Legalize
Legalize / Česká republika / Vyhláška

Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 251/1998 Sb., kterou se stanoví metody pro zjišťování toxicity chemických látek a přípravků

Typ Vyhláška
Publikace 2001-06-22
Stav Platný
Zdroj e-Sbírka
článků Not indexed
Historie novel JSON API

Genové mutace jsou u člověka příčinou řady genetických nemocí a existují přesvědčivé doklady toho, že genové mutace v onkogenech a tumorově supresorových genech somatických buněk hrají u člověka a pokusných zvířat roli při vzniku nádorů. Bakteriální test na reverzní mutace je rychlý, levný a relativně jednoduchý. Řada testovacích kmenů se vyznačuje charakteristikami, díky nimž jsou citlivější pro detekci mutací, včetně citlivých sekvencí DNA v místech reverze, zvýšené propustnosti buněk pro velké molekuly a eliminace systémů reparace DNA či posílení takových procesů reparace DNA, jež jsou náchylné k chybám. Specifita testovacích kmenů umožňuje získat některé užitečné informace o typech mutací, jež jsou vyvolány genotoxickými látkami. Pro bakteriální testy reverzních mutací je k dispozici velmi rozsáhlá databáze výsledků pro širokou škálu struktur a byly vypracovány osvědčené metody pro testování chemikálií o různých fyzikálně-chemických vlastnostech, včetně chemikálií těkavých.

Test reverzních mutací s použitím kmenů Salmonella typhimurium nebo Escherichia coli slouží ke zjištění mutací v kmeni závislém na určité aminokyselině (histidinu resp. tryptofanu), jež vedou ke vzniku kmene, který je na dodávce aminokyseliny zvenku nezávislý.

Mutageny vyvolávající substituci páru bází jsou látky způsobující změnu bází v DNA. Při reverzním testu může k takové změně dojít na místě původní mutace nebo na jiném místě bakteriálního genomu.

Frameshift mutageny (mutageny vyvolávající posunové mutace) jsou látky, jež způsobují přidání nebo odebrání jednoho nebo více párů bází v DNA, čímž se mění čtecí rámec v RNA.

V bakteriálním testu se využívají prokaryotické buňky, které se od savčích buněk liší v příjmu látek metabolismu, chromozomální struktuře a procesech opravy DNA. Testy in vitro obecně vyžadují exogenní zdroj metabolické aktivace. Systémy metabolické aktivace in vitro ovšem nedokáží dokonale imitovat savčí podmínky in vivo, takže test neposkytuje přímé informace o mutagenní a karcinogenní potenci dané látky v organismech savců.

Bakteriální test reverzních mutací se běžně používá jako prvotní screening genotoxické aktivity a zvláště aktivity vyvolávající genové mutace. Pomocí rozsáhlé databáze se prokázalo, že mnohé chemikálie, které jsou v tomto testu pozitivní, vykazují také v jiných testech mutagenní aktivitu. Existují ovšem i příklady mutagenních látek, jež se tímto testem neodhalí; důvodem tohoto nedostatku může být specifická povaha vyhodnocovaných veličin, rozdíly v metabolické aktivaci nebo rozdíly v biologické dostupnosti. Na druhé straně faktory, jež citlivost bakteriálního testu reverzní mutace zvyšují, mohou vést k tomu, že se mutagenní aktivita testované látky přecení.

Bakteriální test reverzních mutací může být nevhodný pro určité třídy chemických látek, jakými jsou například některé silně baktericidní sloučeniny (kupříkladu určitá antibiotika) a látky, o nichž se předpokládá nebo ví, že specificky narušují replikační systém savčích buněk (například některé inhibitory topoizomerázy nebo některá analoga nukleozidů); v takovém případě mohou být vhodnější testy na mutace u savců.

Mnohé sloučeniny, jež jsou při tomto testu pozitivní, jsou skutečně karcinogenní pro savce, ovšem korelace není absolutní; závisí na chemické třídě, a existují karcinogeny, které tímto testem odhaleny nejsou, protože působí jiným, negenotoxickým mechanismem nebo mechanismem, který v bakteriálních buňkách neprobíhá.

Suspenze bakteriálních buněk se vystaví působení testované látky za přítomnosti a za nepřítomnosti exogenního systému metabolické aktivace. Při klasické miskové metodě “plate incorporation“ se suspenze smísí s vrchním agarem a vylije na misky s minimální živnou půdou. Při preinkubační metodě se pokusná směs inkubuje a smísí s vrchním agarem a až potom se očkuje na minimální živnou půdu. Při obou metodách se dva až tři dny po inkubaci revertantní kolonie spočítají a výsledek se porovná s počtem spontánně revertujících kolonií na kontrolních miskách s rozpouštědlem.

Je popsáno několik postupů pro provedení testu. Z nich nejběžnější jsou klasická misková metoda [“plate incorporation“] (1) (2) (3) (4), preinkubační metoda (2) (3) (5) (6) (7) (8), fluktuační metoda (9) (10) a suspenzní metoda (11). Jsou také popsány jejich modifikace pro testování plynů nebo par (12).

Postupy popsané v rámci metody se týkají hlavně metody plate incorporation a metody preinkubační. Obě tyto metody jsou přijatelné pro experimenty jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Některé látky se detekují účinněji preinkubační metodou; jedná se o chemické třídy, kam spadají alifatické nitrosaminy s krátkým řetězcem, dvojmocné kovy, aldehydy, azobarviva a diazosloučeniny, pyrrolizidinové alkaloidy, alylové sloučeniny a nitrosloučeniny (3). Také bylo zjištěno, že existují určité třídy mutagenů, které se pomocí uvedených standardních procedur vždy neodhalí. Na ty je třeba pohlížet jako na “speciální případy“, k jejichž detekci je třeba použít jiných metod. Byly identifikovány následující “speciální případy“ (spolu s příklady postupů, které se dají pro jejich detekci použít): azobarviva a diazosloučeniny (3) (5) (6) (13), plyny a těkavé chemikálie (12) (14) (15) (16) a glykosidy (17) (18). Odchylky od standardního postupu je třeba vědecky zdůvodnit.

Čerstvé bakteriální kultury se vypěstují do pozdního exponenciálního nebo počátečního stacionárního stadia růstu (zhruba 10^9 buněk/ml). Kultury v pozdním stacionárním stadiu se nepoužívají. Důležité je, aby kultury použité pro experiment obsahovaly vysoký titr životaschopných bakterií. Titr se dá prokázat buď z historických údajů růstových křivek, nebo v jednotlivých testech stanovením počtu životaschopných buněk očkováním na miskách.

Doporučená inkubační teplota činí 37°C.

Použije se minimálně pět bakteriálních kmenů, které budou zahrnovat čtyři kmeny S. typhimurium (TA 1535; TA 1537 nebo TA97a nebo TA97; TA98; a TA100); u nichž byla prokázána spolehlivost a reprodukovatelnost výsledků mezi různými laboratořemi. Tyto čtyři kmeny S. typhimurium mají na primárním reverzním místě páry bází GC a je známo, že nemusejí detekovat určité oxidační mutageny, látky vyvolávající křížové vazby a hydraziny. Tyto látky se dají detekovat pomocí kmenů E. coli WP2 nebo S. typhimurium TA102 (19), které mají na primárním reverzním místě pár bází AT. Proto je doporučená kombinace kmenů tato:

K detekci mutagenů vytvářejících křížové vazby může být nejvhodnější použít TA102 nebo přidat DNA reparačně proficientní kmen E. coli (např. E. coli WP2 nebo E. coli WP2 (pKM101)).

Je třeba použít zavedených postupů přípravy zásobní kultury, ověření markeru a uchovávání. Pro každý zmrazený preparát zásobní kultury je třeba prokázat závislost na aminokyselině nutné pro růst (histidin v případě kmenů S. typhimurium, tryptofan v případě kmenů E. coli). Podobně je třeba zkontrolovat i další fenotypické charakteristiky, a to: přítomnost či nepřítomnost R-faktor plazmidů tam, kde to přichází v úvahu (např. rezistence vůči ampicilinu u kmenů TA98, TA100 a TA97a nebo TA97, WP2 uvrA (pKM101) a rezistence vůči ampicilinu + tetracyklinu u kmene TA 102); přítomnost charakteristických mutací (tj. rfa mutace u S. typhimurium pomocí citlivosti vůči krystalové violeti a uvrA mutace u E. coli nebo uvrB mutace u S. typhimurium pomocí citlivosti na ultrafialové záření) (2) (3). Použité kmeny mají mít počet spontánně revertujících kolonií ve frekvenčním rozmezí očekávaném podle historických kontrolních dat dané laboratoře a pokud možno i v rozmezí uvedeném v literatuře.

