na kilogram hmotnosti za hodinu v mililitrech. Výše uvedené vyjádření limitní koncentrace endotoxinu platí též pro přípravky, u nichž je uvedena maximální dávka v mililitrech na kilogram hmotnosti za hodinu nahrazením M a c hodnotou jedna.

Prahová koncentrace endotoxinu byla v minulosti definována jako maximální povolená koncentrace endotoxinu (MAEC). Avšak prakticky přípravek obsahující množství endotoxinu, které se rovná přesně MAEC, by nevyhověl zkoušce stejně jako přípravek obsahující endotoxinu více. Jediný způsob, jak se přesvědčit, že MAEC v přípravku nebyla překročena, je prokázat, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než MAEC; takže je mnohem logičtější používat termín limitní koncentrace endotoxinu (ELC) jako koncentraci endotoxinu, která nesmí být dosažena.

Limitní koncentrace endotoxinu závisí na druhu přípravku a jeho použití a je uvedena v jednotlivých článcích, do nichž je třeba nahlédnout. Hodnoty K jsou uvedeny v tabulce 2.6.14-1.

Tab. 2.6.14-1

Zamýšlený způsob podání	K v mezinárodních jednotkách endotoxinu na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu
Intravenózní	5,0
Intravenózní pro radiofarmaka	2,5
Intrathekalní	0,2

Které ředění přípravku se má použít ve zkoušce, aby byla naprostá jistota, že negativní výsledek zkoušky znamená, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než ELC a že pozitivní výsledek znamená, že lyzát detegoval alespoň ELC. Toto ředění závisí na ELC a na citlivosti lyzátu: označuje se jako maximální platné ředění (MVD) a tato hodnota se může vypočítat ze vzorce.

MVD=ELCλ=K.cM.λ,

v němž značí:

λ - uvedenou citlivost lyzátu v mezinárodních jednotách endotoxinu v mililitru.

Jestliže hodnota maximálního platného ředění není celým číslem, pak je možno pro rutinní účel zvolit odpovídající celé číslo nižší, než je MVD (čímž je míněna hodnota ředění roztoku přípravku nižší, než je udaná hodnota MVD). V tomto případě negativní výsledek zkoušky ukazuje, že koncentrace endotoxinu v přípravku se nachází pod hladinou limitní hodnoty. Je-li však koncentrace endotoxinu v přípravku v takovéto zkoušce nižší než ELC, ale dostatečně vysoká k tomu, aby při reakci s lyzátem došlo k tvorbě gelu, může být zkouška hodnocena za těchto podmínek jako pozitivní. Tudíž, je-li zkouška s tímto "vhodným" ředícím faktorem pozitivní, je nutno přípravek ředit na MVD a zkoušku opakovat. V jakémkoli případě pochybností nebo sporu se použije MVD.

To zdůrazňuje důležitost potvrzení citlivosti lyzátu.

Příklad

Zkouší se roztok sodné soli fenytoinu obsahující 50 mg/ml (zamýšlený pro intravenózní podání). Stanoví se MVD za použití následujících proměnných:

M - maximální lidská dávka = 15 mg na kilogram hmotnosti za hodinu,

c - 50 mg/ml,

K - 5 m.j. endotoxinu na kilogram za hodinu v mezinárodních jednotkách,

λ - 0,4 m.j. endotoxinu v mililitru.

Řešení:

ELC=K.cM=5.5015

MVD=ELCλ=5.5015.10,4=41,67

Pro rutinní zkoušení tohoto přípravku je vhodné ředit 1 ml roztoku ke zkoušce na 20 ml (MVD/2 zaokrouhleno na nejbližší menší celé číslo). Je-li však zkouška pozitivní, bude analytik muset ředit 1 ml na 41,67 ml a opakovat zkoušku. Ředění na 41,67 ml je rovněž nutné, jestliže se zkoušením má vyřešit sporný výsledek.

• 1. Referenční materiál

Referenční endotoxin BRP je určen pro použití jako porovnávací přípravek. Byl přezkoušen proti mezinárodnímu standardu endotoxinu a jeho účinnost je vyjádřena v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru. Mezinárodní jednotka endotoxinu je definována jako specifická účinnost obsažená v definovaném množství mezinárodního standardu.

Pro rutinní účely je možno použít jiný přípravek endotoxinu, jestliže byl přezkoušen proti mezinárodnímu standardu endotoxinu nebo endotoxinu BRP a jeho účinnost je vyjádřena v mezinárodních jednotkách endotoxinu.

