Vyhláška Ministerstva zemědělství, kterou se stanoví požadavky na odběr vzorků a principy metod laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů a způsob uchovávání vzorků

od 10 do 20 μg/kg	25 % relat. z nejvyššího výsledku
od 20 do 50 μg/kg	5 μg/kg
nad 50 μg/kg	10 % relat. z nejvyššího výsledku

Reprodukovatelnost

Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu aflatoxinu

od 10 do 20 μg/kg	50 % relat.
od 20 do 50 μg/kg	10 μg/kg
nad 50 μg/kg	20 % relat.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 10 μg/kg.

Metoda B

Metoda se používá pro stanovení aflatoxinu B1 v živočišných krmivech včetně krmiv obsahujících citrusovou slupku. Mez stanovitelnosti je 0,001 mg/kg.

Vzorek se extrahuje chloroformem. Extrakt se zfiltruje a alikvotní podíl se přečistí na florisilové kolonce a potom na kolonce C18. Konečná separace a stanovení se provede vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi C18, následné postkolonové derivatizaci vodným roztokem jodu a fluorescenční detekci.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 11 % relat.

Reprodukovatelnost

Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu aflatoxinu B1:

do 10 μg/kg	50 % relat.
od 20 μg/kg do 50 μg/kg	10 μg/kg
nad 50 μg/kg	20 % relat.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 1 μg/kg.

• 10.12. Stanovení obsahu arsenu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení arsenu v krmivech.

Ve vzorku se po rozkladu kyselinou dusičnou v uzavřeném systému stanoví obsah arsenu metodou atomové absorpční spektrometrie (AAS) s hydridovou technikou.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu arsenu nad 1 mg/kg hodnotu 6 % relativních.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

• 10.13. Stanovení obsahu gossypolu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu volného a celkového gossypolu a chemicky příbuzných látek v koncentraci nad 20 mg/kg v bavlníku a krmných směsích, které bavlník obsahují.

Gossypol se extrahuje buď za přítomnosti 3-amino-1-propanolu (při stanovení volného gossypolu) nebo dimethylformamidu (při stanovení celkového gossypolu). Gossypol je reakcí s anilinem převeden na gossypol-dianilid a absorbance roztoku je měřena při 440 nm.

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

• 10.14. Stanovení obsahu theobrominu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení theobrominu v krmivech.

Obsah theobrominu se stanoví po extrakci vzorku směsným rozpouštědlem chloroformamoniak metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) na reverzní fázi.

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Nestanovena.

• 1. Zkoušení siláží

• 11.1. Zkoušení jakosti siláží

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro zkoušení jakosti konzervace silážovaných krmiv. Uvedené postupy zkoušení jsou použitelné pro všechny druhy silážovaných krmiv.

Ze vzorku siláže se připraví vodní výluh. Ve výluhu se určí hodnota pH elektrometricky, obsah amoniaku se stanoví difusní Conwayovou metodou, obsah alkoholu se stanoví metodou plynové chromatografie a obsah silážních kyselin metodou kapilární izotachoforézy.

Stanovení stlačitelnosti u řízkových siláží se provádí z upraveného vzorku.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit u stanovení

pH	0,05
formolové titrace	0,1 g/kg
obsahu amoniaku jako NH3	0,1 g/kg
obsahu silážních kyselin	1,0 g/kg

U stanovení obsahu alkoholu a stlačitelnosti siláží opakovatelnost nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Příloha č. 10 k vyhlášce č. 124/2001 Sb.

Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů

Seznam chemických metod laboratorního zkoušení doplňkových látek, premixů a krmných směsí s doplňkovými látkami a premixy

1.	Stimulátory růstu
1.1.	Stanovení obsahu avilamycinu
1.2.	Stanovení obsahu olachindoxu, metoda převzatá ze směrnice Komise 98/64/ES
1.3.	Stanovení obsahu monensinu
1.4.	Stanovení obsahu salinomycinu
1.5.	Stanovení obsahu tylosinu, metoda převzatá ze směrnice Komise 72/199/EHS
1.6.	Stanovení obsahu zinkbacitracinu, metoda převzatá ze směrnice Komise 84/4/EHS
1.7.	Stanovení obsahu flavofosfolipolu, metoda převzatá ze směrnice Komise 78/633/EHS
1.8.	Stanovení obsahu avoparcinu, metoda převzatá ze směrnice Komise 81/715/EHS
1.9.	Stanovení obsahu monensinu, metoda převzatá ze směrnice Komise 81/715/EHS
1.10.	Stanovení obsahu spiramycinu, metoda převzatá ze směrnice Komise 84/425/EHS
1.11.	Stanovení obsahu virginiamycinu, metoda převzatá ze směrnice Komise 84/4/EHS
2.	Antikokcidika
2.1.	Stanovení obsahu amprolia, metoda převzatá ze směrnice Komise 99/27/ES
2.2.	Stanovení obsahu maduramicinu
2.3.	Stanovení obsahu methylbenzochátu, metoda převzatá ze směrnice Komise 93/117/ES
2.4.	Stanovení obsahu narasinu
2.5.	Stanovení obsahu nikarbazinu
2.6.	Stanovení obsahu robenidinu, metoda převzatá ze směrnice Komise 93/117/ES
2.7.	Stanovení obsahu meticlorpindolu
2.8.	Stanovení obsahu salinomycinu - je uvedeno v Příloze 10, část 1
2.9.	Stanovení obsahu monensinu - je uvedeno v Příloze 10, část 1
2.10.	Stanovení obsahu halofuginonu, metoda převzatá ze směrnice Komise 93/70/EHS
2.11.	Stanovení obsahu ethopabátu
2.12.	Stanovení obsahu semduramicinu
2.13.	Stanovení obsahu diclazurilu, metoda převzatá ze směrnice Komise 99/27/ES
2.14.	Stanovení obsahu carbadoxu, metoda převzatá ze směrnice Komise 99/27/ES
2.15.	Stanovení obsahu olachindoxu je uvedeno v Příloze 10, část 1
2.16.	Stanovení obsahu lasalocidu, metoda převzatá ze směrnice Komise 99/76/ES
3.	Chemoterapeutika
3.1.	Stanovení obsahu dimetridazolu
4.	Vitaminy
4.1.	Stanovení obsahu cholinu
4.2.	Stanovení obsahu pantothenanu vápenatého
4.3.	Stanovení obsahu vitaminu B1, B2, B6
4.4.	Stanovení obsahu vitaminu B2
4.5.	Stanovení obsahu vitaminu B6
4.6.	Stanovení obsahu vitaminu A, metoda převzatá ze směrnice Komise 2000/45/ES
4.7.	Stanovení obsahu vitaminu E, metoda převzatá ze směrnice Komise 2000/45/ES
4.8.	Stanovení obsahu vitaminu D
5.	Mikroprvky
5.1.	Stanovení obsahu mědi, železa, manganu a zinku - je uvedeno v příloze 9, část 8
5.2.	Stanovení obsahu kobaltu
5.3.	Stanovení obsahu selenu
6.	Výpočty
6.1.	Vyhodnocování a výpočet výsledků stanovení obsahu doplňkových látek pro difúzní plotnové postupy
7.	Barviva
7.1.	Stanovení obsahu β-karotenu spektrofotometrickou metodou
8.	Mikrobiotika
8.1.	Stanovení počtu zárodků bakterií rodu Streptococcus
8.2.	Stanovení počtu zárodků bakterií rodu Bacillus

• 1. Stimulátory růstu

• 1.1. Stanovení obsahu avilamycinu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu avilamycinu v krmivech a premixech.

Obsah avilamycinu se stanoví po extrakci ze zkušebního vzorku chloroformem a přečištění extraktu na pevné fázi Silica, vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi C18 s gradientovou elucí a UV detekcí při λ = 295 nm.).

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Nestanovena.

• 1.2. Stanovení obsahu olachindoxu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu olachindoxu v krmivech. Obsah olachindoxu se stanoví po extrakci směsí methanol - voda vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s UV-detekcí.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu olachindoxu 10 až 20 mg/kg 15 % relat. z hodnoty vyššího výsledku.

Reprodukovatelnost

Je uvedena u metody.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 5 mg/kg.

• 1.3. Stanovení obsahu monensinu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu monensinu v krmivech a premixech.

Obsah monensinu se stanoví po extrakci směsným rozpouštědlem, extrakt je přečištěn na pevné fázi a takto přečištěný extrakt je rozpuštěn v definovaném objemu mobilní fáze. Monensin se stanovuje vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi a po postkolonové derivatizaci s p-dimethylaminobenzaldehydem při 90 °C je detekován UV-detektorem při vlnové délce 600 nm.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu monensinu:

do 25 mg/kg	20 % relat.
od 25 do 50 mg/kg	5 mg/kg
od 50 do 100 mg/kg	10 % relat.
od 100 do 200 mg/kg	10 mg/kg
nad 200 mg/kg	5 % relat.

Reprodukovatelnost

Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu monensinu:

do 25 mg/kg	40 % relat.
od 25 do 50 mg/kg	10 mg/kg
od 50 do 100 mg/kg	20 % relat.
od 100 do 200 mg/kg	20 mg/kg
nad 200 mg/kg	10 % relat.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 0,2 mg/kg.