Použije se vhodný minimální agar (např. s Vogelovým-Bonnerovým minimálním médiem E a glukózou) a vrchní agar obsahující histidin a biotin nebo tryptofan umožňující několik dělení buněk (1) (2) (9).

Bakterie se působení testované látky vystaví jak za přítomnosti, tak za nepřítomnosti vhodného systému metabolické aktivace. Nejčastěji se používá kofaktorem suplementovaná post-mitochondriální frakce (S9) připravená z jater hlodavců po indukci enzymů látkami jako je Aroclor 1254 (1) (2) nebo kombinace fenobarbitalu a (β-naftoflavonu (18) (20) (21). Post-mitochondriální frakce se obvykle používá v koncentracích mezi 5 a 30 % v/v ve směsi S9. Volba a podmínky metabolického aktivačního systému mohou záviset na třídě testované chemikálie. V některých případech může být vhodné použít post-mitochondriální frakci v několika koncentracích. U azobarviv a diazosloučenin může být vhodnější použít redukční systém metabolické aktivace (6) (13).

Pevné látky se před působením na bakterie rozpustí nebo se připraví jejich suspenze ve vhodném rozpouštědle nebo vehikulu a případně se zředí. Kapalné látky se mohou do pokusného systému přidávat přímo nebo se předtím ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o stabilitě prokazují, že jejich delší skladování je přijatelné.

Ke kritériím, která je třeba vzít v úvahu při stanovení nejvyššího použitého množství testované látky, patří cytotoxicita a rozpustnost v konečné směsi, která se k působení použije.

Může být účelné stanovit toxicitu a nerozpustnost v předběžném experimentu. Cytotoxicita se dá zjistit snížením počtu revertantních kolonií, vymizením nebo zmenšením růstu na pozadí nebo pomocí stupně přežití pokusných kultur. Za přítomnosti metabolického aktivačního systému se může cytotoxicita změnit. Nerozpustnost se posuzuje podle srážení v konečné směsi za skutečných pokusných podmínek, viditelného i pouhým okem.

Doporučená maximální pokusná koncentrace je u rozpustných necytotoxických látek 5 mg/misku resp. 5 μl/misku. U necytotoxických látek, jež v těchto koncentracích nejsou rozpustné, by jedna nebo několik koncentrací mělo být v konečné pokusné směsi nerozpustných. Testované látky, jež jsou cytotoxické již za koncentrací nižších než 5 mg/misku resp. 5 μl/misku, se testují až do cytotoxické koncentrace. Sraženina nesmí rušit při vyhodnocování.

Používá se minimálně pěti různých analyzovatelných koncentrací se zhruba půllogaritmickým intervalem (tj. √10) mezi jednotlivými body v prvotním experimentu. Zkoumá-li se koncentrační závislost, může být vhodný interval menší. Testování za koncentrací vyšších než 5 mg/misku resp. 5 μl/ misku přichází v úvahu, hodnotí.li se látka obsahující podstatné množství potenciálně mutagenních nečistot.

Každý test musí zahrnovat i souběžnou kmenově specifickou pozitivní a negativní (rozpouštědlo nebo vehikulum) kontrolu, jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Pro pozitivní kontrolu se volí takové koncentrace, jež prokazují efektivnost daného testu.

U testů s metabolickým aktivačním systémem se referenční látka pro pozitivní kontrolu volí podle použitého typu bakteriálního kmene.

Příklady látek, jež jsou vhodné pro pozitivní kontrolu v testech s metabolickou aktivací, uvádí tabulka:

Látka CAS EINECS
9,10-dimethylantracen 781-43-1 212-308-4
7,12-dimethylbenz[a]antracen 57-97-6 200-359-5
benz[a]pyren 50-32-8 200-028-5
2-aminoantracen 613-13-8 210-330-9
cyklofosfamid monohydrát cyklofosfamidu 50-18-0 6055-19-2 200-015-4

Následující látka je vhodnou pozitivní kontrolou při použití metabolické aktivace reduktázami:

Látka CAS EINECS
Kongo červeň 573-58-0 209-358-4

2-aminoantracen se nepoužívá jako jediný indikátor účinnosti směsi S9. Pokud se 2-aminoantracen použije, je třeba každou šarži S9 charakterizovat také mutagenem, který vyžaduje metabolickou aktivaci mikrosomálními enzymy, např. benz[a]pyrenem, dimethylbenzantracenem.

Příklady látek, jež jsou vhodné pro kmenově specifickou pozitivní kontrolu v testech bez exogenního systému metabolické aktivace, uvádí tato tabulka:

Látka CAS EINECS
azid sodný 26628-22-8 247-852-1 TA 1535 a TA 100
2-nitrofluoren 607-57-8 210-138-5 TA 98
9-aminoakridin 90-45-9 201-995-6 TA 1537, TA 97 a TA 97a
ICR 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 a TA 97a
kumen-hydroperoxid 80-15-9 201-254-7 TA 102
mitomycin C 50-07-7 200-008-6 WP2 uvrA a TA 102
N-ethyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin 70-25-7 200-730-1 WP2, WP2uvrA a WP2uvrA(pKM101)
4-nitrochinolin-1-oxid 56-57-5 200-281-1 WP2, WP2uvrA a WP2uvrA(pKM101)
Furylfuramid (AF2) 3688-53-7 kmeny obsahující plazmidy

K pozitivní kontrole lze použít i jiné vhodné referenční látky. Jsou-li dostupné, je třeba uvážit použití chemikálií se vztahem k chemické třídě.

Je třeba použít i negativní kontroly sestávající z rozpouštědla nebo vehikula samotného, bez testované látky, se kterými se jinak zachází stejně jako při použití testované látky. Mimoto se použijí i negativní kontroly bez ovlivnění testovanou látkou, ledaže existují historické kontrolní údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo nevyvolává žádné rušivé či mutagenní účinky.

Při klasické miskové metodě (1) (2) (3) (4) bez metabolické aktivace se obvykle smísí 0,05 nebo 0,1 ml testovaného roztoku, 0,1 ml čerstvé bakteriální kultury (obsahující zhruba 10^8 životaschopných buněk) a 0,5 ml sterilního pufru a 2,0 ml vrchního agaru. V testech s metabolickou aktivací se obvykle mísí 0,5 ml metabolické aktivační směsi obsahující přiměřené množství post-mitochondriální frakce (v rozmezí 5 - 30 % v/v v metabolické aktivační směsi) s 2,0 ml vrchního agaru společně s bakteriemi a testovanou látkou /testovaným roztokem. Obsah každé zkumavky se promísí a nalije na povrch misky s minimálním agarem. Vrchní agar se nechá před inkubací ztuhnout.

Při preinkubační metodě (2) (3) (5) (6) se testovaná látka / testovaný roztok nechá preinkubovat s pokusným kmenem (obsahujícím zhruba 10^8 životaschopných buněk) a sterilním pufrem nebo metabolickým aktivačním systémem (0,5 ml) obvykle po dobu 20 min nebo déle při 30 - 37 °C; potom se smísí s vrchním agarem a nalije na misku s minimálním agarem. Obvykle se mísí 0,05 nebo 0,1 ml testované látky / testovaného roztoku, 0,1 ml bakterií a 0,5 ml směsi S9 nebo sterilního pufru s 2,0 ml vrchního agaru. Zkumavky se během preinkubace provzdušňují třepáním.

Pro adekvátní odhad variací se pro každou dávku očkují tři misky. Duplicitní očkování je přijatelné, je-li vědecky zdůvodněno. Dojde-li náhodně ke ztrátě misky, nemusí to test nutně znehodnotit.

Plynné nebo těkavé látky se testují za použití vhodných postupů, například v zatavených nádobách (12) (14) (15) (16).

Všechny misky v rámci daného testu se inkubují při teplotě 37°C po dobu 48 - 72 hodin, načež se spočítají revertantní kolonie na každé misce.

Údaje se prezentují jako počet revertantních kolonií na jednu misku. Rovněž se uvede počet revertantních kolonií jak z negativní kontroly (rozpouštědlo, popřípadě kontrola bez působení, byla-li použita), tak z kontroly pozitivní. Pro testovanou látku i pro pozitivní a negativní kontrolu (resp. bez působení rozpouštědlo) se uvedou počty pro jednotlivé misky a průměrný počet revertantních kolonií na jednu misku včetně směrodatné odchylky.