Jedna ampule referenčního přípravku obvykle obsahuje větší množství, než je množství potřebné pro jednu zkoušku, a analytik potřebuje vědět, jak dlouho lze obsah otevřené ampule používat. Pokles účinnosti nebyl pozorován v ampulích, které byly otevřeny v laminárním boxu, uzavřeny vhodným materiálem a dva týdny skladovány při +4 °C. Analytik samozřejmě musí ověřit účinnost takovéto ampule při rutinním laboratorním režimu, je-li odkázán na prodloužené používání otevřené ampule.

• 1. Voda pro LAL

Zkoušení na nepřítomnost endotoxinu v této látce zkouškou na pyrogenní látky na králíku bylo vyloučeno z praktických a teoretických důvodů:

• králík není dostatečně citlivý, aby mohl detegovat endotoxin ve vodě pro LAL určené ke zkoušení přípravků s velice nízkou limitní koncentrací endotoxinu,

• relativně nízká přesnost teplotní odpovědi u králíka vede k opakování na mnoha králících,

• termíny “pyrogenní látky“ a “endotoxiny“ označují skupiny látek, které nejsou zcela totožné.

Text zkoušky na bakteriální endotoxiny ukazuje, že i jiná metoda, než je trojnásobná destilace, se může použít k přípravě vody pro LAL. Reverzní osmosa byla použita s dobrým výsledkem; někteří analytici mohou dávat přednost vodě destilované více než třikrát. V každém případě použitá metoda musí zaručit, že výsledný produkt je prost zjistitelných endotoxinů.

• 1. Hodnota pH směsi

Ve zkoušce na bakteriální endotoxiny dochází ke vzniku gelu nejvhodněji při pH 6,0 až 7,5. Při přidání lyzátu ke vzorku může však dojít k poklesu pH. Proto, aby byla jistota, že pH směsi není nižší než 6,0, má se analytik přesvědčit o tom, že hodnota pH zkoušeného vzorku není nižší než 6,5.

• 1. Validace lyzátu

Při přípravě roztoku lyzátu je důležité se řídit návodem výrobce.

Poslední pozitivní ředění u gelové metody A a B se převedou na logaritmy. Důvodem toho graficky znázorněné rozložení četnosti těchto logaritmických hodnot dává obvykle normální distribuční křivku mnohem vyrovnanější, než je distribuční rozložení ředících faktorů jako takových; v podstatě jde o tak podobné hodnoty, že je přijatelné použít normální frekvenční distribuci jako matematický model a stanovit interval spolehlivosti Studentovým t-testem.

Kinetické metody C a D používají logaritmus koncentrace endotoxinu, protože lze použít model lineární regrese log reakčního času na log koncentrace endotoxinu. Chromogenní metoda konečného bodu, metoda E, používá odlišný model. V tomto případě výsledek (absorbance závislá na uvolněném barvivu) může být hodnocen jako lineární funkce koncentrace endotoxinu v použitém koncentračním rozmezí.

• 1. Předběžná zkouška na interferující faktory

Některé přípravky nelze přímo zkoušet na přítomnost endotoxinu, protože je nelze smíchat se zkoumadly, nelze u nich upravit hodnotu pH v rozmezí 6,5 až 7,5 nebo inhibují nebo aktivují tvorbu gelu. Proto je nutno provést předběžnou zkoušku na zjištění přítomnosti interferujících faktorů: jsou-li nalezeny, pak analytik prokáže, že postup použitý k jejich odstranění byl dostatečně účinný.

Předmětem předběžného zkoušení je nulová hypotéza, že citlivost lyzátu v přítomnosti zkoušeného přípravku se signifikantně neliší od citlivosti lyzátu bez přítomnosti vzorku. Jednoduché kritérium je použito v metodě A a B: nulovou hypotézu lze přijmout, jestliže citlivost lyzátu v přítomnosti přípravku je nejméně poloviční a nejvýše dvojnásobná, než je citlivost lyzátu samotného.

Klasickým způsobem se stanoví průměrné hodnoty logaritmů ředících faktorů lyzátu pro citlivost s přípravkem a bez něho a vypočítá se rozdíl mezi oběma průměrnými hodnotami Studentovým t-testem.