• 1.4. Stanovení obsahu salinomycinu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu salinomycinu v krmivech a premixech.

Obsah salinomycinu se stanoví po extrakci směsným rozpouštědlem, extrakt je přečištěn na pevné fázi a takto přečištěný extrakt je rozpuštěn v definovaném objemu mobilní fáze. Salinomycin se stanovuje vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi a po postkolonové derivatizaci s p-dimethylaminobenzaldehydem při 90 °C je detekován UV-detektorem při vlnové délce 600 nm.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu salinomycinu:

do 25 mg/kg	20 % relat.
od 25 do 50 mg/kg	5 mg/kg
od 50 do 100 mg/kg	10 % relat.
od 100 do 200 mg/kg	10 mg/kg
nad 200 mg/kg	5 % relat

Reprodukovatelnost

Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu salinomycinu:

do 25 mg/kg	40 % relat.
od 25 do 50 mg/kg	10 mg/kg
od 50 do 100 mg/kg	20 % relat.
od 100 do 200 mg/kg	20 mg/kg
nad 200 mg/kg	10 % relat.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 1,4 mg/kg.

• 1.5. Stanovení obsahu tylosinu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení tylosinu v krmivech, koncentrátech a premixech od obsahu 2 mg/kg.

Vzorek se podrobí působení fosfátového pufru pH 8 zahřátého na 80 °C, potom se extrahuje methanolem. Po odstředění se extrakt naředí a jeho antibiotická aktivita se stanoví změřením difúze tylosinu na agaru s Kocuria rhizophila (CCM 552). V přítomnosti mikroorganizmu se difúze projevuje tvorbou inhibičních zón. Průměr těchto zón je přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 10 % relat.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 2 mg/kg.

• 1.6. Stanovení obsahu zinkbacitracinu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení zinkbacitracinu v krmivech a premixech.

Vzorek se extrahuje při pH 2 směsí methanol-voda-kyselina chlorovodíková a roztokem síranu sodného. Přidání síranu sodného slouží k vysrážení rozpustných solí mědi, které mohou při stanovení rušit. Extrakt se upraví na pH 6,5, zakoncentruje se (je-li to nezbytné) a naředí. Jeho antibiotická aktivita se stanovuje měřením difúze zinkbacitracinu v agaru, do něhož byl naočkován mikroorganismus Micrococcus luteus (CCM 732). Difúze se projevuje vytvořením inhibičních zón. Průměr těchto zón se považuje za přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika v rozsahu použitých koncentrací.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu zinkbacitracinu:

od 5 do 10 mg/kg	2 mg/kg
od 10 mg/kg do 25 mg/kg	20 % relat. z vyššího výsledku
od 25 mg/kg do 50 mg/kg	5 mg/kg
nad 50 mg/kg	10 % relat. z vyššího výsledku

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 5 mg/kg.

• 1.7. Stanovení obsahu flavofosfolipolu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení flavofosfolipolu v krmivech, koncentrátech a premixech.

Vzorek se extrahuje zředěným methanolem za varu pod zpětným chladičem. Po odstředění se extrakt přečistí (pokud je to třeba) na ionexu a naředí. Antibiotická aktivita vzorku se stanoví měřením difúze flavofosfolipolu do agarové půdy, zaočkované mikroorganismem Staphylococcus aureus (CCM 2022). Difúze se projeví tvorbou inhibičních zón. Průměr těchto zón se považuje za přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika v rozsahu použitých koncentrací.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí při obsahu flavofosfolipolu překročit

od 1 do 2 mg/kg	0,5 mg/kg
od 2 do 10 mg/kg	25 % relat. z vyššího výsledku
od 10 do 25 mg/kg	20 % relat. z vyššího výsledku
od 25 do 50 mg/kg	5 mg/kg
nad 50 mg/kg	10 % relat. z vyššího výsledku

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 1 mg/kg.

• 1.8. Stanovení obsahu avoparcinu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení avoparcinu v krmivech a premixech.

Přítomnost polyetherických antibiotik může na stanovení působit rušivě.

Vzorek se extrahuje směsí aceton-voda-kyselina chlorovodíková. Antibiotická aktivita extraktu se stanoví měřením difúze avoparcinu v živném agaru zaočkovaném mikroorganismem Bacillus subtilis (CCM 1999). Difúze se dokáže vznikem inhibičních zón mikroorganismu. Průměr těchto zón se považuje za přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika v rozsahu použitých koncentrací.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu avoparcinu:

do 10 mg/kg	2 mg/kg
od 10 do 25 mg/kg	20 % relat. z vyššího výsledku
od 25 do 50 mg/kg	5 mg/kg
nad 50 mg/kg	10 % relat. z vyššího výsledku

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 2 mg/kg.

• 1.9. Stanovení obsahu monensinu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu monensinu v krmivech a premixech.

Vzorek se extrahuje 90 % methanolem. Extrakt se podrobí vhodnému postupu podle obsahu monensinátu sodného ve vzorku. Jeho antibiotická aktivita se stanoví měřením difúze monensinátu sodného v agarové živné půdě zaočkované mikroorganismem Bacillus subtilis (CCM 1999). Difúze se projeví vznikem inhibičních zón testovacího organismu. Průměr těchto inhibičních zón je v rozsahu použitých koncentrací považován za přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika. Citlivost Metodau je snížena přítomností sodných iontů.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu monensinu:

do 25 mg/kg	20 % relat. z vyššího výsledku
od 25 do 50 mg/kg	5 mg/kg
nad 50 mg/kg	10 % relat. z vyššího výsledku

Reprodukovatelnost

Nestanovena

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 10 mg/kg.

• 1.10. Stanovení obsahu spiramycinu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu spiramycinu v krmivech a premixech.

Vzorek se extrahuje směsným roztokem methanol-fosfátouhličitanovým tlumivým roztokem pH 8,0. Extrakt se dekantuje nebo odstředí a naředí. Antibiotická aktivita se stanoví měřením difúze spiramycinu v agarové půdě zaočkované mikroorganismem Bacillus subtilis (CCM 1999). Difúze se projeví tvorbou inhibičních zón mikroorganismu. Průměr zón se považuje za přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika v rozsahu použitých koncentrací.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu spiramycinu:

do 10 mg/kg	2 mg/kg
od 10 do 25 mg/kg	20 % relat. z vyššího výsledku
od 25 do 50 mg/kg	5 mg/kg
nad 50 mg/kg	10 % relat. z vyššího výsledku

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 1 mg/kg.

• 1.11. Stanovení obsahu virginiamycinu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu virginiamycinu v krmivech a premixech.

Vzorek je extrahován methanolickým roztokem Tween 80. Extrakt se dekantuje nebo odstředí a potom vhodně naředí. Jeho antibiotická aktivita se stanovuje měřením difúze virginiamycinu v agaru, do něhož byl naočkován mikroorganismus Kocuria rhizophila (CCM 552). Difúze se projevuje vytvořením inhibičních zón. Průměr těchto zón se považuje za přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika v rozsahu použitých koncentrací.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu virginiamycinu:

do 10 mg/kg	2 mg/kg
od 10 do 25 mg/kg	20 % relat. z vyššího výsledku
od 25 do 50 mg/kg	5 mg/kg
nad 50 mg/kg	10 % relat. z vyššího výsledku

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti 2 mg/kg.

• 1. Antikokcidika

• 2.1. Stanovení obsahu amprolia

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu amprolia v krmivech a premixech. Mez detekce je 1 mg/kg.

Vzorek se extrahuje směsí methanol - voda. Po zředění extraktu mobilní fází a membránové filtraci se obsah amprolia stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s výměnou kationtů a s UV detekcí.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu amprolia:

od 25 do 500 mg/kg	15 % relat. z vyššího výsledku
od 500 do 1000 mg/kg	75 mg/kg
nad 1 000 mg/kg	7,5 % relat. z vyššího výsledku

Reprodukovatelnost

Je uvedena u metody.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 25 mg/kg.

• 2.2. Stanovení obsahu maduramicinu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu maduramicinu v premixech.

Obsah maduramicinu se stanoví po extrakci vzorku extrakční směsí, následném přečištění na pevné fázi a postkolonové derivatizaci vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s použitím UV detekce při vlnové délce 598 nm

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu maduramicinu:

do 5 mg/kg	10 % relat.
od 800 do 1200 mg/kg	5 % relat.

Reprodukovatelnost

Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu maduramicinu:

do 10 mg/kg	30 % relat.
od 10 do 30 mg/kg	3 mg/kg.
nad 30 mg/kg	10 % relat.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 0,9 mg/kg.

• 2.3. Stanovení obsahu methylbenzochátu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu methylbenzochátu v krmivech a premixech.

Obsah methylbenzochátu se stanoví po extrakci vzorku methanolovým roztokem methansulfonové kyseliny, po přečištění extrakcí dichlormethanem je izolován na chromatografickém ionexovém sloupci a znovu extrahován dichlormethanem, nakonec stanoven vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s UV detekcí.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu methylbenzochátu od 4,0 do 20 mg/kg hodnotu 10 % relat. z vyššího výsledku.

Reprodukovatelnost

Je uvedena u metody.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 1 mg/kg.