Verifikace zjevně pozitivní reakce se nepožaduje. Nejednoznačné výsledky se objasňují dalším testováním, nejlépe za modifikovaných experimentálních podmínek. Negativní výsledky se musejí potvrdit případ od případu. Pokud se potvrzení negativních výsledků nepovažuje za nutné, je třeba to zdůvodnit. V následných experimentech je třeba zvážit modifikaci studijních parametrů tak, aby se rozšířil rozsah posuzovaných podmínek. Ke studijním parametrům, které se dají modifikovat, patří rozdíly mezi koncentracemi, metoda působení („plate incorporation“ nebo preinkubace v tekutém prostředí) a podmínky metabolické aktivace.

Ke stanovení pozitivního výsledku existuje několik kritérií, například dávkově závislý nárůst ve sledovaném rozmezí a/nebo reprodukovatelný nárůst počtu revertantních kolonií na jednu misku při jedné nebo více koncentracích u minimálně jednoho kmene s metabolickým aktivačním systémem nebo bez něj (23). Jako první se uvažuje biologická relevance výsledků. Jako pomůcku při vyhodnocování výsledků testu je možno využít statistické metody (24), statistická významnost by však neměla být jediným určujícím faktorem pro pozitivní reakci.

Testovaná látka, jejíž výsledky výše uvedená kritéria nesplňují, se v tomto testu považuje za nemutagenní.

Většina experimentů sice poskytuje jednoznačně pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech však nelze ze získaného souboru dat vyvodit o aktivitě testované látky definitivní závěr. Výsledky mohou být stále nejednoznačné nebo problematické, i když se experiment několikrát opakuje.

Pozitivní výsledky bakteriálního testu na reverzní mutace ukazují, že látka vyvolává genové mutace typu substitucí bází nebo posunových mutací v genomu Salmonella typhimurium resp. Escherichia coli. Negativní výsledky ukazují, že za daných zkušebních podmínek není testovaná látka ve zkušebním druhu mutagenní.

ZPRÁVA O PRŮBĚHU POKUSU

Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:

Rozpouštědlo/vehikulum:

Kmeny:

Podmínky pokusu:

Výsledky:

Diskuse výsledků.

Závěry.“.

„B.17. MUTAGENITA - TEST GENOVÝCH MUTACÍ V SAVČÍCH BUŇKÁCH IN VITRO

Metoda je replikací OECD TG 476, In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test (1997).

Test genových mutací in vitro se dá používat ke zjišťování genových mutací vyvolaných chemickými látkami. Mezi vhodné buněčné linie patří myší lymfomové buňky L5178Y, linie CHO, CHO-AS52 a V79 buněk čínského křečka a lidské lymfoblastoidní buňky TK6 (1). U těchto buněčných linií se nejčastěji jako konečný genetický efekt zjišťují mutace v thymidinkináze (TK) a hypoxanthin-guanin fosforibosyltransferáze (HPRT) a v transgenní xanthin-guanin fosforibosyltransferáze (XPRT). Testy mutací v TK, HPRT a XPRT se zjišťují různá spektra genetických změn. Autosomální lokalizace TK a XPRT může umožnit detekci i takové genetické změny (např. velké delece), které se na lokusu HPRT chromozomů X nezjistí (2) (3) (4) (5) (6).

K testu na genové mutace v savčích buňkách in vitro se dají použít kultury stabilizovaných buněčných linií nebo buněčných kmenů. Při volbě buněk se berou v úvahu růstové schopnosti dané kultury a stabilita frekvence spontánních mutací.

Testy in vitro obecně vyžadují exogenní zdroj metabolické aktivace. Takový systém metabolické aktivace nedokáže imitovat savčí podmínky in vivo dokonale. Je třeba vzniku takových podmínek, za kterých by výsledky neodrážely vlastní mutagenitu. K pozitivním výsledkům, jež nejsou důsledkem vlastní mutagenity může dojít v důsledku změny pH, osmolality či vysoké cytotoxicity (7).

Tento test se používá ke screeningu možných savčích mutagenů a karcinogenů. Řada sloučenin, které jsou v tomto testu pozitivní, jsou savčími karcinogeny, neexistuje však dokonalá korelace mezi tímto testem a karcinogenitou. Tato korelace závisí na druhu chemické látky a existuje stále více dokladů toho, že existují karcinogeny, které se tímto testem nezjistí, protože zřejmě působí nějakým jiným, negenotoxickým mechanismem či mechanismem, který v bakteriálních buňkách nepůsobí (6).

Forward mutace: genová mutace výchozího typu mutantní formy, jež vede ke změně nebo ztrátě enzymatické aktivity kódovaného proteinu.

Mutageny vyvolávající substituci páru bází: látky způsobující substituci jednoho nebo několika páru bází v DNA.

Frameshift mutageny (mutageny vyvolávající posunové mutace): látky, jež způsobují přidání nebo ztrátu jednoho nebo více párů bází v DNA.

Doba fenotypické exprese: období, během kterého jsou z nově zmutovaných buněk odstraňovány nezměněné genové produkty.

Frekvence mutací: počet pozorovaných mutovaných buněk dělený počtem živých buněk.

Relativní celkový růst: nárůst počtu buněk v čase v porovnání s kontrolní populací buněk; vypočítává se jako součin poměrného suspenzního růstu (v porovnání s negativní kontrolou) a poměrné klonovací účinnosti cloning efficiency (v porovnání s negativní kontrolou).

Relativní suspenzní růst: poměrný nárůst počtu buněk během období exprese v porovnání s negativní kontrolou.

Životnost (viabilita): klonovací účinnost (cloning efficiency) ovlivněných buněk v době inokulace na miskách v selekčních podmínkách po období exprese.

Přežití: klonovací účinnost (cloning efficiency) ovlivněných buněk inokulovaných na miskách na konci působení látky; vyjadřuje se obvykle v porovnání s přežitím kontrolní buněčné populace.

Buňky, deficientní na thymidinkinázu (TK) v důsledku mutace TK^+/- → TK^-/-, jsou rezistentní vůči cytotoxickému působení pyrimidinového analogu trifluorthymidinu (TFT). Buňky produkující thymidinkinázu jsou vůči TFT citlivé, což způsobuje inhibici buněčného metabolismu a zastavuje další buněčné dělení. Za přítomnosti TFT proto mohou proliferovat mutované buňky, zatímco normální buňky, obsahující thymidinkinázu, proliferovat nemohou. Podobně jsou buňky s deficientní HPRT nebo XPRT selekčně rezistentní vůči 6-thioguaninu (TG) nebo 8-azaguaninu (AG). Pokud je analog báze nebo sloučenina příbuzná se selekčním činidlem analyzována v některém testu na genové mutace v savčích buňkách, je třeba vlastnosti testované látky bedlivě zvážit. Například je třeba prozkoumat každé podezření na selekční toxicitu testované látky vůči buňkám s mutacemi i bez nich. Testují-li se tedy chemikálie strukturně příbuzné se selekčním činidlem, je třeba potvrdit, že je selekční systém/činidlo vhodné (8).

Buňky v suspenzi nebo jednovrstevné kultuře se po vhodnou dobu vystaví působení testované látky s metabolickou aktivací i bez ní a kultivují se ke stanovení cytotoxicity a k detekci fenotypické exprese před výběrem mutantů (9) (10) (11) (12) (13). Cytotoxicita se stanoví obvykle hodnocením relativní klonovací účinnosti (přežití) (cloning efficiency) nebo relativního celkového nárůstu kultur po působení látky. Kultury se ponechají v růstovém médiu po dostatečnou dobu, charakteristickou pro daný lokus a typ buňky, aby mohlo dojít k co nejoptimálnější fenotypické expresi indukovaných mutací. Frekvence mutantů se stanoví inokulací známého počtu buněk v médiu obsahujícím selekční činidlo pro detekci mutovaných buněk a v médiu bez tohoto činidla, ke stanovení klonovací účinnosti (cloning efficiency), (životnosti). Po vhodné inkubační době se kolonie spočítají. Mutační frekvence se odvodí z počtu kolonií mutovaných buněk v selekčním médiu a z počtu kolonií v neselekčním médiu.

Dá se použít celá řada buněčných typů, včetně subklonů buněk L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 a TK6. U buněčných typů používaných v tomto testu musí být prokázaná citlivost vůči chemickým mutagenům, vysoká klonovací účinnost (cloning efficiency) a stabilní frekvence spontánních mutací. U buněk se kontroluje, zda nejsou kontaminovány mykoplazmaty; infikované buňky se použít nesmějí.