Zkouška na interferující faktory v gelových metodách A a B vyžaduje použití vzorku přípravku, u něhož nebyla zjištěna přítomnost endotoxinu. To představuje teoretický problém, když se má zkoušet zcela nový přípravek. V důsledku různých přístupů byly navrženy kvantitativní metody C, D, E.

• 1. Odstranění interferujících faktorů

Postup k odstranění interference nemá ani zvyšovat ani snižovat množství endotoxinu ve zkoušeném přípravku (např. nesmí dojít ke snížení vlivem adsorbce). Správný způsob jak toto ověřit je, že se do zkoušky zařadí vzorek přípravku, ke kterému se přidá známé množství endotoxinu a poté se měří zpětně koncentrace endotoxinu.

Metody C a D. Jestliže zkoušený přípravek vykazuje interferenci, kterou nelze odstranit klasickými metodami, provede se CSE křivka se stejným typem přípravku zbaveného endotoxinů vhodným způsobem nebo ředěním přípravku. Zkouška na endotoxiny se provede porovnáním s touto standardní křivkou.

Ukazálo se, že v mnoha případech je dostatečně účinná ultrafiltrace přípravku na asymetrických membránových filtrech z triacetatcelulosy. Filtry mají být patřičně validovány, protože v některých případech mohou deriváty celulosy (β-D-glykany) způsobovat falešně pozitivní výsledky.

Polysulfonové filtry uvedené v dřívějším textu byly shledány nevhodnými, protože někteří uživatelé při jejich použití získali falešně pozitivní výsledky.

• 1. Poslání kontrol

Účelem kontroly vody pro LAL a referenčního přípravku endotoxinu ve dvojnásobné koncentraci, než je vyznačená citlivost lyzátu, je ověřit aktuální citlivost lyzátu v podmínkách zkoušky. Účelem negativní kontroly je ověřit nepřítomnost měřitelné koncentrace endotoxinu ve vodě pro LAL.

Druhá pozitivní kontrola, která obsahuje zkoušený přípravek v koncentraci použité ve zkoušce, je zařazena proto, aby byla prokázána nepřítomnost interferujících faktorů v průběhu a v podmínkách prováděné zkoušky.

• 1. Hodnocení a interpretace výsledků

Jak je uvedeno v úvodním odstavci textu, zkouška s lyzátem z amebocytů se používá jako limitní test a stanovení limitu závisí na popsaných faktorech. Nepatrné množství endotoxinu ve vodě pro LAL nebo v některém jiném zkoumadle nebo materiálu, jemuž je vystaven lyzát při zkoušce, nemusí být zjištěno, pokud nedosáhne limitu citlivosti lyzátu. Může však zvyšovat množství endotoxinu v roztoku se zkoušeným přípravkem právě na hranici hodnoty citlivosti lyzátu a způsobovat pozitivní reakci.

Riziko tohoto případu lze snížit přezkoušením vody pro LAL a ostatních zkoumadel a materiálů s co nejcitlivějším lyzátem, který je dostupný, nebo s takovým, který je mnohem citlivější, než je lyzát použitý pro zkoušený přípravek. Ani takto nelze zcela vyloučit riziko falešně pozitivního výsledku. Tento postup by měl být zařazen, aby byla zajištěna bezpečná interpretace výsledků oproti případu falešně negativního testu, který může vést k propuštění nevyhovujícího přípravku ohrožujícího zdraví pacienta.

• 1. Náhrada zkoušky na pyrogenní látky na králících nebo zkoušky na endotoxin předepsané v lékopisném článku

V článcích na přípravky pro parenterální použití, které mohou obsahovat toxická množství bakteriálních endotoxinů, se požaduje buď zkouška na pyrogenní látky na králících, nebo zkouška na bakteriální endotoxiny. Je-li předepsána zkouška na bakteriální endotoxiny a není uvedena žádná z pěti metod (A až E) popsaných ve stati 2.6.14, pak se pro tento přípravek validovala gelová limitní metoda A. Je-li uvedena jedna z dalších metod (B až E), je to ta, která byla validována pro tento přípravek. Náhrada zkoušky na pyrogenní látky na králících zkouškou na bakteriální endotoxin nebo náhrada uvedené či předpokládané metody na stanovení endotoxinu jinou metodou je považována za použití alternativní metody místo lékopisné zkoušky, jak je uvedeno v části

• 1. Obecné zásady:

Zkoušky na čistotu a stanovení obsahu nebo účinnosti popsané v lékopisu jsou oficiální metody, na nichž jsou založeny lékopisné normy. Se souhlasem oprávněné autority se pro kontrolní účely mohou použít alternativní analytické metody za předpokladu, že bude dosaženo shody s metodami oficiálními. V případě pochybností nebo sporu jsou rozhodující pouze oficiální metody analýzy.