• 2.4. Stanovení obsahu narasinu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu narasinu v krmivech a premixech.

Obsah narasinu se stanoví po extrakci směsným rozpouštědlem, extrakt je přečištěn na pevné fázi a takto přečištěný extrakt je rozpuštěn v definovaném objemu mobilní fáze. Narasin se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi a po postkolonové derivatizaci s p-dimethylaminobenzaldehydem při 90 °C je detekován UV-detektorem při vlnové délce 600 nm.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu narasinu:

do 25 mg/kg	20 % relat.
od 25 do 50 mg/kg	5 mg/kg
od 50 do 100 mg/kg	10 % relat.
od 100 do 200 mg/kg	10 mg/kg
nad 200 mg/kg	5 % relat.

Reprodukovatelnost

Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu narasinu

do 25 mg/kg	40 % relat.
od 25 do 50 mg/kg	10 mg/kg
od 50 do 100 mg/kg	20 % relat.
od 100 do 200 mg/kg	20 mg/kg
nad 200 mg/kg	10 % relat.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 1,4 mg/kg.

• 2.5. Stanovení obsahu nikarbazinu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení nikarbazinu v krmivech a premixech.

Nikarbazin se stanoví po extrakci ze vzorku extrakčním roztokem acetonitril – voda naředěním mobilní fází vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi (RP-HPLC) s isokratickou elucí na koloně C18 s UV detekcí při vlnové délce 351 nm.

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Nestanovena.

• 2.6. Stanovení obsahu robenidinu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení robenidinu v krmivech.

Vzorek se extrahuje okyseleným methanolem. Extrakt se vysuší a jeho alikvotní část se přečistí na koloně s oxidem hlinitým. Robenidin se eluuje z kolony methanolem, koncentruje se a na vhodný objem se upraví pomocí mobilní fáze. Obsah robenidinu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi pomocí UV detektoru.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí při obsahu robenidinu nad 15 mg/kg překročit 10 % relat. vyššího výsledku.

Reprodukovatelnost

Je uvedena u metody

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 5 mg/kg.

• 2.7. Stanovení obsahu meticlorpindolu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu meticlorpindolu v krmivech a premixech.

Obsah meticlorpindolu se stanoví po extrakci vzorku směsným rozpouštědlem methanolamoniak a po jeho převedení do mobilní fáze vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s UV detekcí při 265 nm.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu meticlorpindolu.

do 100 mg/kg	5 % relat.
od 100 do 200 mg/kg	5 mg/kg

Reprodukovatelnost

Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu meticlorpindolu:

od 50 do 200 mg/kg	15 % relat.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 3,6 mg/kg.

• 2.8. Stanovení obsahu salinomycinu

Metoda stanovení obsahu salinomycinu je uveden v příloze č. 10, část 1.

• 2.9. Stanovení obsahu monensinu

Metoda stanovení obsahu monensinu je uveden v příloze č. 10, část 1.

• 2.10. Stanovení obsahu halofuginonu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu halofuginonu v krmivech a premixech.

Obsah halofuginonu se stanoví jako volná base po extrakci horkou vodou do ethylacetátu a následně se rozdělí jako hydrochlorid do vodného kyselého roztoku. Extrakt se přečistí na ionexové chromatografické koloně. Obsah halofuginonu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s UV-detekcí.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu halofuginonu do 3 mg/kg hodnotu 0,5 mg/kg.

Reprodukovatelnost

Je uvedena u metody.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 1 mg/kg.

• 2.11. Stanovení obsahu ethopabátu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu ethopabátu v krmivech a premixech.

Obsah ethopabátu se stanoví po extrakci vzorku methanolem a přečištění chromatografií na pevné fázi vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s fluorescenční detekcí.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu ethopabátu:

do 1 mg/kg	40 % relat.
od 1 do 4 mg/kg	0,4 mg/kg
od 4 do 20 mg/kg	10 % relat.
od 20 do 1000 mg/kg	nestanovena
nad 1 000 mg/kg	5 % relat.

Reprodukovatelnost

Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu ethopabátu:

do 1 mg/kg	nestanovena
od 1 do 20 mg/kg	20 % relat.
od 20 do 1000 mg/kg	nestanovena
nad 1 000 mg/kg	15 % relat.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 0,03 mg/kg.

• 2.12. Stanovení obsahu semduramicinu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu semduramicinu v krmivech a premixech.

Obsah semduramicinu se stanoví po extrakci vzorku extrakční směsí, následném přečištění na pevné fázi a postkolonové derivatizaci vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s použitím UV detekce při vlnové délce 598 nm.

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Nestanovena.

• 2.13. Stanovení obsahu diclazurilu

Účel, rozsah a princip

Metoda určuje podmínky pro stanovení obsahu diclazurilu v krmivech a premixech. Mez detekce je 0,1 mg/kg.

Vzorek se po přidání interního standardu extrahuje okyseleným methanolem. U krmiv se alikvotní část extraktu přečistí na SPE patroně C18. Diclazuril se z patronky eluuje směsí okyseleného methanolu a vody. Po odpaření se zbytek rozpustí ve směsi dimethylformamidu a vody. U premixů se extrakt odpaří a zbytek se rozpustí ve směsi dimethylformamidu a vody. Obsah diclazurilu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s ternárním gradientem a UV-detekcí.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu diclazurilu:

do 2,5 mg/kg	30 % relat. z vyššího výsledku
od 2,5 do 5 mg/kg	0,75 mg/kg
nad 5 mg/kg	15 % relat. z vyššího výsledku

Reprodukovatelnost

Je uvedena u metody.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 0,5 mg/kg.

• 2.14 Stanovení obsahu carbadoxu

Účel, rozsah a princip

Metoda určuje podmínky pro stanovení obsahu carbadoxu v krmivech, premixech a doplňkových látkách. Mez detekce je 1 mg/kg.

Vzorek se zvlhčí vodou a extrahuje směsí methanol - acetonitril. Alikvotní podíl extraktu krmiva se po filtraci přečistí na koloně s oxidem hlinitým. Extrakt z premixů a doplňkových látek se přímo ředí na vhodnou koncentraci směsí voda - methanol - acetonitril. Obsah carbadoxu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi s UV detekcí.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu carbadoxu 10 mg/kg a vyšším 15 % relat. z hodnoty vyššího výsledku.

Reprodukovatelnost

Je uvedena u metody.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 10 mg/kg.

• 2.15. Stanovení obsahu olachindoxu

Metoda stanovení obsahu olachindoxu je uveden v příloze 10, část 1.

• 2.16. Stanovení obsahu lasalocidu

Účel, rozsah a princip

Metoda určuje podmínky pro stanovení obsahu sodné soli lasalocidu v krmivech, premixech a doplňkových látkách. Mez detekce je 5 mg/kg.

Lasalocid sodný se extrahuje ze vzorku okyseleným methanolem a stanoví se vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s fluorescenční detekcí.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu lasalocidu:

do 100 mg/kg	15 % relat. z vyššího výsledku
od 100 do 200 mg/kg	15 mg/kg
nad 200 mg/kg	7,5 % relat. z vyššího výsledku

Reprodukovatelnost

Je uvedena u metody.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 30 mg/kg.

• 1. Chemoterapeutika

• 3.1. Stanovení obsahu dimetridazolu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu dimetridazolu v krmivech a premixech.

Obsah dimetridazolu se stanoví po extrakci vzorku 90 % methanolem. Následně se přečistí na pevné fázi a stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s UV detekcí při 309 nm.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu dimetridazolu:

od 3 do 30 mg/kg	15 % relat.
od 30 do 100 mg/kg	5 mg/kg
nad 100 mg/kg	5 % relat.

Reprodukovatelnost

Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu dimetridazolu:

od 3 do 25 mg/kg	20 % relat.
od 25 do 50 mg/kg	5 mg/kg
nad 50 mg/kg	10 % relat.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 3 mg/kg.

• 1. Vitaminy

• 4.1. Stanovení obsahu cholinu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu cholinu v krmivech a premixech.

Obsah cholinu se stanoví po hydrolýze vzorku hydroxidem barnatým a přečištění hydrolyzátu na ionexu na základě vzniku komplexu s reineckátem amonným v prostředí roztoku fosforečnanu sodného spektrofotometricky po rozpuštění komplexu v acetonu při vlnové délce 525 nm. Alternativně je možno provádět stanovení cholinu metodou ITP.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit 10 % relat.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 20 mg/kg.

• 4.2. Stanovení obsahu pantothenanu vápenatého

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu pantothenanu vápenatého v premixech.

Obsah pantothenanu vápenatého se stanoví na základě stimulačního účinku na růst testovacího mikroorganismu Saccharomyces carlsbergensis CCM 4288 (ATCC 9080) difúzním plotnovým Metodaem.

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Nestanovena.

• 4.3. Stanovení vitaminů B1, B2, B6

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu vitaminů B1, B2, B6 v krmných směsích.

Vitaminy B1 (thiamin), B2 (riboflavin) a B6 (pyridoxin) se extrahují ze vzorku krmiva vodou a po hydrolýze kyselinou chloristou se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s využitím iontových párů na reverzní fázi. Detekce vitaminu B2, a B6 se provádí přímo fluorescenční detekcí, zatímco vitamin B1 se před detekcí nejprve oxiduje derivatizačním činidlem v reakční smyčce postkolonové derivatizace.