Test je třeba naplánovat tak, aby měl zvolenou citlivost a efektivnost (power). Počet buněk, počet kultur a koncentrace testované látky musí těmto definovaným parametrům vyhovovat (14). Minimální počet vitálních buněk, které přežijí expozici a použijí se v jednotlivých stadiích testu, je dán frekvencí spontánních mutací. Obecným vodítkem je, že počet buněk má být minimálně desetinásobkem převrácené hodnoty frekvence spontánních mutací. Doporučuje se však použít alespoň 10^6 buněk. Měly by být k dispozici adekvátní historické údaje, kterými by se prokázala bezproblémové zvládnutí testu.

Je třeba použít vhodná kultivační média a inkubační podmínky (kultivační nádoby, koncentraci CO2, teplotu a vlhkost). Média se pro test volí podle selekčního systému a typu buňky. Zvláště důležité je, aby podmínky kultivace zajišťovaly optimální růst buněk během expresní periody a schopnost jak mutovaných, tak nemutovaných buněk tvořit kolonie.

Buňky se namnoží ze zásobních kultur, inokulují do kultivačního média a inkubují při teplotě 37°C. Před provedením testu, je třeba kultury zbavit dříve vzniklých mutovaných buněk.

Na buňky se testovanou látkou působí v přítomnosti i v nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Nejobvyklejší je kofaktory suplementovaná mitochondriální frakce (S9) připravená z jater hlodavců, ovlivněná činidly indukujícími enzymy jako je Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18), nebo směs fenobarbitalu a β-naftoflavonu (19) (20).

Konečná koncentrace mitochondriální frakce v médiu činí obvykle 1 - 10 % v/v. Aktivita metabolického aktivačního systému bude záviset na tom, jakého typu je testovaná chemikálie. V některých případech je vhodné použít mitochondriální frakci v několika koncentracích.

Pro účely endogenní aktivace mohou být použity i geneticky modifikované buněčné linie exprimující specifické aktivační enzymy. Výběr buněčných linií by měl být vědecky ověřen (např. vztahem isoenzymu cytochromu P450 k metabolismu testované látky).

Je-li testovaná látka v pevném stavu, látka se před působením na buňky rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle a případně naředí. Kapalné testované látky se mohou do systému přidávat přímo nebo se předtím ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o jejich stabilitě prokazují, že delší skladování neovlivňuje jejich vlastnosti.

U zvoleného rozpouštědla nesmí existovat podezření, že by mohlo s testovanou látkou chemicky reagovat, a nesmí narušovat přežívání buněk a aktivitu S9. Používá-li se méně známé rozpouštědlo musí být podpořeno referencemi prokazujícími jeho kompatibilitu. Doporučuje se, aby všude tam, kde je to možné, bylo na prvním místě zvažováno použití jako rozpouštědla vody. Je-li testovaná látka ve vodě nestálá, musí být použité organické rozpouštědlo zcela bezvodé. Voda se dá odstranit molekulárním sítem.

Mezi kritéria, jež se uvažují při stanovování nejvyšší koncentrace, patří cytotoxicita, rozpustnost v systému a změny pH resp. osmolality.

Cytotoxicita se stanoví s metabolickou aktivací i bez ní v hlavním experimentu, přičemž se použije vhodné indikace buněčné integrity a růstu buněk, jako je relativní klonovací účinnost (přežití) nebo relativní celkový růst. Je vhodné stanovit cytotoxicitu a rozpustnost v předběžných experimentech.

Použijí se minimálně čtyři analyzovatelné koncentrace. Dochází-li k cytotoxicitě, musí tyto koncentrace pokrývat rozsah od maximální do nízké nebo nulové toxicity. To obvykle znamená, že se jednotlivé koncentrace nebudou lišit více než násobkem, který leží mezi hodnotami 2 a √10. Vychází-li maximální koncentrace z cytotoxicity, měla by vést k relativnímu přežití (relativní klonovací účinnosti) nebo relativnímu celkovému růstu v 10-20 %, ne však méně než 10 %. U relativně netoxických látek by maximální expoziční dávka měla být nejnižší z hodnot 5 mg/ml, 5 μl/ml a 1,01 M.

U relativně nerozpustných látek, jež jsou netoxické v koncentracích nižších než je koncentrace při které se již látka nerozpouští, má být nejvyšší použitá koncentrace vyšší než je mez rozpustnosti ve finálním kultivačním médiu na konci kultivace s testovanou látkou. Může být účelné vyhodnotit rozpustnost na začátku a na konci působení, jelikož se rozpustnost může během expozice v důsledku přítomnosti buněk, S9, séra atd. měnit. Nerozpustnost se dá zjistit i prostým okem.. Sraženina nesmí být na překážku při hodnocení buněk.

V rámci každého experimentu se musejí provést i souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo, vehikulum) kontroly, a to jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Pokud se aplikuje metabolická aktivace, musí být pozitivní kontrola látka vyžadující metabolickou aktivaci k vyvolání mutagenního účinku. Mezi látky pro pozitivní kontrolu patří například:

Metabolická aktivace Lokus Látka CAS EINECS
Ne HPRT ethyl methansulfonát 62-50-0 200-536-7
ethyl nitrosomočovina 759-73-9 212-072-2
TK (malé a velké kolonie) methyl methansulfonát 66-27-3 200-625-0
XPRT ethyl methansulfonát 62-50-0 200-536-7
ethyl nitrosomočovina 759-73-9 212-072-2
Ano HPRT 3-methylcholantren 56-49-5 200-276-4
N-nitrosodimethylamin 62-75-9 200-549-8
7,12-dimethylbenzantracen 57-97-6 200-359-5
TK (malé a velké kolonie) cyklofosfamid 50-18-0 200-015-4
monohydrát cyklofosfamidu 6055-19-2
benzo[a]pyren 50-32-8 200-028-5
3 -methylcholantren 56-49-5 200-276-5
XPRT N-nitrosodimethylamin (pro vysoké koncentrace S-9) 62-75-9 200-549-8
benzo[a]pyren 50-32-8 200-028-5

Pro pozitivní kontrolu se mohou použít i jiné vhodné látky; jestliže má například laboratoř historickou údaje o 5-brom-2'-deoxyuridinu (CAS 59-14-3, číslo EINECS 200-415-9), lze použít i tuto referenční látku. Tam, kde je to možné, je vhodné použít pro pozitivní kontrolu látku ze stejné chemické skupiny.

Pro každý časový interval sklízení kultur je třeba použít i negativní kontrolu, ve které se používá rozpouštědlo nebo vehikulum v kultivačním médiu, zpracované stejným způsobem jako experimentální kultury. Mimoto je rovněž třeba zařadit kontrolu bez jakéhokoliv ovlivnění, ledaže existují historické údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo/vehikulum nevykazuje žádné pro buňky nepříznivé či mutagenní účinky.

Na proliferující buňky se působí testovanou látkou jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Expozice probíhá po vhodnou dobu (obvykle je účinná doba 3-6 hodin). Doba expozice může přesáhnout jeden nebo více buněčných cyklů.

Pro každou koncentraci se používají kultury duplicitní nebo jenom jedna. Používá-li se jenom jedna kultura, je třeba zvýšit počet koncentrací tak, aby se zajistil adekvátní počet kultur k analýze (tj. minimálně osm analyzovatelných koncentrací). Kultury s negativní kontrolou (rozpouštědlem/vehikulem) se používají duplicitní.

V případě plynných nebo těkavých látek je třeba uplatnit v testu vhodné postupy, jako je použití neprodyšně uzavřených kultivačních nádob (21, 22).

Po skončení expozice se buňky promyjí a kultivují ke stanovení přežívání a fenotypické exprese. Po expozici se obvykle začíná s analýzou cytotoxicity stanovením klonovací účinnosti - cloning efficiency nebo relativního celkového růstu.

Každý lokus má určitou minimální časový interval pro téměř optimální expresi nově indukovaných mutantů (HPRT a XPRT vyžaduje minimálně 6 – 8 dní, TK minimálně 2 dny). Buňky se pěstují v médiu s a bez selekčního činidla pro stanovení počtu mutantů a klonovací účinnosti. Po skončení doby exprese se začne s analýzou životnosti (používané k výpočtu četnosti mutantů) inokulací buněk na neselekční médium.

Pokud je látka v testu L5178Y TK^+/^- pozitivní, je třeba minimálně na jedné z experimentálních kultur (nejvyšší pozitivní koncentrace) a na negativních a pozitivních kontrolách stanovit velikost kolonií. Pokud je látka v tomto testu negativní, změří se velikost kolonií u negativní a pozitivní kontroly. Měření se může provést i ve studiích s TK6TK^+/^-.