Pro validaci jiné zkoušky na bakteriální endotoxin, než je obsažena nebo určena v lékopisném článku, jsou navrženy následující postupy:

• 11.1 Postup, materiály a zkoumadla používané v metodě se validují, jak je popsáno v příslušné zkoušce.

• 11.2 Přítomnost interferujících faktorů (a je-li to třeba, postupy k jejich odstranění) se prověří na vzorkách nejméně ze tří výrobních šarží. Je vhodné pamatovat na to, že metody D a E používají chromogenní peptid a vyžadují zkoumadla, která chybějí u metody A, B a C, takže vyhovující výsledek v metodě A, B nebo C v metodě na interferující faktory nelze vztáhnout na metodu D nebo E bez dalšího zkoušení.

• 11.3 Jestliže jsou dostupné vzorky z výrobní šarže, které ve zkoušce na pyrogenní látky na králících byly pozitivní, měly by se také přezkoušet na bakteriální endotoxiny metodou, o níž se uvažuje jako o alternativní. Nejsou-li tyto vzorky dostupné, pak je rozhodující zkouška na pyrogenní látky a zkouška na bakteriální endotoxiny zbytečná.

• 1. Validace zkoušky pro nové přípravky

Postup uvedený v části 11.1 a 11.2 se použije u všech nových přípravků pro parenterální podání, které se mají zkoušet na přítomnost bakteriálních endotoxinů podle požadavků lékopisu.

• 1. Nové přípravky ovlivňující tělní teplotu

Jestliže se u nového přípravku během jeho vývoje ukáže, že by mohl ovlivňovat tělní teplotu, je možno použít jednu z metod (A až E) k důkazu nepřítomnosti bakteriálních endotoxinů; zejména kvantitativní metoda (B, C, D nebo E) může dát užitečnou informaci. V tomto případě se postupuje, jak je uvedeno v části 11.1 a 11.2. Avšak jsou-li patrné známky kontaminace přípravku neendotoxinovými pyrogenními látkami, je nutno získat podklady z mnohem rozsáhlejšího zkoušení.

2.6.16 Důkaz cizích antigenů v humánních virových vakcínách

Pokud tyto zkoušky vyžadují nejprve neutralizaci viru, použijí se specifické protilátky, které nejsou humánního ani opičího původu: jestliže byl virus pomnožen na tkáni ptačího původu, nemohou to být ani protilátky ptačího původu. K přípravě antiséra se užívá imunizační antigen připravený na buněčné kultuře z odlišného druhu, než je kultura užívaná pro přípravu vakcíny a prosté cizích agens. Jestliže je předepsáno použití SPF vajec, tato vejce se získávají z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2).

Virové inokulum

Vzorky virového inokula se odeberou při sklizni, a jestliže se ihned nezkoušejí, uchovávají se při teplotě nižší než –40 °C.

Dospělé myši. Každé z nejméně deseti dospělých myší o hmotnosti 15 g až 20 g se vstříkne intracerebrálně 0,03 ml a intraperitoneálně 0,5 ml virového inokula. Myši se pozorují nejméně 21 dní. U všech myší uhynulých po uplynutí prvních 24 h, nebo které mají příznaky nemoci, se provede pitva, aby se odhalily známky infekčního onemocnění. Postupuje se jednak makroskopickým pozorováním, jednak přeočkováním vhodné tkáňové suspenze intracerebrálně a intraperitoneálně nejméně dalším pěti dospělým myším, které se pozorují 21 dní. Virové inokulum vyhovuje, jestliže žádná myš nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných myší.

Sající myši. Každé z nejméně dvaceti myší mladších než 24 h se vstříkne intracerebrálně 0,01 ml a intraperitoneálně 0,1 ml virového inokula. Myši se pozorují denně nejméně 14 dní. U všech myší uhynulých po uplynutí prvních 24 h, nebo které mají příznaky nemoci, se provede pitva, aby se odhalily známky infekčního onemocnění. Postupuje se jednak makroskopickým pozorováním, jednak přeočkováním vhodné tkáňové suspenze intracerebrálně a intraperitoneálně nejméně dalším pěti sajícím myším, které se denně pozorují 14 dní. Virové inokulum vyhovuje, jestliže žádná sající myš nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných sajících myší.