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Nestanovena.

• 4.4. Stanovení obsahu vitaminu B2

Účel, rozsah a princip

Používají se dvě metody stanovení obsahu vitaminu B2 v premixech - metoda fluorometrická a metoda difúzně plotnová.

Obsah vitaminu B2 se stanoví fluorometricky v mírně okyseleném prostředí na základě fluorescence při vlnové délce 440 nm nebo difúzně plotnovou metodou na základě stimulačního účinku na růst testovacího mikroorganismu Lactobacillus rhamnosus CCM 1825 (ATCC 7469).

Opakovatelnost

Pro metodu fluorometrickou nestanovena.

Pro metodu difuzní plotnovou:

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí při obsahu vitaminu B2 500 000 mg/kg překročit hodnotu 40 500 mg/kg.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Nestanovena.

• 4.5. Stanovení obsahu vitaminu B6

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu vitaminu B6 v premixech.

Vitamin B6 ve všech jeho formách se stanoví na základě stimulačního účinku na růst testovacího mikroorganismu kvasinky Saccharomyces carlsbergensis CCM 4228 (ATCC 9080) difúzním plotnovým způsobem.

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Nestanovena.

• 4.6. Stanovení obsahu vitaminu A

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu vitaminu A v krmivech a premixech. Vitamin A zahrnuje all-trans retinol a jeho cis izomery, které se touto metodou stanoví. Obsah vitaminu A se vyjadřuje v mezinárodních jednotkách (IU) na kg. Mezinárodní jednotka odpovídá aktivitě 0,3 μg all-trans vitaminu A (alkohol) nebo 0,344 μg all-trans vitamin A (acetát) nebo 0,550 μg all-trans vitaminu A (palmitát).

Vzorek se hydrolyzuje ethanolickým roztokem hydroxidu draselného a vitamin A se extrahuje petroletherem. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se rozpustí v methanolu a pokud je to nutné, naředí se na vhodnou koncentraci. Obsah vitaminu A se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi (RP-HPLC) s UV nebo fluorescenční detekcí. Chromatografické parametry jsou vybrány tak, aby nedocházelo k separaci all-trans vitaminu A (alkohol) a jeho cis izomerů.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 15 % relat. z hodnoty vyššího výsledku.

Reprodukovatelnost

Je uvedena u metody.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 2000 m.j./kg

• 4.7. Stanovení obsahu vitaminu E

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu vitaminu E v krmivech a premixech. Obsah vitaminu E se vyjadřuje jako mg DL-α-tokoferol acetátu na kg. 1 mg DL-α-tokoferol acetátu odpovídá 0,91 mg DL-α-tokoferolu (vitamin E).

Vzorek se hydrolyzuje ethanolickým roztokem hydroxidu draselného a vitamin E se extrahuje petroletherem. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se rozpustí v methanolu a pokud je to nutné, naředí se na vhodnou koncentraci. Obsah vitaminu E se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi (RP-HPLC) s UV nebo fluorescenční detekcí.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 15 % relat. z vyššího výsledku.

Reprodukovatelnost

Je uvedena u metody.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 2 mg/kg.

• 4.8. Stanovení obsahu vitaminu D

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu vitaminu D v krmivech.

Vitamin D se stanoví po alkalické hydrolýze vzorku hydroxidem draselným za studena, následné extrakci do hexanu, přečištění na semipreparativní koloně Silica metodou HPLC. Frakce vitaminu D se zachytí, odpaří se k suchu a odparek se rozpustí v methanolu. V extraktu se stanoví obsah vitaminu D vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na analytické koloně s reverzní fází C18 s UV detekcí při 265 nm.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 20 % relat.

Reprodukovatelnost

Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit 30 % relat.

Mez stanovitelnosti

Nestanovena.

• 1. Mikroprvky

• 5.1. Stanovení obsahu mědi, železa, manganu a zinku

Metoda stanovení obsahu mědi, železa, manganu a zinku je uveden v příloze č. 9, část 8.

• 5.2. Stanovení obsahu kobaltu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu kobaltu v krmivech.

Obsah kobaltu se stanoví po mineralizaci vzorku v chloridovém výluhu metodou atomové absorpční spektrometrie (AAS).

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Nestanovena.

• 5.3. Stanovení obsahu selenu.

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení selenu v krmivech.

Ve vzorku se po rozkladu kyselinou dusičnou v uzavřeném systému stanoví obsah selenu metodou atomové absorpční spektrometrie (AAS).

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Nestanovena.

• 1. Výpočty

• 6.1. Vyhodnocování a výpočet výsledků stanovení obsahu doplňkových látek pro difúzně plotnové metody

Účel, rozsah a princip

Metoda uvádí a specifikuje uzančně závazný způsob pro vyhodnocování a výpočet výsledků při stanovení obsahu doplňkových látek v krmivech a premixech pro difúzně plotnové metody.

Průměry inhibičních resp. stimulačních zón, vzniklých při stanovení doplňkových látek difusně plotnovou metodou, se měří s přesností nejméně na 0,1 mm. Ze souboru takto získaných hodnot se vypočítá aritmetický průměr pro každou koncentraci zkoušeného vzorku i standardu.

• 1. Barviva

• 7.1. Stanovení β-karotenu spektrofotometrickou metodou

Účel, rozsah a princip

β-karoten je přírodní barvivo chemicky patřící do skupiny tetraterpenoidů a je provitaminem vitaminu A.

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu β-karotenu v krmivech.

Stanoví se po enzymatické hydrolýze směsí enzymů pepsin - trypsin (1:1) v alkalickém prostředí, rozpuštěním v acetonu a následnou extrakcí do hexanu, spektrofotometricky při vlnové délce 451 nm.

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Nestanovena.

• 1. Mikrobiotika

• 8.1. Stanovení počtu zárodků bakterií rodu Enterococcus

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení počtu zárodků rodu Streptococcus skupiny D (Enterococcus) v krmivech a premixech.

Stanovení počtu zárodků bakterií rodu Enterococcus se provádí na selektivních půdách podle Slanetze a Bartleye. Jako referenční půda se při stanovení používá další selektivní půda (např. KF agar) nebo u premixů vhodná neselektivní půda. Naočkované půdy jsou kultivovány při 37 °C ± 1 °C. Růst a počty kolonií se vyhodnocují po dvou a čtyřdenní kultivaci.

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

• 8.2. Stanovení počtu zárodků bakterií rodu Bacillus

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení počtu zárodků rodu Bacillus v krmivech.

Stanovení počtu zárodků bakterií rodu Bacillus se provádí anaerobní kultivací na krevním agaru při 37 °C. Počty kolonií, charakteristické pro dané mikroorganismy, se vyhodnocují po 18 - 24 hodinách.

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Příloha č. 11 k vyhlášce č. 124/2001 Sb.

Laboratorní zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů

Seznam postupů fyzikálního zkoušení krmiv

1. Stanovení odrolu lisovaných krmiv
2. Stanovení zrnitosti
3. Stanovení ferromagnetických příměsí

• 1. Stanovení odrolu lisovaných krmiv

Účel, rozsah a princip

Postup specifikuje podmínky pro stanovení odrolu u granulovaných krmiv. Postup je použitelný pro všechny druhy krmiv a premixů. Odrol se stanoví vážkově jako sypký podíl po oddělení granulí na předepsaném sítu.

• 1. Stanovení zrnitosti

Účel, rozsah a princip

Postup specifikuje podmínky pro stanovení zrnitosti sypkých krmiv. Postup je použitelný pro všechny druhy krmiv a premixů. Zrnitost se stanoví vážkově jako hmotnostní podíly částic různých velikostí prosévací zkouškou konečného vzorku na předepsaných sítech.

• 1. Stanovení ferromagnetických příměsí

Účel, rozsah a princip

Postup specifikuje podmínky pro stanovení ferromagnetických příměsí. Postup je použitelný pro všechny druhy krmiv a premixů. Ferromagnetické příměsi se stanoví vážkově na základě svých magnetických vlastností po separaci ze vzorku krmiva magnetem.

Příloha č. 12 k vyhlášce č. 124/2001 Sb.

Laboratorní zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů

Seznam postupů smyslového zkoušení krmiv

1. Posuzování barvy, struktury a konzistence
2. Posuzování pachu

• 1. Posuzování barvy, struktury a konzistence

Princip

Posuzují se a stanoví odchylky od barvy typické pro dané krmivo, u struktury a konzistence kvalita opracování krmných surovin, případné porušení původního stavu krmiva, u lisovaných krmiv velikost granulí.

• 1. Posuzování pachu

Princip

Posuzuje se druh a intenzita pachu v původním stavu a po zahřátí a odchylky od pachu, který je pro dané krmivo typický.

Příloha č. 13 k vyhlášce č. 124/2001 Sb.