Jako data slouží výsledky stanovení cytotoxicity a životnosti, počty kolonií a mutační frekvence u experimentálních a kontrolních kultur. V případě pozitivní reakce v testu L5178TK^+/^- se kolonie hodnotí pomocí kritérií malých a velkých kolonií přinejmenším v jedné koncentraci testované látky (nejvyšší pozitivní koncentrace) a v negativní a pozitivní kontrole. Molekulární a cytogenetické vlastnosti velkých i malých kolonií byly podrobně prostudovány v publikacích (23) (24). Při testu TK^+/^- se kolonie hodnotí podle kritéria kolonií normálního růstu (velké) a pomalého růstu (malé) (25). Mutanty, které utrpěly nejrozsáhlejší genetické poškození, mají delší dobu zdvojení a proto tvoří malé kolonie. Rozmezí tohoto poškození obvykle sahá od ztráty celého genu po karyotypicky viditelné chromozómové aberace. Tvorba malých kolonií je asociována s expozicí látkám indukujících hrubé chromozómové aberace (26). Méně závažně postižené mutanty rostou podobnou rychlostí jako buňky rodičovské a vytvářejí velké kolonie.

Je třeba uvádět také přežití (relativní klonovací účinnost - relative cloning efficiency) nebo relativní celkový růst. Mutační frekvence se vyjadřuje jako počet mutovaných buněk dělený počtem přežívajících buněk.

Uvádějí se individuální údaje o kultivačních podmínkách; nakonec se všechna data shrnou v tabelární formě.

Verifikace zjevně pozitivní reakce se nepožaduje. Nejednoznačné výsledky se objasňují dalším testováním, nejlépe za modifikovaných experimentálních podmínek. Negativní výsledky se musí potvrdit případ od případu. V případech, kdy se potvrzení negativních výsledků nepovažuje za nutné, je třeba podat zdůvodnění. V případě nejednoznačných nebo negativních výsledků je třeba v následných experimentech zvážit modifikaci parametrů studie tak, aby se rozšířilo rozmezí podmínek. K parametrům, které se dají v experimentu modifikovat, patří rozdíly mezi jednotlivými koncentracemi a podmínky metabolické aktivace.

Ke stanovení pozitivního výsledku existuje několik kritérií, například na koncentraci testované látky závislý nárůst nebo reprodukovatelný nárůst mutační frekvence. Nejprve je třeba uvážit biologickou významnost výsledků. Při vyhodnocování výsledků testu se mohou použít statistické metody. Statistická významnost by však neměla být jediným určujícím faktorem pozitivního výsledku.

Testovaná látka, při jejímž použití výsledky nesplňují výše uvedená kritéria, se v tomto systému považuje za nemutagenní. Většina experimentů sice poskytuje jednoznačně pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech však nelze ze získaného souboru dat vyvodit o aktivitě testované látky definitivní závěr. Výsledky mohou být stále nejednoznačné nebo problematické, i když se experiment několikrát opakuje.

Pozitivní výsledky testu na genové mutace v savčích buňkách in vitro ukazují, že testovaná látka vyvolává v kultuře savčích buněk genové mutace. Nejprůkaznější je reprodukovatelný pozitivní efekt dávka-účinek. Negativní výsledky ukazují, že za daných experimentálních podmínek testovaná látka v kultuře savčích buněk nevyvolává genové mutace.

ZPRÁVA O PRŮBĚHU POKUSU

Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:

Rozpouštědlo/vehikulum:

Buňky:

Podmínky pokusu:

Výsledky:

Diskuse výsledků.

Závěry.“.

„B.23. ANALÝZA CHROMOSÓMOVÝCH ABERACÍ V SAVČÍCH SPERMATOGONIÍCH

Metoda je replikací OECD TG 483, Mammalian Spermatogonial Chromosome Aberration Test (1997).

Účelem testu je in vivo identifikovat látky způsobující strukturální chromozómové aberace v savčích spermatogoniích (1) (2) (3) (4) (5). Strukturální aberace jsou dvojího druhu: chromozómové a chromatidové. Aberace vyvolané chemickými mutageny jsou většinou chromatidové, ovšem k aberacím chromozómového typu dochází rovněž. Tato metoda není určena k analýze numerických aberací a běžně se k tomuto účelu nepoužívá. Chromozómové mutace a příbuzné jevy jsou u člověka příčinou řady genetických chorob.

Tímto testem se analyzují chromozómové aberace v spermatogoniích a proto se předpokládá, že dokáže predikovat indukci dědičných mutací v zárodečných buňkách.

K testu se obvykle používají hlodavci. Tímto cytogenetickým testem in vivo se zjišťují chromozómové aberace v mitózách spermatogonií.Tato metoda nepoužívá jiné cílové buňky.

Aby se ve spermatogoniích zjistily aberace chromatidového typu, je třeba analyzovat první mitózu po působení testované látky, dříve než se poškození ztratí v následujícím buněčném dělení. Další informace z ovlivněných spermatogonií lze získat analýzou meiotických chromozómů, kde se zjišťují aberace chromozómového typu v diakinéze I, když se ovlivněné buňky mění ve spermatocyty.

Tento test in vivo je určen ke zjišťování, zda jsou mutageny aktivní v somatických buňkách také aktivní v buňkách zárodečných. Mimoto má test význam také pro hodnocení rizika mutagenity tím, že umožňuje posuzovat faktory metabolismu in vivo, farmakokinetiky a reparačních procesů DNA.

V testes je přítomna řada generací spermatogonií se širokým spektrem citlivosti vůči chemickým látkám. Zjištěné aberace tedy představují souhrn reakcí ovlivněných populací spermatogonií, kde převládají diferencované spermatogonie. Podle jejich polohy ve varleti pak různé generace spermatogonií mohou, ale nemusejí být exponovány krevním oběhem kvůli anatomické a fyziologické bariéře Sertoliho buněk a hemato-testikulární bariéře.

Existují-li doklady toho, že se testovaná látka nebo její reaktivní metabolit do cílové tkáně nedostane, není tato látka pro test vhodná.

Aberace chromatidového typu: strukturální poškození chromozómu, které se projevuje jako zlom jedné, případně obou chromatid, nebo zlom a opětovné spojení mezi chromatidami.

Aberace chromozómového typu: strukturální poškození chromozómu vyjádřená jako zlom respektive jako zlom a opětovné spojení obou chromatid na stejném místě (zahrnuty jsou aberace typu dicentrický chromozóm, prsténčitý chromozóm-ring)

Zlom chromatidy: jako zlom lze hodnotit porušení kontinuity jedné nebo obou chromatid za předpokladu, že vzniklá mezera ve struktuře chromatidy je větší než je šířka poškozené chromatidy. Dále pak v případech, koncový (distální) fragment v místě zlomu je dislokovaný (nebo mimo osu chromatidy), případně jedna chromatida hodnoceného chromozómu je kratší v důsledku delece.

Gap: achromatická léze menší než šířka jedné chromatidy a s minimálním vybočením chromatid.

Numerická aberace: změna počtu chromozómů oproti normálnímu počtu charakteristickému pro použité buňky.

Polyploidie: násobek haploidního počtu chromozómů (n) jiný než diploidní počet (tedy 3n, 4n atd.).

Strukturální aberace: změna chromozómové struktury zjistitelná mikroskopickou analýzou buněčného dělení ve stádiu metafáze, pozorovaná jako delece a fragmenty, a výměny.

Zvířata se vhodným způsobem exponují testované látce a ve vhodnou dobu po působení se usmrtí. Před usmrcením se na ně působí látkou zastavující metafázi (například kolchicinem nebo Colcemidem®). Ze zárodečných buněk se pak připraví preparáty a po obarvení se v metafázích analyzují chromozómové aberace.

Běžně se používají samci čínských křečků a myší, lze ovšem použít samce jakéhokoliv jiného vhodného savčího druhu. Používají se běžné laboratorní kmeny mladých zdravých dospělých jedinců. Hmotnostní rozdíly by při zahájení studie měly být minimální a u každého pohlaví nemají přesahovat ± 20 % průměrné hmotnosti.

Všeobecné podmínky chovu jsou uvedeny ve Všeobecném úvodu v části B.

Vlhkost by měla být 50 - 60 %.

Zdraví mladí dospělí jedinci se náhodně rozdělí do kontrolní a experimentální skupiny. Jedinci se jednoznačně označí a po dobu minimálně pěti dní se zvířata aklimatizují v laboratorních podmínkách. Klece je třeba uspořádat tak, aby se minimalizovaly případné vlivy toho, jak a kde jsou klece umístěny.

Je-li testovaná látka v pevném stavu a je-li to možné, látka se před podáním zvířatům rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle nebo vehikulu. Kapalné testované látky se mohou podávat přímo nebo se před podáváním ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o stálosti (stabilitě) prokazují, že skladování ji neovlivní.