Morčata. Nejméně pěti morčatům o hmotnosti 350 g až 450 g se vstříkne intraperitoneálně po 5 ml virového inokula. Zvířata se pozorují nejméně 42 dní, aby se odhalily všechny příznaky nemoci. U všech zvířat, která po uplynutí prvních 24 h uhynou, nebo která mají příznaky nemoci, se provede pitva s makroskopickým vyšetřením; tkáně se vyšetří mikroskopicky a kultivačně na přítomnost infekce. Zvířata, která přežila dobu pozorování, se usmrtí a vyšetří se stejným způsobem. Virové inokulum vyhovuje, jestliže žádné morče nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných morčat.

Virové inokulum a sklizený virus

Vzorky se odeberou při sklizni, a jestliže se ihned nezkoušejí, uchovají se při teplotě nižší než –40 °C.

Bakteriální a houbová sterilita. 10 ml vzorku vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).

Mykoplazmata. 10 ml vzorku vyhovuje zkoušce na mykoplazmata (2.6.7).

Mykobakterie (2.6.2). 5 ml vzorku se zkouší na přítomnost Mycobacterium spp. kultivačními metodami uznanými za citlivé pro detekci těchto organismů.

Zkoušky na jiná cizí agens na tkáňových kulturách. Množství neutralizovaného vzorku, jestliže není předepsáno jinak, které odpovídá 500 lidských dávek nebo 50 ml vakcíny, podle toho, co je více, se zkouší na přítomnost cizích agens naočkováním do kultur buněk kontinuální linie opičí ledviny a lidských buněk. Jestliže virus rostl na lidských diploidních buňkách, neutralizovaný sklizený virus se také zkouší na oddělené kultuře diploidních buněk. Jestliže byl vakcinační virus pomnožován v buněčném systému jiném než opičím nebo lidském, naočkují se také buňky tohoto druhu, ale z odlišné šarže. Tyto buňky se kultivují při 36 °C ± 1 °C a prohlížejí se 14 dní. Virové inokulum nebo sklizený virus vyhovují, jestliže žádná z buněčných kultur nevykazuje známky přítomnosti jakéhokoli cizího agens, jež nelze přičíst náhodné kontaminaci. Zkoušku lze hodnotit, jestliže přežívá nejméně 80 % buněčných kultur.

Ptačí viry (pouze pro viry pomnožené na tkáni ptačího původu). Neutralizuje se množství vzorku odpovídající bud’ 100 lidským dávkám, nebo 10 ml, podle toho, co je více. Na jedno kuřecí embryo se použije 0,5 ml. Skupina oplozených SPF vajec 9 až 11 dní starých se inokuluje alantoidní cestou a druhá skupina, 5 až 7 dní starých, do žloutkového vaku. Inkubuje se 7 dní. Virové inokulum nebo sklizený virus vyhovují, jestliže alantoidní tekutiny ani tekutiny žloutkového vaku nevykazují přítomnost hemaglutinačního agens a jestliže všechna embrya a chorioalantoidní membrány makroskopicky vyšetřené, jsou normální. Zkoušku lze hodnotit, jestliže nejméně 80 % embryí přežije 7 dní.

Kultura produkčních buněk: kontrolní buňky

Aby se ověřila nepřítomnost virů způsobujících cytopatickou degeneraci, posuzují se kontrolní buňky mikroskopicky buď po celou dobu inkubace, nebo po nejméně 14 dní od naočkování výrobních nádob, podle toho, která doba je delší. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % kontrolních kultur.

Po 14 dnech nebo v čase poslední sklizně, podle toho, které období je delší, se provedou dále popsané zkoušky.

Zkouška na hemadsorbující viry. Nejméně 25 % kontrolních kultur se zkouší na přítomnost hemadsorbujících virů přidáním morčecích červených krvinek. Jestliže jsou morčecí krvinky skladovány, uchovávají se nejdéle 7 dní při 5 °C ± 3 °C. Polovina kultur se odečítá po 30 min inkubace při 5 °C ± 3 °C, druhá polovina po 30 min inkubace při 20 °C až 25 °C. Nezjistí se přítomnost hemadsorbujících agens.