Laboratorní zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů

Seznam postupů speciálního zkoušení krmiv

1. Mikroskopie krmiv
2. Stanovení škůdců v obilovinách, luštěninách a olejninách
3. Stanovení škůdců v krmných směsích
4. Stanovení snětivosti pšenice
5. Stanovení druhové čistoty, nečistot a škodlivých nečistot u obilovin, luštěnin a olejnin
6. Mikroskopická identifikace a určování složek živočišného původu

• 1. Mikroskopie krmiv

Slouží k identifikaci jednotlivých druhů krmiv a k určení přítomnosti semen a plodů, uvedených jako nežádoucí látky ve vyhlášce Ministerstva zemědělství č.194/1996 Sb., ve znění pozdějších předpisů, kterou se provádí zákon o krmivech. Buněčné struktury se posuzují mikroskopicky porovnáním s preparáty připravenými z jednotlivých druhů krmiv, zbavených všech cizích příměsí.

• 1. Stanovení škůdců v obilovinách, luštěninách a olejninách

Princip

Živí škůdci se zjišťují po prosátí vzorku v propadu, popř. v podílu na sítě buď pouhým okem, popř. pomocí lupy nebo stereoskopickým mikroskopem. Seznam škůdců je uveden v příloze č.2 vyhlášky Ministerstva zemědělství č. 194/1996 Sb., ve znění pozdějších předpisů, kterou se provádí zákon o krmivech.

• 1. Stanovení škůdců v krmných směsích

Princip

Živí škůdci se zjišťují po prosátí vzorku v propadu, popř. v podílu na sítě buď pouhým okem, popř. pomocí lupy nebo stereoskopickým mikroskopem. Seznam škůdců je uveden v příloze č. 2 vyhlášky Ministerstva zemědělství č. 194/1996 Sb., ve znění pozdějších předpisů, kterou se provádí zákon o krmivech.

• 1. Stanovení snětivosti pšenice

Princip

Za snětivou se považuje pšenice, která obsahuje zrna napadená snětí, snětivé kuličky, případně vykazuje pach po sněti. Konečný vzorek se vysype na světlou podložku a smyslově se posuzuje zamazání zrn sporami sněti, výskyt snětivých kuliček a pachu po sněti. Jestliže vzorek vykazuje kterýkoliv z uvedených znaků, označí se pšenice za snětivou.

• 1. Stanovení botanické čistoty, nečistot a škodlivých nečistot u krmných surovin.

Princip

Mechanicky nebo ručně se z poměrné části konečného vzorku oddělí botanické nečistoty (přirozené neškodné nečistoty a škodlivé nečistoty a škodlivá olejnatá semena, tj. semena a plody plevelů uvedené v příloze č. 3 vyhlášky č. 451/2000 Sb., kterou se provádí zákon č. 91/1996 Sb., o krmivech, ve znění zákona č. 244/2000 Sb., ve znění pozdějších předpisů) a cizí předměty a vyjadřují se jako procentní podíl.

• 1. Podmínky pro mikroskopické stanovení, identifikaci nebo určování složek živočišného původu v krmivech.

Účel, rozsah a princip

Tato metoda je určena pro stanovení složek živočišného původu (definovaných jako produkty zpracování těl nebo částí těl savců, ptáků a ryb) v krmivech, prováděné pomocí mikroskopického zkoušení v rámci systému koordinovaného inspekčního programu v oblasti výživy zvířat v souladu s § 16 zákona č. 91/1996 Sb., o krmivech, ve znění pozdějších předpisů.

Stanovení prováděná podle této metody jsou používána k provádění odborného dozoru a zkoušení krmiv. Ke zlepšení určování určitých typů živočišných konstituentů nebo určení původu živočišné složky mohou být použity v další zkoušce upravené nebo alternativní metody. Při zkoušení určitých specifických živočišných konstituentů jako např. plasma nebo kosti v tuku (viz také bod 9) mohou být také použity další metody za předpokladu, že tyto zkoušky budou provedeny jako doplněk ke zkouškám uváděným v koordinačním inspekčním programu.

Citlivost stanovení v krmivech může být v závislosti na původu složek živočišného původu velmi nízká – 0,01 %.

K identifikaci se použije vhodně upravený reprezentativní vzorek, odebraný podle postupu uvedeného v § 1 až 6. Dále uvedená metoda je vhodná pro krmiva s nízkým obsahem vlhkosti. Krmiva s vyšším obsahem vlhkosti než 14 % musí být předem předsušena. Zejména některá krmiva a krmné suroviny (např. tuky a oleje) vyžadují uvedenou úpravu. Složky živočišného původu jsou identifikovány na základě typických, mikroskopicky identifikovatelných charakteristik (např. svalových vláken nebo jiných částí masa, chrupavek, kostí, rohů, chlupů, štětin, krve, peří, vaječných skořápek, rybích kostí, šupin).

Identifikace musí být provedena jak v sítové frakci, tak v koncentrovaném sedimentu vzorku.

Příloha č. 14 k vyhlášce č. 124/2001 Sb.

Zkoušení homogenity

• 1. Homogenita premixů a krmiv s použitím premixů

Zkoušení homogenity se uskutečňuje pomocí doplňkové látky nebo přidané aminokyseliny, dávkované do premixu nebo do krmiv s použitím premixu. Tato doplňková látka nebo aminokyselina musí být stanovitelná metodami zkoušení, které jsou uvedené v přílohách č. 7 až 10. Homogenita se zkouší v rámci jedné partie.

• 1. Zkoušení homogenity partie

Pro test homogenity partie se vybere nj, obalů nebo u volně ložených krmiv nj hypotetických částí partie a z každé z nich se odebere jediný dílčí vzorek, který se samostatně upraví a tím se získá nj, zkušebních vzorků. Z výsledků zkoušek x1, x2, x3....xnj se stanoví analýza s^2.

• 1. Stanovení celkového rozptylu

Pro stanovení celkového rozptylu použijeme výraz:

s2=1k-1∑j=1kxj¯-x¯2

kde:

k je celkový počet odebraných dílčích vzorků (počet úrovní)

xj¯je průměr uvnitř úrovně

x¯ je průměr ze všech analytických stanovení (celkový průměr), uvedených ve sloupci 3 protokolu o zkouškách

• 1. Stanovení rozptylu metody

Pro stanovení rozptylu zkušební metody použijeme výraz:

sy2=1n-1∑i=1nxi-xi¯2

kde:

n je počet paralelních opakování pro ověření metody (ověřovací série)

xi je i-té stanovení na vzorku, který je použit k ověření metody (ověřovací série),

xj¯ je průměr stanovení u vzorku, který je použit k ověření metody (ověřovací série), uvedených ve sloupci 7 protokolu o zkouškách

• 1. Partie krmiva nebo premixu se považuje za homogenní pouze tehdy, když platí:

F0,05 = s2sy2 F0,05α, k-1;n-1

• 1. Počet vzorkovaných obalů nebo hypotetických částí je následující:

Počet obalů v partii	Vzorkovaná hmotnost volně ložené partie - t	Počet vzorkovaných obalů - částí (díl. vzorků)
do 25	do 1,50	5
26 – 50	od 1,51 – 250	6
51 – 100	od 2,51 – 5,00	7
101 – 200	od 5,01 – 10,00	9
201 – 300	od 10,01 – 15,00	11
301 – 500	od 15,01 – 25,00	13
501 – 800	od 25,01 – 40,00	16
801 – 1 300	od 40,01 – 65,00	20

Příloha č. 16 k vyhlášce č. 124/2001 Sb.

Způsob posouzení pracovní přesnosti míchacího zařízení

• 1. Zkoušení pracovní přesnosti se uskutečňuje u všech míchacích zařízení, která slouží pro finální výrobu premixů a krmiv s použitím premixů.

• 1. Ke zkoušení se používá výhradně jako indikační doplňková látka lasalocid, u které je před zkouškou ověřen obsah účinné látky a látka je upravena tak, aby veškeré částice propadaly drátěným sítem o velikosti strany oka 0,5 mm. Pro zkoušku pracovní přesnosti 1 : 10 000 se odvažuje 100 g jako 100 % látky na 1 tunu míchaného substrátu, k ověření pracovní přesnosti 1 : 100 000 se odvažuje 10 g jako 100 % látky. Před použitím látky je přípustné její předmíchání do 1 kg použitého nosiče.

• 1. Ke zkoušce se používá jako nosič pro míchací zařízení sloužící k výrobě premixů s minerálním nosičem nebo pro výrobu doplňkových minerálních krmiv, krmný vápenec jemně nebo velmi jemně mletý. V ostatních případech se používá ke zkoušce jako nosič pšeničná mouka krmná. Velikost částic míchaného substrátu má být menší jak než 1 mm.

• 1. Míchací zařízení, u kterého se uskutečňuje zkouška, nesmí propouštět míchaný substrát, míchací element musí být úplný, nepoškozený, zbavený zbytků a zcela vyprázdněný. Pokud se jedná o typové míchací zařízení, porovná se technické provedení míchacího zařízení s technickými podmínkami jeho výrobce a o porovnání se vyhotovuje protokol o shodě.