Rozpouštědlo/vehikulum v používaných dávkách nesmí vyvolávat toxické účinky a nesmí s testovanou látkou chemicky reagovat. Používá-li se nepříliš známé rozpouštědlo, musí být jeho použití podpořeno údaji o kompatibilitě s testovanou látkou. Doporučuje se, aby kde je to možné, bylo na prvním místě použito vodné rozpouštědlo/ vehikulum.

Do každého testu je třeba pro každé pohlaví zařadit souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly. Je třeba zacházet se zvířaty ve všech skupinách stejně.

Pozitivní kontroly by měly ve spermatogoniích vykazovat chromozómové aberace in vivo při dávkách kdy lze očekávat jejich detekovatelné zvýšení nad spontánní úroveň.

Dávky při pozitivní kontrole se volí tak, aby byly účinky patrné, ale přitom nenapovídaly hodnotiteli totožnost zakódovaného preparátu. Pozitivní kontrolu je možné podávat odlišným způsobem než testovanou látku a vzorek odebírat v jednom časovém intervalu. Kde je to možné, je třeba používat pozitivní kontrolu ze stejné chemické skupiny, jako je testovaná látka. Příklady látek vhodných pro pozitivní kontrolu.

Látka CAS EINECS
cyklofosfamid monohydrát cyklofosfamidu 50-18-0 6055-19-2 200-015-4
cyklohexylamin 108-91-8 203-629-0
mitomycin C 50-07-7 200-008-6
akrylamid monomer 79-06-1 201-173-7
triethylenmelamin 51-18-3 200-083-5

Negativní kontroly ovlivněné rozpouštědlem nebo vehikulem a zpracované stejným způsobem jako experimentální skupiny měly by být zařazeny do všech časových intervalů zpracování, pokud nejsou k dispozici přijatelné historické údaje o frekvenci buněk s aberacemi a o interindividuální variabilitě mezi zvířaty. Mimoto je třeba použít i neovlivněných kontrol, ledaže existují historické nebo publikované údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo, nebo vehikulum nevyvolává žádné nepříznivé nebo mutagenní účinky

V každé zkušební a kontrolní skupině musí být minimálně pět analyzovatelných samců.

Testovaná látka se podává nejlépe jednorázově nebo ve dvou dávkách. Pokud se jedná o objemnou dávku, může se k usnadnění aplikace rozdělit, tj. na dvě dávky za den podané v rozmezí nanejvýše několika hodin. Jiné režimy dávkování musejí být vědecky odůvodněné.

V případě skupiny s nejvyšší dávkou se vzorky po expozici látce odebírají dvakrát. Jelikož testovaná látka může ovlivňovat kinetiku buněčného dělení, provádí se jeden dřívější a jeden pozdější odběr zhruba 24 a 48 hodin po expozici. U ostatních dávek (tj. mimo dávku nejvyšší) se odběr vzorků provádí po 24 hodinách nebo po 1,5-násobku délky buněčného cyklu po expozici, ledaže je znám vhodnější časový interval pro detekci účinku (6).

Kromě toho mohou být použity jiné časové intervaly odběru vzorků. Např. jedná-li se o látku zpomalující pohyb chromozómů během mitósy, nebo látku s účinky nezávislými na S-fázi cyklu, jsou vhodnější dřívější doba odběru vzorku (1).

Zda je vhodné nechat látku působit opakovaně, se posuzuje případ od případu. Pokud se provádí aplikace látky opakovaně, usmrcují se zvířata po 24 hodinách (1,5-násobku buněčného cyklu) od poslední aplikace. Odběry lze provádět i v dalších intervalech, považuje-li se to za účelné.

Před usmrcením se zvířatům intraperitoneálně injikuje vhodná dávka Colcemidu® nebo kolchicinu a následně se z nich ve vhodném intervalu odeberou vzorky. U myší je tento interval zhruba 3-5 hodin, u čínských křečků zhruba 4-5 hodin.

Provádí-li se studie ke zjištění rozpětí toxicity, protože nejsou k dispozici žádné vhodné údaje, je třeba ji provádět v téže laboratoři za použití stejného živočišného druhu, kmene a pokusného režimu, jaké se použijí v hlavní studii (7). Při zjištění toxicity se užívají pro první časový interval odběru vzorků tři dávky tak, aby pokrývaly rozmezí od maximální toxicity k toxicitě nízké nebo nulové. Pro pozdější čas odběru vzorků je pak třeba použít jenom nejvyšší dávku. Ta je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že při vyšších dávkách ve stejném režimu podávání by účinky byly letální.

Látky, jež v nízkých netoxických dávkách vykazují specifickou biologickou aktivitu, jako jsou hormony nebo mitogeny, mohou představovat výjimky z těchto kritérií pro stanovení dávek a vyhodnocují se případ od případu. Nejvyšší dávka může být také definována jako dávka, která vede k určitým známkám toxicity ve spermatogoniích (např. pokles poměru mitóz spermatogonií k první a druhé meiotické metafázi; tento pokles nemá být vyšší než 50 %).

Jestliže test při dávce minimálně 2000 mg/kg hmotnosti v jedné dávce nebo ve dvou dávkách podaných v jeden den nevyvolává žádné pozorovatelné toxické účinky a jestliže se na základě údajů o látkách s podobnou chemickou strukturou neočekává genotoxicita, nemusí být provedena celá studie za použití tří dávkových úrovní. Podle očekávané humánní expozice se může použít v limitním testu vyšší dávky.

Testovaná látka se obvykle vpravuje buď žaludeční sondou, nebo intraperitoneální injekcí. V odůvodněných případech mohou být přijatelné i jiné způsoby expozice. Maximální objem kapaliny, která se dá sondou nebo injekcí najednou vpravit, závisí na velikosti pokusného zvířete a nemá překročit 2 ml/100 g hmotnosti; vyšší dávky musí být zdůvodněné. S výjimkou dráždivých nebo žíravých látek, jež normálně vykazují při vyšších koncentracích horší účinky, je třeba upravit koncentrace látky tak, aby objem byl ve všech dávkových úrovních stejný a minimalizovala se tak objemová variabilita.

Okamžitě po usmrcení zvířete se připraví z jednoho nebo z obou varlat připraví buněčná suspenze, na kterou se působí hypotonickým roztokem a fixuje se. Buněčná suspenze se nakape na podložní sklo a obarví.

U každého jedince se analyzuje minimálně 100 dobře rozprostřených metafází (tj. minimálně 500 metafází v jedné skupině). Tento počet se dá snížit, je-li počet pozorovaných aberací vysoký. Všechny mikroskopické preparáty (včetně pozitivních a negativních kontrol) se před analýzou nezávisle zakódují. Jelikož fixační postupy často vedou k rozbití určitého podílu metafázických buněk a ztrátě chromozómů, musí být u všech typů buněk počet centromer v hodnocených buňkách roven číslu 2n ± 2.

Údaje z jednotlivých zvířat se prezentují v tabelární formě. Experimentální jednotkou je jedinec. U každého jedince se vyhodnocuje počet buněk se strukturálními chromozómovými aberacemi a počet aberací na jednu buňku. U experimentálních i kontrolních skupin se zaznamenají jednotlivé typy strukturálních chromozómových aberací, jejich počet a četnost. Gapy se zaznamenávají zvlášť, uvádějí se, ale obvykle se do celkové četnosti aberací nezahrnují.

Je-li analyzována mitóza i meióza, stanoví se u všech pokusných zvířat i zvířat z negativní kontroly jakožto míra cytotoxicity poměr mitóz spermatogonií k první a druhé meiotické metafázi, a to tak, že se z každého jedince použije 100 dělících se buněk. Je-li analyzována pouze mitóza, stanoví se mitotický index u minimálně 1000 buněk z každého jedince.

Ke zjišťování pozitivního výsledku se používá několik kritérií, například na koncentraci testované látky závislá frekvence buněk s chromozómovými aberacemi, nebo zřetelný nárůst počtu buněk s aberacemi ve skupině ovlivněné jednorázovou dávkou a s jedním časovým intervalem odběru vzorků. Nejprve je třeba uvážit biologickou významnost výsledků. Při vyhodnocování výsledků testu je možno využít statistické metody (8); statistická významnost by však neměla být jediným určujícím faktorem pozitivního výsledku. Nejednoznačné výsledky je třeba vyjasnit dalším testováním, nejlépe za modifikovaných experimentálních podmínek.

Testovaná látka, při jejímž použití výsledky nesplňují výše uvedená kritéria, se v tomto systému považuje za nemutagenní.