Zkouška na jiná cizí agens v tkáňových kulturách. Směs supernatantních tekutin z kontrolních buněk se zkouší na přítomnost cizích agens naočkováním do kultur buněk opičí ledviny a lidských buněk. Jestliže byl vakcinační virus pomnožován v buněčném systému jiném než opičím nebo lidském, naočkují se také buňky tohoto druhu, ale z odlišné šarže. V každém buněčném systému se zkouší nejméně 5 ml. Naočkované kultury se inkubují při 36 °C ± 1 °C a pozorují se 14 dní. Nezjistí se přítomnost cizího agens.

Jestliže se kultura produkčních buněk uchovává při jiné teplotě než 36 °C ± 1 °C, provede se doplňující zkouška na cizí agens při produkční teplotě na buňkách stejného typu, jaký se použil pro pomnožení viru.

Viry ptačí leukózy (pouze pro viry pomnožené na tkáni ptačího původu). Zkouška na viry ptačí leukózy se provede s 5 ml supernatantní tekutiny z kontrolních buněk.

Kontrolní vejce

Hemaglutinační agens. 0,25 ml alantoidní tekutiny z každého vejce se zkouší na přítomnost hemaglutinačního agens přímým smísením s kuřecími červenými krvinkami. Po pasáži na SPF vejcích se postupuje takto: 5 ml vzorku ze směsi amniových tekutin z kontrolních vajec se naočkuje po 0,5 ml do alantoidních dutin a do amniových dutin SPF vajec. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže se v žádné z obou zkoušek nezjistí známky přítomnosti hemaglutinačních agens.

Viry ptačí leukózy. Použije se 10 ml směsné amniové tekutiny z kontrolních vajec. Provede se rozhojnění pěti pasážemi na buněčných kulturách z kuřecích embryí, které prokazatelně neobsahují viry ptačí leukózy; zkouška na přítomnost ptačí leukózy se provede použitím buněk z páté pasáže. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže se zkouškou neprokážou žádné známky přítomnosti viru ptačí leukózy.

Ostatní cizorodá agens. 5 ml směsné amniotické tekutiny z kontrolních vajec se naočkuje do lidských a opičích buněčných kultur. Buněčné kultury se pozorují 14 dní. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže se nezjistí přítomnost cizích agens. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % naočkovaných kultur.

2.6.21 Techniky amplifikace nukleových kyselin

• 1 Úvod

Techniky amplifikace nukleových kyselin jsou založeny na dvou rozdílných přístupech:

• 1. amplifikace cílové sekvence nukleové kyseliny používající např. polymerasovou řetězovou reakci (PCR), ligasovou řetězovou reakci (LCR) nebo izotermální amplifikaci ribonukleové kyseliny (RNK),

• 1. amplifikace hybridizačního signálu používající např. pro kyselinu deoxyribonukleovou metodu tzv. větvené DNK (bDNK). V tomto případě se amplifikace signálu docílí bez vystavení nukleové kyseliny opakovaným amplifikačním cyklům.

V této všeobecné kapitole se jako referenční technika popisuje metoda PCR. Mohou se používat alternativní metody, pokud splňují dále popsané požadavky na kvalitu.

• 2 Rozsah působnosti

Tato stať zavádí požadavky na přípravu vzorku, na amplifikaci sekvencí DNK in vitro a na detekci specifického produktu PCR. Za pomoci PCR se mohou detegovat definované sekvence DNK. Rovněž sekvence RNK se mohou detegovat po reverzní transkripci RNK na komplementární DNK (cDNK) a následné amplifikaci.

• 3 Princip metody

PCR je postup umožňující in vitro specifickou amplifikaci segmentů DNK nebo segmentů RNK po jejich reverzní transkripci na cDNK.

Po denaturaci dvouřetězcové DNK na jednořetězcovou DNK dva syntetické oligonukleotidové primery opačné polarity se přihybridizují k odpovídajícím komplementárním sekvencím DNK, která má být amplifikována. Krátké dvouřetězcové úseky, které jsou výsledkem specifického párování mezi primerem a komplementární sekvencí DNK, ohraničují segment DNK, který bude amplifikován a slouží jako výchozí body pro syntézu DNK in vitro pomocí tepelně stabilní DNK polymerasy.