• 1. Protokol o shodě obsahuje tyto náležitosti:

• a) o jaké zařízení se jedná a kdo je jeho výrobcem,

• b) typ míchacího zařízení,

• c) výrobní číslo (pokud je uvedeno),

• d) rok výroby,

• e) provozovatel (pokud se nejedná o zkoušky u výrobce zařízení),

• f) posouzení shody výrobku s technickými podmínkami:

• technické parametry (pohon, pracovní část - míchací element, vyprazdňovací zařízení)

• funkční parametry (opotřebení mechanických částí, změny tvaru dílů, těsnost stroje po naplnění),

• souhrnné vyjádření a případná doporučení,

• kdo provedl posouzení shody (popis, případně razítko),

• za provozovatele (výrobce) podpis, případně razítko,

• datum vyhotovení protokolu.

• 1. Vlastní postup zkoušky

Míchací zařízení se naplní míchaným nosičem (pšeničnou moukou krmnou, krmným vápencem), který se odváží s přesností ± 1 % z celkové jeho navážky. Odvažuje se takové množství, aby zaplnilo nejméně dvě třetiny objemu míchacího prostoru, který je udán výrobcem. Po kontrole těsnosti míchacího zařízení, která se uskutečňuje za jeho chodu, se za klidu míchacího elementu vpraví na povrch nosiče odvážené množství (s přesností 0,01 g) indikační doplňkové látky a míchací zařízení se uvede do chodu na dobu stanovenou výrobcem v technických podmínkách (pokud není stanovena na dobu udanou provozovatelem). Po ukončení stanovené doby se přikročí k odběru vzorků.

• 1. Odběr vzorků se uskutečňuje podle technického provedení míchacího zařízení buď za jeho klidu přímo z míchacího prostoru, nebo při jeho vyprazdňování za chodu míchacího zařízení. Odběr dílčích vzorků se uskutečňuje pomocí dvouplášťového vertikálního vzorkovače nebo pomocí vzorkovací krabice pro odběr vzorků z celého průřezu toku materiálu. Pokud nelze použít k odběru vzorků při vyprazdňování žádnou z uvedených vzorkovacích pomůcek, lze výjimečně použít vhodnou vzorkovací lopatku. Za dílčí vzorek se považuje jeden vpich vzorkovače nebo jeden náběr vzorkovací krabicí. Takto odebrané dílčí vzorky se neupravují a přímo vkládají do obalů.

• 1. Úprava a zkoušení vzorků

Úpravu vzorků pro zkoušení stanovuje příloha č. 7, bod 1.7. Pro zkoušení se používají postupy uvedené ve Věstníku, řada Národní referenční laboratoř, díl č. 3.

Pro doplňkovou látku lasalocid, která je ustanovena k ověření přesnosti míchacích zařízení, platí následující hodnoty opakovatelnosti:

Doplňková látka	Obsah mg/kg	Opakovatelnost
Lasalocid	od 0,5 do 15	10 % relat.
	od 50 do 150	5 % relat.

Z každého upraveného dílčího vzorku vždy po samostatné úpravě mícháním se oddělí dva zkušební vzorky pro 2 paralelní stanovení indikační doplňkové látky a u jednoho náhodně vybraného dílčího vzorku se oddělí čtyři zkušební vzorky pro 4 paralelní stanovení. Provedené paralelní stanovení u každého dílčího vzorku se nesmí od sebe odchylovat o více než je stanovená opakovatelnost pro danou metodu zkoušení. Z dvou paralelních stanovení u každého dílčího vzorku se vypočítá pro každý vzorek průměrná hodnota obsahu doplňkové látky, která slouží pro stanovení celkového rozptylu.

• 1. Stanovení celkového rozptylu

Pro zpracování celkového rozptylu se použije jednotlivá paralelní stanovení u dílčích vzorků, z kterých se vypočte průměrná hodnota pro každý dílčí vzorek. Do výpočtu se dosadí průměrné hodnoty (x) dílčích vzorků.

Pro stanovení celkového rozptylu (s^2) platí:

s2=1k-1∑j=1kxj--x-2

kde: k je celkový počet odebraných dílčích vzorků (počet úrovní)

xj¯ je průměr uvnitř úrovně

x- je průměr ze všech analytických stanovení (celkový průměr)

• 1. Stanovení rozptylu zkušební metody

Pro stanovení rozptylu zkušební metody platí:

sy2=1n-1∑i=1nxi-xi-2

kde: n je počet paralelních opakování pro ověření metody (ověřovací sérii)

xi je i-té stanovení na vzorku, který je použit k ověření metody (ověřovací sérii),

xi- je průměr stanovení u vzorku, který je použit k ověření metody (ověřovací sérii),

• 1. Pracovní přesnost míchacího zařízení se považuje za vyhovující, pokud zkoušený substrát vykazuje homogenitu použité doplňkové látky a pro uvedené platí vztah: kdy

F0,1=s2sy2 F0,1 α,k-1;n-1]

• 1. Ze zkoušení pracovní přesnosti míchacího zařízení se vystavuje protokol o zkouškách, který obsahuje:

• a) typ míchacího zařízení, o které se jedná a pro jakou pracovní přesnost bylo zkoušeno (§ 7 odst. 3 písmeno b) zákona č. 91/1996 Sb.),

• b) kdo je výrobcem míchacího zařízení,

• c) jaká indikační doplňková látka byla použita a v jakém obsahu na kg zkoušeného substrátu (teorie),

• d) vlastní výsledky jednotlivých zkoušek obsahující číslo vzorku, pod kterým byl zařazen do zkoušek, pořadové číslo paralelního stanovení, prokázaný obsah doplňkové látky v paralelním stanovení, průměrný obsah doplňkové látky v dílčím vzorku, celkový průměr ze všech paralelních stanovení použitých k výpočtu celkového rozptylu, celkový rozptyl, rozptyl metody, f-test vypočítaný, f-test tabelovaný pro úroveň 0,1,

• e) závěrečné hodnocení,

• f) datum vyhotovení protokolu,

• g) razítko a podpis osoby provádějící zkoušky

Protokol o zkoušení pracovní přesnosti je přenosný na stejné typy míchacích zařízení za předpokladu, že míchací zařízení bylo posouzeno a vystaven protokol o shodě mezi typem míchacího zařízení, které již vyhovělo požadavkům pro pracovní přesnost a míchacím zařízením, které je posuzováno, zda je shodné.

• 1. Vzor protokolu o zkouškách.

Protokol o zkouškách č.

[image omitted]

Příloha č. 18 k vyhlášce č. 124/2001 Sb.

Část 1:

Metody odběru vzorků pro odborný dozor a zkoušení obsahu dioxinů (PCDD/PCDF) a určování dioxinům podobných PCB v některých krmivech

• 1. Účel a oblast působnosti

Vzorky určené pro úřední kontrolu obsahu dioxinů (PCDD/PCDF), jakož i pro určení obsahu PCB s dioxinovým efektem (Tabulka PCB s dioxinovým efektem) v krmivech se odebírají v souladu s § 1 až 6 této vyhlášky. Musí se použít kvantitativní požadavky týkající se kontroly látek nebo produktů obsažených rovnoměrně v krmivech v souladu s § 1 až 6 této vyhlášky. Takto získané souhrnné vzorky se považují za reprezentativní pro vzorkované partie nebo subpartie, z nichž jsou odebrány. Dodržení maximálních obsahů stanovených v příloze č. 3 vyhlášky č. 451/2000 Sb. se posuzuje na základě obsahů stanovených v laboratorních vzorcích.

• 1. Soulad partie nebo subpartie se specifikací

Partie se uznává, jestliže výsledek jediné analýzy nepřekročí příslušný maximální obsah stanovený v příloze č. 3 vyhlášky č. 451/2000 Sb. při zohlednění nejistoty měření.

Partie nesplňuje maximální obsah stanovený v příloze č. 3 vyhlášky č. 451/2000 Sb., jestliže výsledek analýzy potvrzený druhou analýzou a vypočtený jako průměr nejméně dvou nezávislých stanovení při zohlednění nejistoty měření překročí maximální obsah.

Nejistotu měření lze zohlednit jedním z těchto způsobů:

– započítáním rozšířené nejistoty při použití faktoru pokrytí 2, který odpovídá hladině spolehlivosti alespoň 95 %, nebo

– stanovením rozhodovací meze (CCα) v souladu s rozhodnutím Komise 2002/657/ES (bod 3.1.2.5. přílohy pro látky, pro něž byla stanovena přípustná hodnota).

Tato pravidla se uplatní pro výsledek analýzy získaný ze vzorku pro úřední kontrolu.

Tabulka PCB s dioxinovým efektem

Kongener	Hodnota TEF	Kongener	Hodnota TEF
Dibenzo-p-dioxiny („PCDD“)		PCB „s dioxinovým efektem“: non-ortho
PCB + mono-ortho PCB
2,3,7,8-TCDD	1	Non-ortho PCB
1,2,3,7,8-PeCDD	1
1,2,3,4,7,8-HxCDD	0,1
1,2,3,6,7,8-HxCDD	0,1	PCB 77	0,0001
1,2,3,7,8,9-HxCDD	0,1	PCB 81	0,0001
1,2,3,4,6,7,8-HpCDD	0,01	PCB 126	0,1
OCDD	0,0001	PCB 169	0,01
Dibenzofurany („PCDF“)		Mono-ortho PCB
2,3,7,8-TCDF	0,1	PCB 105	0,0001
1,2,3,7,8-PeCDF	0,05	PCB 114	0,0005
2,3,4,7,8-PeCDF	0,5	PCB 118	0,0001
1,2,3,4,7,8-HxCDF	0,1	PCB 123	0,0001
1,2,3,6,7,8-HxCDF	0,1	PCB 156	0,0005
1,2,3,7,8,9-HxCDF	0,1	PCB 157	0,0005
2,3,4,6,7,8-HxCDF	0,1	PCB 167	0,00001
1,2,3,4,6,7,8-HpCDF	0,01	PCB 189	0,0001
1,2,3,4,7,8,9-HpCDF	0,01
OCDF	0,0001

Použité zkratky: „T“ = tetra; „Pe“ = penta; „Hx“ = hexa; „Hp“ = hepta; „O“ = okta; „CDD“ = chlorodibenzo-p-dioxin; „CDF“ = chlorodibenzofuran; „CB“ = chlorobifenyl.