Ačkoliv většina experimentů vykazuje jasně pozitivní, nebo negativní výsledky, ve výjimečných případech získaná data nedovolují jednoznačné posouzení účinku testované látky. Výsledky mohou být nejisté, nebo diskutabilní bez ohledu na počet opakovaných experimentů.

Pozitivní výsledky testu ukazují, že testovaná látka vyvolává v zárodečných buňkách příslušného živočišného druhu strukturální chromozómové aberace. Negativní výsledky ukazují, že za daných experimentálních podmínek testovaná látka v zárodečných buňkách příslušného živočišného druhu chromozómové aberace nevyvolává.

Je třeba diskutovat, jaká je pravděpodobnost, že testovaná látka dosáhne širokého použití nebo je specifická pro určitou cílovou tkáň (např. systémová toxicita).

ZPRÁVA O PRŮBĚHU POKUSU

Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:

Rozpouštědlo / vehikulum:

Pokusná zvířata:

Podmínky pokusu:

Výsledky:

Diskuse výsledků.

Závěry.“.

„B.39. TEST NEPLÁNOVANÉ SYNTÉZY DNA V SAVČÍCH JATERNÍCH BUŇKÁCH IN VIVO

Metoda je replikací OECD TG 486, Unscheduled DNA Synthesis (UDS) Test with Mammalian Liver Cells In Vivo (1997).

Účelem testu neplánované syntézy DNA (unscheduled DNA synthesis, UDS) v savčích jaterních buňkách in vivo je určit látky, vyvolávající reparaci DNA v jaterních buňkách pokusných zvířat (1) (2) (3) (4).

Tento test in vivo představuje metodu pro zjišťování genotoxických účinků chemických látek v játrech. Výsledek testu indikuje poškození DNA v jaterních buňkách a její následnou reparaci. Játra jsou obvykle hlavním místem metabolismu absorbovaných sloučenin; jsou proto vhodným objektem pro detekci poškození DNA in vivo.

Existují-li doklady o tom, že se testovaná látka do cílové tkáně nedostane, není tento test vhodný.

Výsledek neplánované syntézy DNA (UDS) se hodnotí tak, že se stanoví absorpce značených nukleosidů v buňkách, které neprocházejí plánovanou (S-fáze) syntézou DNA. Nejběžnější je metoda, při které se autoradiograficky stanoví thymidin značený tritiem (^3H-TdR). Pro testy UDS in vivo se nejčastěji používají potkaní játra. Jiné tkáně než játra se sice také mohou použít, nejsou však předmětem této metody.

Detekce odpovědi závisí na počtu bází DNA, jež jsou v místě poškození odstraněny a nahrazeny. Proto je metoda UDS zvláště vhodná k detekci látek indukujících „longpatch repair“ (20 – 30 bází), zatímco pro látky indukující „shortpatch repair“ (1 – 3 báze) je méně citlivá. Dále může docházet k mutacím v důsledku neopravení, chybného opravení nebo chybné replikace lézí DNA. Rozsah odpovědi UDS neříká nic o přesnosti procesu reparace. Mimoto je možné, že mutagen bude sice s DNA reagovat, ale poškození DNA není opraveno excizním reparačním procesem. To, že UDS test neposkytuje o mutagenní aktivitě specifické informace, je vyváženo jeho potenciální citlivostí, protože poskytuje výsledek v celém genomu.

Buňky v reparaci: net nuclear grain (NNG) vyšší než určitá, předem stanovená hodnota, kterou zdůvodní laboratoř provádějící test.

Net nuclear grains (NNG): kvantitativní míra UDS aktivity buněk při autoradiografických testech UDS, vypočtená jako rozdíl mezi počtem zrn v jádře (NG) a průměrným počtem zrn v cytoplasmě (CG): NNG = NG - CG. Počty NNG se vypočítávají pro jednotlivé buňky a následně přepočítány na buňky v kultuře, v paralelních kulturách apod.

Neplánovaná syntéza DNA (unscheduled DNA synthesis, UDS): opravná syntéza DNA po excizi a odstranění úseku DNA obsahujícího oblast poškození vyvolaného chemickou látkou nebo fyzikálním činidlem.

Test UDS v savčích jaterních buňkách in vivo indikuje reparační syntézu DNA po excizi a odstranění segmentu DNA obsahujícího oblast poškození vyvolaného chemickou látkou nebo fyzikálním působením. Test vychází obvykle z inkorporace ^3H-TdR do DNA jaterních buněk, charakteristických nízkým počtem buněk v S-fázi buněčného cyklu. Inkorporace ^3H-TdR se obvykle stanoví autoradiograficky, protože tato technika není tak náchylná k interferenci s buňkami v S-fázi, jako je např. scintilační metoda.

Běžně se používají potkani, lze ovšem použít jakýkoliv vhodný savčí druh. Používají se běžné laboratorní kmeny mladých zdravých dospělých jedinců. Hmotnostní rozdíly by při zahájení studie měly být minimální a u každého pohlaví nemají přesahovat ± 20 % průměrné hmotnosti.

Všeobecné podmínky chovu jsou uvedeny ve Všeobecném úvodu v části B.

Vlhkost by měla být 50 - 60 %.

Zdraví mladí dospělí jedinci se náhodně rozdělí do kontrolní a experimentální skupiny. Jedinci se jednoznačně označí a po dobu minimálně pěti dní se zvířata aklimatizují v laboratorních podmínkách. Klece je třeba uspořádat tak, aby se minimalizovaly případné vlivy toho, jak a kde jsou klece umístěny.

Je-li testovaná látka v pevném stavu a je-li to možné, látka se před podáním zvířatům rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle nebo vehikulu. Kapalné testované látky se mohou podávat přímo nebo se před podáváním ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o stálosti (stabilitě) prokazují, že skladování ji neovlivní.

Rozpouštědlo / vehikulum v používaných dávkách nesmí vyvolávat toxické účinky a nesmí s testovanou látkou chemicky reagovat. Používá-li se ne příliš známé rozpouštědlo, musí být jeho použití podpořeno údaji o kompatibilitě s testovanou látkou. Doporučuje se, aby kde je to možné, bylo na prvním místě použito vodné rozpouštědlo / vehikulum.

Do každého testu je třeba pro každé pohlaví zařadit souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly. Je třeba zacházet se zvířaty ve všech skupinách stejně.

Pozitivní kontroly by měly indukovat UDS při dávkách kdy lze očekávat jejich detekovatelné zvýšení nad spontánní úroveň. Pozitivní kontroly vyžadující metabolickou aktivaci se používají v dávkách vedoucích ke středně vysoké odezvě (4). Dávky při pozitivní kontrole se volí tak, aby byly účinky patrné, ale přitom nenapovídaly hodnotiteli totožnost zakódovaného preparátu. Mezi látky pro pozitivní kontrolu patří například:

Doba odběru vzorku Látka CAS EINECS
odběr v intervalu (2 – 4 hodiny) N-nitrosodimethylamin 62-75-9 200-249-8
odběr v intervalu (12 – 16 hodin) N-2-fluorenylacetamid (2-AAF) 53-96-3 200-188-6

Je možno použít i jiné vhodné látky. Je možná aplikace pozitivní kontroly jinou cestou, než je podávána testovaná látka.

V každé skupině musí být minimálně tři analyzovatelní jedinci. Pokud existuje historická databáze, pak pro souběžné skupiny negativní a pozitivní kontroly postačují jeden, nebo dva jedinci.

Pokud v době, kdy se studie provádí, existují údaje ze studií s týmž živočišným druhem využívajících týž expozičních cest, prokazující, že mezi oběma pohlavími nejsou v toxicitě podstatné rozdíly, je možné provést testování pouze na jednom pohlaví, nejlépe na samcích. Tam, kde humánní expozice testovaným látkám může být pohlavně specifická, jak je tomu například u některých farmaceutických přípravků, provádí se test na zvířatech odpovídajícího pohlaví.

Testovaná látka se obvykle podává jednorázově.

Obvykle se používají dvě různé dávky. Nejvyšší dávka je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že při vyšší dávce ve stejném režimu by se očekával letální účinek. Nižší dávka představuje obecně 50–25 % dávky vyšší.

Látky, jež v nízkých netoxických dávkách vykazují specifickou biologickou aktivitu, jako jsou hormony nebo mitogeny, mohou představovat výjimky z těchto kritérií pro stanovení dávek a vyhodnocují se případ od případu. Provádí-li se studie ke zjištění rozpětí toxicity, protože potřebné údaje nejsou k dispozici, je třeba ji realizovat v téže laboratoři a za použití stejného živočišného druhu, kmene, pohlaví a pokusného režimu, jaké se pak použijí v hlavní studii.