Amplifikace DNK probíhá v cyklech, které tvoří:

• tepelná denaturace nukleové kyseliny (cílové sekvence) na dva jednoduché řetězce,

• specifické přihybridizování primerů k cílové sekvenci za vhodných reakčních podmínek,

• prodloužení primerů, které jsou navázány na oba jednoduché řetězce, DNK polymerasou při vhodné teplotě (syntéza DNK).

Opakované cykly tepelné denaturace, přihybridizování primerů a syntéza DNK vedou k exponenciální amplifikaci segmentu DNK omezeného primery.

Specifický produkt PCR známý jako amplikon může být detegován různými metodami s vhodnou specifitou a citlivostí.

• 4 Zkoušený materiál

Z důvodu vysoké citlivosti PCR je nutno vzorky optimálně chránit před vnější kontaminací cílovými sekvencemi.

Vzorkování, uchovávání a doprava zkoušeného materiálu se provádějí za podmínek minimalizujících degradaci cílové sekvence. Pro cílové sekvence RNK je třeba zvláštní opatrnost, neboť RNK je vysoce citlivá na degradaci ribonukleasami. Je třeba věnovat pozornost i tomu, že některé přidávané látky, jako jsou zkoumadla, antikoagulancia nebo konzervační látky, mohou interferovat v postupu zkoušky.

• 5 Zkušební metoda

• 5.1 Zamezení kontaminaci

Riziko kontaminace vyžaduje přísné oddělení prostor podle zpracovávaného materiálu a používané technologie. Faktory, které je třeba uvážit, jsou pohyb personálu, pracovní oděv, pohyb materiálu, větrání a dekontaminační postupy.

Systém se má rozdělit do několika oddělení, jako jsou např.:

• prostor, kde se připravují základní zkoumadla, jako jsou např. primery, tlumivé roztoky, a kde se zachází výhradně s materiály neobsahujícími matrice,

• pre-PCR - prostor, kde se zachází se zkoumadly, vzorky a kontrolami,

• PCR-amplifikace - s amplifikovaným materiálem se zachází v uzavřeném systému,

• detekce post-PCR - jediný prostor, kde se zachází s amplifikovaným materiálem v otevřeném systému.

• 5.2 Příprava vzorku

Při přípravě vzorku se cílová sekvence extrahuje nebo uvolňuje z testovaného materiálu účinným a reprodukovatelným způsobem tak, aby bylo možné za zvolených reakčních podmínek provést amplifikaci.

Mohou se použít různé způsoby fyzikálně-chemické extrakce anebo obohacovací metody. Aditivá přítomná ve zkoušeném materiálu mohou interferovat s PCR. Pro kontrolu nepřítomnosti inhibitorů pocházejících ze zkoušeného materiálu se použijí postupy uvedené v odstavci 7.3.2.

V případě matric RNK je třeba zabránit působení ribonukleas.

• 5.3 Amplifíkace

Amplifikace cílové sekvence metodou PCR se provádí opakovanými cykly v optimalizovaných podmínkách (teplotní profil pro denaturaci dvouřetězcové DNK, přihybridizování primerů a jejich prodlužování, inkubační časy při zvolených teplotách, rychlost nabíhání zvolených teplot).

Tyto podmínky závisejí na různých parametrech, jako jsou:

• délka a složení bází primerů a cílových sekvencí;

• typ DNK polymerasy, složení tlumivého roztoku a reakční objemy použité pro amplifikaci;

• typ použitého termocykleru a koeficient teplotní vodivosti mezi přístrojem, reakční zkumavkou a reagující tekutinou.

• 5.4 Detekce

Amplikon vytvořený PCR se může identifikovat velikostí, sekvencí, chemickou modifikací nebo kombinací těchto parametrů. Charakterizace na základě velikosti se může dosáhnout gelovou elektroforézou (použije se vrstva agarosového nebo polyakrylamidového gelu nebo kapilární elektroforéza), nebo chromatografií na koloně (např. HPLC). Charakterizace na základě složení sekvencí se může provést specifickou hybridizací vzorků majících komplementární sekvence k cílové sekvenci nebo štěpením amplifikovaného materiálu restrikčním enzymem ve specifických místech pro cílovou sekvenci.

Charakteristika chemickou modifikací se může provést např. inkorporací fluoroforu do amplikonu a následnou detekcí fluorescence po excitaci.

Detekce amplikonů se může provést použitím značených vzorků umožňujících následnou radioizotopovou nebo imunoenzymatickou detekci.

• 6 Hodnocení a interpretace výsledků