Část 2:

Příprava vzorků a požadavky na metody analytického zkoušení používané při provádění odborného dozoru a zkoušení obsahu dioxinů (pcdd/pcdf) a stanovení dioxinům podobných pcb v některých krmivech

• 1. Cíl a oblast použití

Tyto požadavky na metody analytického zkoušení se používají pro stanovení dioxinů (polychlorovaných dibenzo-p-dioxinů (PCDD) a polychlorovaných dibenzofuranů (PCDF)) a dioxinům podobných polychlorovaných bifenylů (PCB) v krmných surovinách a krmivech.

Sledování přítomnosti dioxinů v krmivech se provádí pomocí strategie zahrnující vyhledávací metodu pro výběr vzorků s obsahem dioxinů a dioxinům podobných PCB o méně než 30 až 40 % nižším nebo vyšším než je množství, které je předmětem zájmu. Koncentrace dioxinů ve vzorcích s významným obsahem se stanoví/potvrdí ověřovací metodou.

Vyhledávací metody jsou metody, které se používají ke zjišťování přítomnosti dioxinů a dioxinům podobných PCB v množství, které je předmětem zájmu. Tyto metody jsou schopné rychle zpracovat velký objem vzorků a používají se k prověření velkého množství vzorků z hlediska možných pozitivních výsledků. Jsou speciálně navrženy tak, aby vyloučily falešně negativní výsledky.

Ověřovací metody jsou metody, které poskytují úplné nebo doplňkové informace umožňující jednoznačnou identifikaci a kvantifikaci dioxinů a dioxinům podobných PCB na uvažované úrovni, která je předmětem zájmu.

• 1. Obecně

Protože vzorky z životního prostředí a biologické vzorky (včetně vzorků krmných surovin/krmiv) obvykle obsahují složité směsi různých dioxinových kongenerů, byla pro usnadnění hodnocení jejich nebezpečnosti vyvinuta koncepce koeficientů toxické ekvivalence (TEF). Tyto TEF byly stanoveny, aby vyjádřily koncentraci směsí 2,3,7,8-substituovaných PCDD a PCDF, a později také u některých non-ortho a mono-ortho-chlór substituovaných PCB, které vykazují aktivitu podobnou dioxinům, v toxických ekvivalentech (TEQ) 2,3,7,8-TCDD (viz. Tabulka Světové zdravotnické organizace)

Koncentrace jednotlivých látek v daném vzorku se násobí jejich příslušným TEF a tyto násobky se následně sčítají, aby se dospělo k celkové koncentraci dioxinům podobných sloučenin, vyjádřených v TEQ.

Koncepce „horní hranice“ vyžaduje, aby se do celkové hodnoty TEQ započítaly mezní hodnoty kvantifikace každého nekvantifikovaného kongeneru.

Koncepce „dolní hranice“ vyžaduje, aby se do celkové hodnoty TEQ započítala za každý nekvantifikovaný kongener nulová hodnota.

Koncepce „střední hodnoty“ vyžaduje, aby se do celkové hodnoty TEQ započítala polovina mezní hodnoty kvantifikace pro každý nekvantifikovaný kongener.

• 1. Příprava vzorků

Pro přípravu vzorků k laboratornímu zkoušení jsou použitelné postupy uvedené v příloze č. 7 této vyhlášky. Kromě toho musí být splněny tyto požadavky:

– vzorky musí být skladovány a přepravovány ve skleněných, hliníkových, polypropylénových nebo polyethylenových nádobách. Z nádoby na vzorky musí být odstraněny stopy papírového prachu. Skleněné nádobí musí být vypláchnuto rozpouštědly předem zkontrolovanými z hlediska přítomnosti dioxinů,

– musí být provedena slepá zkouška, která spočívá v provedení celého analytického postupu s vynecháním vzorku,

– hmotnost vzorku použitá k extrakci musí být dostatečná vzhledem k citlivosti.

• 1. Požadavky kladené na laboratoře

– laboratoře musí prokázat účinnost metody v rozsahu koncentrace, která je předmětem zájmu, například polovina, jedno a dvojnásobek koncentrace, která je předmětem zájmu, s přijatelným variačním koeficientem výsledků opakované analýzy. Podrobnosti kritérií přijatelnosti viz bod 5;

– mezní hodnota stanovitelnosti pro ověřovací metodu musí být v rozsahu asi jedné pětiny úrovně, která je předmětem zájmu, aby byla jistota, že v rozsahu úrovně, která je předmětem zájmu, se dosahuje přijatelných variačních koeficientů;

– jako opatření v rámci vnitřní kontroly jakosti se provádějí pravidelné slepé zkoušky, stanovení se standardním přídavkem nebo stanovení kontrolních vzorků (nejlépe certifikovaného referenčního materiálu, je-li k dispozici);

– úspěšná účast v mezilaboratorních studiích, které hodnotí způsobilost laboratoře, je nejlepším způsobem, jak prokázat schopnost provádět určitá stanovení. Avšak úspěšná účast v mezilaboratorních studiích, například pro půdní vzorky nebo vzorky odpadních vod, nezbytně neprokazuje též schopnost v oblasti vzorků potravin nebo krmiv, kde jde o nižší úrovně znečištění. Proto je povinná trvalá účast v mezilaboratorních studiích stanovení dioxinů a dioxinům podobných PCB v příslušných matricích krmiv/potravin;

– laboratoře musí být akreditovány uznávaným subjektem působícím v souladu s ISO Guide 58, aby bylo zajištěno, že uplatňují zabezpečování jakosti při analýzách. Laboratoře by měly být akreditovány podle normy ISO/IEC 17025:1999.

• 1. Požadavky kladené na analytické metody zkoušení dioxinů a dioxinům podobných PCB

Základní požadavky pro uznání analytických metod:

– vysoká citlivost a nízké mezní hodnoty detekce. Pro PCDD a PCDF musí být detekovatelná množství v řádu pikogramů TEQ (10^-12 g), kvůli mimořádné toxicitě některých z těchto sloučenin. Je známo, že PCB se vyskytují ve vyšších koncentracích než PCDD a PCDF. Pro většinu kongenerů PCB již postačuje citlivost v řádu nanogramů (10^-9 g). Avšak pro měření jedovatějších dioxinům podobných kongenerů PCB (zejména non-ortho substituovaných forem) musí být dosaženo stejné citlivosti jako pro PCDD a PCDF;

– vysoká selektivita. Je nutné rozlišovat PCDD, PCDF a dioxinům podobné PCB od velkého množství jiných, společně extrahovaných a eventuálně rušivých sloučenin přítomných v koncentracích až o několik řádů vyšších než koncentrace látek, které jsou předmětem zájmu. Pro plynovou chromatografii s hmotnostní spektrometrií (GC/MS) je nezbytné rozlišení mezi různými kongenery, tj. mezi toxickými (např. sedmnáct 2,3,7,8-substituovaných PCDD a PCDF a dioxinům podobných PCB) a ostatními kongenery. Biologické zkoušky sloučenin musí být schopny selektivně určit hodnoty TEQ jako součet PCDD, PCDF a dioxinům podobných PCB;

– vysoká přesnost (správnost a shodnost). Stanovení musí poskytnovat platný a spolehlivý odhad skutečné koncentrace ve vzorku. Je nezbytná vysoká přesnost (přesnost měření: velká shoda výsledku měření a skutečné nebo přisuzované hodnoty měření), aby se předešlo zamítnutí analýzy vzorku na základě špatné spolehlivosti odhadu TEQ. Přesnost se vyjadřuje jako správnost (rozdíl mezi střední naměřenou hodnotou analytu v certifikovaném referenčním materiálu a jeho certifikovanou hodnotou, vyjádřený jako procento této hodnoty) a shodnost (shodnost se obvykle počítá jako standardní odchylka zahrnující opakovatelnost a reprodukovatelnost a označuje míru shody mezi výsledky získanými několikanásobným použitím experimentálního postupu za předepsaných podmínek).