Jako nejvyšší dávku lze také definovat dávku vyvolávající určité známky toxicity v játrech (např. pyknotická jádra).

Jestliže test při dávce minimálně 2 000 mg/kg hmotnosti podané v jedné dávce nebo ve dvou dávkách v jeden den nevyvolává žádné pozorovatelné toxické účinky a jestliže se na základě údajů o strukturně příbuzných látkách neočekává genotoxicita, nemusí se provést úplná studie. Podle očekávané humánní expozice může být použita v limitním testu vyšší dávka.

Testovaná látka se obvykle vpravuje žaludeční sondou. V odůvodněných případech mohou být přijatelné i jiné expoziční cesty. Intraperitoneální aplikace se však nedoporučuje, protože by se tím mohla játra vystavit působení testované látky přímo, nikoli krevním oběhem. Maximální objem kapaliny, která se dá sondou nebo injekcí najednou vpravit, závisí na velikosti pokusného zvířete a nemá překročit 2 ml/100 g hmotnosti organismu; vyšší dávky musí být zdůvodněné. S výjimkou dráždivých nebo žíravých látek, jež normálně vykazují při vyšších koncentracích horší účinky, je třeba upravit koncentrace látky tak, aby objem byl ve všech dávkových úrovních stejný a minimalizovala se tak objemová variabilita.

Jaterní buňky se z pokusných zvířat zpracovávají obvykle 12 – 16 hodin po podání dávky testované látky. Obvykle je zapotřebí ještě další odběr (obvykle 2 – 4 hodiny po podání látky), ledaže je po 12 – 16 hodinách pozitivní reakce zjevná. Je ovšem možno použít i jiné časy odběru vzorků, je-li to odůvodněné na základě toxokinetických údajů.

Krátkodobé kultury savčích jaterních buněk se obvykle zakládají perfuzí jater in situ kolagenázou. Je třeba zajistit, aby se čerstvě disociované jaterní buňky mohly přichytit ke vhodnému povrchu. Jaterní buňky ze zvířat z negativní kontroly mají mít minimálně 50 % životaschopnost (5).

Čerstvě izolované savčí jaterní buňky se po vhodnou dobu (např. 3 – 8 hodin) obvykle inkubují v médiu obsahujícím ^3H-TdR. Po inkubaci se médium odstraní; buňky se potom mohou inkubovat v médiu obsahujícím nadbytek neznačeného thymidinu, aby se snížila neinkorporovaná radioaktivita (tzv. „cold chase“). Buňky se pak promyjí, fixují a vysuší. Při delších inkubačních intervalech nemusí se „cold chase“ provádět. Sklíčka s preparáty se ponoří do autoradiografické emulze, exponují ve tmě (např. po dobu jednoho nebo dvou týdnů v chladničce), vyvolají, obarví a počítají se exponovaná stříbrná zrna. Z každého jedince se připraví dva nebo tři preparáty.

Mikroskopické preparáty musí obsahovat dostatečný počet buněk s normální morfologií, aby bylo možno UDS vyhodnotit. Mikroskopicky se hodnotí zjevné známky cytotoxicity (např. pyknóza, snížená úroveň radioaktivního značení).

Preparáty se před počítáním zrn zakódují. Vždy na minimálně dvou preparátech z každého jedince se obvykle hodnotí 100 buněk; pokud je buněk méně než 100 na jednoho jedince, musí to být zdůvodněné. Při počítání zrn se nevyhodnocují jádra v S-fázi, ale podíl buněk v S-fázi se registruje.

Vhodnou metodou se stanoví stupeň inkorporace ^3H-TdR do jader a cytoplazmy v morfologicky normálních buňkách, zjištěných podle depozice stříbrných zrnek.

Výsledky zahrnují údaje z jednotlivých preparátů a zvířat. Mimoto se všechna data shrnou v tabelární formě. Pro každou buňku, každého jedince a každou dávku a čas se stanoví čistý počet „nuclear grain“ (NNG) odečtením počtu CG od počtu NG. Počítají-li se „buňky v opravě“, musí být kritéria, kterými se tyto buňky určují, zdůvodněna a podložena daty z historických nebo souběžných negativních kontrol.

Numerické výsledky se mohou vyhodnotit statistickými metodami; pokud se statistické testy použijí, je třeba je vybrat a zdůvodnit ještě před započetím studie.

Kritéria pro pozitivní / negativní reakci zahrnují:

pozitivní (I) hodnoty NNG nad předem stanoveným prahem, zdůvodněným na základě historických dat dané laboratoře
nebo (II) hodnoty NNG významně vyšší než u souběžné kontroly
negativní (I) hodnoty NNG na úrovni/pod úrovní historického prahu u kontrol
nebo (II) hodnoty NNG nejsou signifikantně vyšší než souběžná kontrola

Je třeba uvážit biologickou významnost získaných dat, což znamená, že je třeba vzít v úvahu parametry, jako jsou variabilita mezi jednotlivými jedinci, vztah dávka-odpověď a cytotoxicita. Při vyhodnocování výsledků lze použít statistické metody; statistická významnost by však neměla být pro pozitivní reakci rozhodujícím faktorem.

Většina experimentů poskytuje jednoznačné pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech však nelze ze získaného souboru dat vyvodit o aktivitě testované látky definitivní závěr. Výsledky mohou být stále nejednoznačné nebo problematické, i když se experiment několikrát opakuje.

Pozitivní výsledek testu UDS se savčími jaterními buňkami in vivo ukazuje, že testovaná látka vyvolává v savčích jaterních buňkách in vivo poškození DNA, které lze opravit neplánovanou syntézou DNA in vitro. Negativní výsledek ukazuje, že za daných experimentálních podmínek testovaná látka nevyvolává takové poškození DNA, jež je tímto testem zjistitelná.

Je třeba vzít v úvahu, jaká je pravděpodobnost, že testovaná látka dosáhne širokého použití nebo je specifická pro určitou cílovou tkáň (např. systémová toxicita).

ZPRÁVA O PRŮBĚHU POKUSU

Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:

Rozpouštědlo / vehikulum:

Pokusná zvířata:

Podmínky pokusu:

Výsledky:

Diskuse výsledků.

Závěry.

B.40. LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI

Evropské centrum pro validizaci alternativních metod (European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM, Joint Research Centre, European Commission) schválilo jakožto vědecky validní dva testy in vitro na leptavé účinky na kůži: test na principu měření transkutánního elektrického odporu kůže potkana (transcutaneous electrical resistance, TER) a test využívající modelu lidské kůže. Validizační studie ECVAM prokázala, že oba testy dokáží spolehlivě rozlišovat mezi známými látkami leptajícími a neleptajícími kůži. Mimoto test vycházející z modelu lidské kůže umožňuje správně rozlišovat jednotlivé stupně leptavých účinků (známé látky způsobující těžké poleptání kůže R35, a ostatní látky způsobující poleptání kůže, R34). Je uveden popis a postupy obou testů; výběr mezi oběma testy závisí na konkrétních požadavcích a na preferencích uživatele.

Poleptání kůže: způsobení nevratného poškození tkáně kůže po aplikaci testované látky.

Žádná referenční látka není specifikována, viz však odst. 1.5.3.4 a 1.7.2.3.

Testovaný materiál se nanese na dobu až 24 hodin na epidermální povrch terčíků kůže odebrané z mladých potkanů utracených humánním způsobem. Látky, které mají leptavé účinky, jsou identifikovány podle své schopnost porušit normální integritu a bariérové funkce stratum corneum. Tato schopnost se měří jakožto pokles inherentního transkutánního elektrického odporu (TER) pod určitou prahovou hodnotu (5 kΩ) (4) (5). Dráždivé a nedráždivé látky TER pod prahovou hodnotu nesnižují. V případě detergentů a neutrálních organických látek (jejichž definici viz v lit. (6)) je možno do zkušebního postupu zařadit test fixace barviva, aby se snížil počet falešných pozitivních výsledků, jež se u těchto typů chemických látek vyskytují (2) (7).

Čtení tohoto dokumentu nenahrazuje čtení příslušného vydání Sbírky zákonů. Neneseme odpovědnost za případné nepřesnosti vyplývající z převodu originálu do tohoto formátu.

Tento text je zveřejněn za vlastních podmínek opětovného použití zdroje e-Sbírka, nikoli pod licencí Legalize ani pod licencí volného díla. e-Sbírka
volné dílo (úřední díla podle § 3 písm. a) zákona č. 121/2000 Sb., autorského zákona)