Vyhledávací metody mohou zahrnovat metody biologických zkoušek a metody GC/MS; ověřovací metody jsou metody plynové chromatografie s vysokým rozlišením/ hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením (HRGC/HRMS). Celková hodnota TEQ musí vyhovovat těmto kritériím

	Vyhledávací metody	Ověřovací metody
Falešně negativní koncentrace	< 1 %
Správnost		-20 až +20 %
Variační koeficient	< 30 %	< 15 %

• 1. Zvláštní požadavky, které musí splňovat metody GC/MS, aby vyhovovaly pro účely vyhledávání nebo ověřování

– při validaci metody musí být hned na počátku analytické metody, například před extrakcí, provedeno přidání vnitřních standardů 2,3,7,8-chlór substituovaných PCDD/F značených pomocí ^13C (a vnitřních standardů dioxinům podobných PCB značených pomocí ^13C, pokud musí být určeny dioxinům podobné PCB). Alespoň jeden kongener musí být přidán pro každou z tetra nebo okta-chlorovaných homologických skupin PCDD/F (a alespoň jeden kongener pro každou z homologických skupin dioxinům podobných PCB, pokud musí být určeny dioxinům podobné PCB) (nebo alespoň jeden kongener pro každou skupinu vybraných iontů při použití hmotnostní spektrometrie v režimu registrace vybraných iontů, použitou pro sledování PCDD/F a dioxinům podobných PCB). Jednoznačně se dává přednost, zejména v případě ověřovacích metod, použití všech 17 vnitřních standardů 2,3,7,8-substituovaných PCDD/F značených pomocí ^13C a všech 12 vnitřních standardů dioxinům podobných PCB značených pomocí ^13C (pokud musí být určeny dioxinům podobné PCB).

Pro ty kongenery, k nimž není přidán žádný analog značený pomocí ^13C, se určí relativní koeficienty odezvy při použití vhodných kalibračních roztoků.

– Pro krmiva rostlinného původu a krmiva živočišného původu obsahující méně než 10 % tuku je přidání vnitřních standardů před extrakcí povinné. Pro krmiva živočišného původu obsahující více než 10 % tuku se vnitřní standardy přidávají buď před, nebo po extrakci tuku. Vhodná validace účinnosti extrakce se provádí v závislosti na tom, kdy je vnitřní standard přidáván a na tom, zda jsou výsledky uváděny v produktu nebo v tuku.

– Před analýzou GC/MS musí být přidán jeden nebo dva standardy pro stanovení výtěžnosti.

– Kontrola výtěžnosti je nezbytná. U ověřovacích metod se výtěžnost jednotlivých vnitřních standardů pohybuje v rozsahu 60 až 120 %. Nižší nebo vyšší hodnota výtěžnosti jednotlivých kongenerů zejména některých hepta- a okta-chlorovaných dibenzodioxinů a dibenzofuranů, je přípustná pod podmínkou, že jejich příspěvek k hodnotě TEQ nepřesáhne 10 % celkové hodnoty TEQ (jen na základě PCDD/F). Hodnota výtěžnosti u vyhledávacích metod se pohybuje mezi 30 a 140 %.

– Oddělení dioxinů od rušivých chlorovaných sloučenin, jako jsou PCB a chlorované difenylethery, se provádí vhodnými chromatografickými technikami (nejlépe na florisilové, aluminové a/nebo uhlíkové koloně).

– Oddělení isomerů pomocí plynové chromatografie musí být dostatečné (< 25 % mezi píky 1,2,3,4,7,8-HxCDF a 1,2,3,6,7,8-HxCDF).

– Stanovení se provádí podle metody EPA 1613 revize B: tetra- až okta-chlorované dioxiny a furany pomocí izotopického zřeďování HRGC/HRMS nebo jinou metodou se shodnými pracovními charakteristikami (performance criteria).

– u krmiv kontaminovaných dioxiny v rozsahu maximální úrovně nebo nad ní by rozdíl mezi horní a dolní mezní úrovní neměl překročit 20 %. U krmiv s úrovní kontaminace výrazně pod maximální úrovní se může rozdíl pohybovat v rozmezí 25 a 40 %.

• 1. Vyhledávací analytické metody

• 7.1 Úvod

Vyhledávací metody mohou být použity k různým přístupům: čistě vyhledávací přístup a nebo kvantitativní přístup.

Vyhledávací přístup

Odezva vzorků se porovnává s odezvou srovnávacího vzorku na úrovni, která je předmětem zájmu. Vzorky s odezvou nižší než srovnávací vzorek se považují za negativní, vzorky s vyšší odezvou se považují za pozitivní. Požadavky:

– do každé zkušební série se zařazují alespoň jeden slepý a jeden srovnávací vzorek, které se extrahují a zkouší současně za shodných podmínek. Odezva srovnávacího vzorku musí být zřetelně vyšší ve srovnání se slepým vzorkem,

– zařazují se další srovnávací vzorky s poloviční a dvojnásobnou koncentrací, která je předmětem zájmu, aby se prokázala řádná účinnost zkoušky pro kontrolu koncentrace, která je předmětem zájmu,

– při zkoušení jiných matric se musí prokázat vhodnost referenčního vzorku(ů), nejlépe zařazením vzorků, u nichž bylo pomocí HRGC/HRMS zjištěno, že obsahují množství TEQ přibližně odpovídající referenčnímu vzorku nebo jinému slepému vzorku obohacenému na tuto úroveň,

– protože při biologických zkouškách sloučenin nemohou být použity žádné vnitřní standardy, jsou pro získání informací o standardní odchylce v rámci jedné zkušební série velmi důležité testy opakovatelnosti. Variační koeficient musí být nižší než 30 %,

– pro biologické zkoušky jsou definovány cílové (stanovované) sloučeniny, možné rušivé vlivy a maximální přípustné slepé hodnoty.

Kvantitativní přístup

Kvantitativní přístup vyžaduje standardní sérii ředění, dvojnásobné nebo trojnásobné čištění a měření, jakož i slepé stanovení a kontrolu výtěžnosti. Výsledek se vyjádřuje jako TEQ, čímž se předpokládá, že sloučeniny odpovědné za signál odpovídají principu TEQ. Toto může být provedeno pomocí TCDD (nebo standardní dioxin/furanové směsi) za účelem vytvoření kalibrační křivky pro výpočet hodnoty TEQ v extraktu a tedy i vzorku. Tato hodnota se následně koriguje podle hodnoty TEQ vypočtené pro slepý vzorek (aby se zohlednily nečistoty z použitých rozpouštědel a chemikálií) a výtěžnost (vypočtená z hodnoty TEQ ve vzorku pro kontrolu jakosti v blízkosti mezní koncentrace, která je předmětem zájmu). Je nezbytné poznamenat, že část zřejmé ztráty výtěžnosti může být způsobena matricovými jevy a/nebo rozdíly mezi hodnotami TEF v biologických zkouškách sloučenin a úředními hodnotami TEF stanovenými WHO.

• 7.2. Požadavky kladené na analytické metody používané pro vyhledávání

– pro vyhledávání se používají analytické metody GC/MS a biologické metody zkoušení. Pro metody GC/MS se uplatňují požadavky stanovené v bodu 6. Pro buněčné biologické zkoušky sloučenin platí zvláštní požadavky stanovené v bodu 7.3 a pro biologické zkoušky sloučenin prováděné pomocí setů platí zvláštní požadavky stanovené v bodu 7.4;

– jsou nezbytné informace o počtu falešně pozitivních a falešně negativních výsledků velkého souboru vzorků pod a nad maximální úrovní nebo účinnou úrovní ve srovnání s obsahem TEQ určeným ověřovací analytickou metodou. Skutečný podíl falešně negativních výsledků musí být nižší než 1 %. Podíl falešných pozitivních výsledků musí být natolik nízký, aby se použití vyhledávacího nástroje stalo výhodným;

– pozitivní výsledky musí být vždy potvrzeny ověřovací analytickou metodou (HRGC/HRMS). Kromě toho se pomocí HRGC/HRMS potvrzují vzorky z širokého rozmezí hodnot TEQ (přibližně 2 až 10 % negativních vzorků) a předkládají se informace o souladu výsledků biologické zkoušky a HRGC/HRMS.

• 7.3. Zvláštní požadavky kladené na biologické zkoušky sloučenin

– při biologickém zkoušení vyžaduje každá zkouška řadu srovnávacích koncentrací TCDD nebo dioxin/furanových směsí (úplná křivka dávka/odezva s R^2 > 0,95). Avšak pro účely vyhledávání se používá rozšířená nízkoúrovňová křivka pro analyzování vzorků s nízkým obsahem;

– aby bylo výsledku biologické zkoušky sloučenin dosaženo během konstantní doby, používá se srovnávací koncentrace TCDD (asi trojnásobek meze detekce) uvedená na listu kontroly jakosti. Jinou možností je relativní odezva srovnávacího vzorku vztažená ke kalibrační křivce TCDD, protože odezva buněk může záviset na mnoha faktorech;

– pro každý srovnávací materiál se zaznamenávají a kontrolují grafy kontroly jakosti, aby byl zajištěn soulad výsledku se směrnicemi;

– zejména v případě kvantitativního vyhodnocování musí být výsledek ředění vzorků uvnitř lineárního části úseku křivky odezvy. Vzorky nad lineární částí křivky odezvy musí být znovu zředěny a přezkoušeny. Proto se doporučuje zkoušet alespoň tři nebo více různě ředěných vzorků najednou;

– variační koeficient nesmí být vyšší než 15 % při trojnásobném stanovení pro každé ředění vzorku a pro tři nezávislé pokusy by neměl přesáhnout 30 %;