Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997), ve znění pozdějších předpisů

Fyzikální gely jsou hydrofilní polymery jako lineární polyakrylamid deriváty celulosy dextran atd., které mohou být rozpuštěný ve vodných separačních tlumivých roztocích za vzniku separačního media, které rovněž působí jako molekulové síto. Tato separační media se připravují snáze než zesítěné polymery. Mohou být připravený v zásobní nádobce a tlakem naplněny do kapiláry s pokrytou vnitřní stěnou (bez elektroosmotického toku). Výměna gelu před každým nástřikem obecně zlepšuje reprodukovatelnost separace. Porozita gelů se může zvýšit použitím polymerů o vyšší molekulové hmotnosti (při dané koncentraci polymeru) nebo snížením koncentrace polymeru (při dané molekulové hmotnosti polymeru). Snížení porozity gelu vede ve stejném tlumivém roztoku ke snížení pohyblivosti rozpuštěné látky. Rozpuštěním těchto polymerů v tlumivém roztoku vznikají roztoky s nízkou viskozitou, proto se může použit jak hydrodynamický, tak elektrokinetický nástřik.

Kapilární izoelektrická fokusace

Princip

Při izoelektrické fokusaci se vlivem elektrického pole pohybují amfoterní molekuly, pokud jsou nabité, tj. pokud se nacházejí mimo oblast svého izoelektrického bodu v gradientu pH tvořeném amfolyty s širokým rozsahem pI (polyaminokarboxylové kyseliny) rozpuštěnými v separačním tlumivém roztoku.

Třemi základními kroky izoelektrické fokusace jsou plnění fokusace a mobilizace.

Plnění. Mohou být použitý dva postupy:

• jednostupňové plnění, vzorek se smíchá s amfolyty a zavede se do kapiláry tlakem nebo vakuem.

• postupné plněni, do kapiláry se postupně zavede vedoucí roztok, amfolyty, vzorek smíchaný s amfolyty, opět samotné amfolyty a nakonec koncový roztok, objem vzorku musí být dostatečně malý, aby neovlivňoval gradient pH.

Fokusace. Vlivem vloženého napětí migruji amfolyty podle svého výsledného náboje ke katodě, nebo k anodě, takže vytvářejí gradient pH od anody (nižší pH) ke katodě (vyšší pH). Během tohoto kroku se separované složky pohybují, dokud nedosáhnou pH odpovídajícího jejich izoelektrickému bodu (pI) a proud pak poklesne na velmi malé hodnoty.

Mobilizace. Zóny separovaných složek jsou nucený projít detektorem. Je možno použít tři postupy:

• v prvním postupu je mobilizace dosaženo během fokusace vlivem elektroosmotického toku, elektroosmotický tok musí být dostatečně malý, aby bylo dosaženo fokusace (dříve, než zóny projdou detektorem);

• v druhem postupu je mobilizace dosaženo působením pozitivního tlaku po fokusaci;

• ve třetím postupu je mobilizace dosaženo po fokusačním kroku přidáním soli do katodové nebo anodové nádobky (v závislosti na vybraném směru mobilizace), aby se změnilo pH v kapiláře, po vloženém napětí. Protože se změní pH, jsou bílkoviny a amfolyty mobilizovány ve směru elektrodové nádobky, která obsahuje přidané soli a procházejí detektorem.

Dosažená separace vyjádřená jako ΔpI, závisí na gradientu pH (dpH/dx), počtu amfolytů s rozdílnou hodnotou pI, difuzním koeficientu stanovované látky (D), intenzitě elektrického pole (E) a změně elektroforetické pohyblivosti stanovované látky v závislosti na pH (-dμ/dpH):

∆pl=3.DdpHdxE-dμdpH.

Optimalizace

Hlavní parametry, které je třeba brát v úvahu při vývoji separace, jsou:

Napětí. Při kapilární izoelektrické fokusaci se používá velmi vysoká intenzita elektrického pole, 300 V/cm až 1000 V/cm při fokusaci.

Kapilára. Podle zvolené metody mobilizace musí být snížen nebo potlačen elektroosmotický tok. Ke snížení elektroosmotického toku slouží kapiláry s pokrytou vnitřní stěnou.

Roztoky. Anodová nádobka je naplněna roztokem s pH nižším, než je pI nejkyselejšího amfolytu a katodová nádobka roztokem s pH vyšším, než je pI nejzásaditějšího amfolytu. Nejčastěji se používá kyselina fosforečná pro anodu a hydroxid sodný pro katodu.

Přidání polymeru, jako je např. methylcelulosa, vede k potlačení proudění a elektroosmotického toku zvýšením viskozity. Jsou dostupné komerční amfolyty v mnoha rozsazích pH, které mohou být smíchány k získání rozšířené oblasti pH. Široké rozsahy pH jsou používány k odhadu izoelektrického bodu, zatímco užší rozsahy ke zvýšení správnosti. Kalibrace se provádí přiřazením migračního času izoelektrickému bodu pro sérii standardních bílkovin (se známými hodnotami izoelektrického bodu).

Pokud je to nutné, zabraňuje se sražení bílkovin během fokusace přidáním přísad, jako např. glycerolu, tenzidů, močoviny nebo obojetných iontů (zwitteriontů) do tlumivého roztoku. V závislosti na koncentraci však močovina denaturuje bílkoviny.

Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC)

Princip

Při micelární elektrokinetické chromatografii se separace provádí v elektrolytovém roztoku, který obsahuje tenzid v koncentraci vyšší než kritická micelární koncentrace (cmc). Molekuly rozpuštěné látky jsou rozděleny mezi vodným tlumivým roztokem a pseudostacionární fázi tvořenou micelární podle jeho rozdělovacího koeficientu. Tato metoda tedy může být považována za kombinaci elektroforézy a chromatografie. Je to metoda, která může být použitá pro separaci jak neutrálních, tak nabitých látek při zachování účinnosti, rychlosti a instrumentální vhodnosti kapilární elektroforézy. Jedním z nejšířeji používaných tenzidů v MEKC je aniontový tenzid dodecylsíran sodný, ačkoli se také používají jiné, např. kationtové tenzidy, jako jsou soli cetyltrimethylamonné.

Separační mechanismus je následující. Při neutrálním a alkalickém pH se tvoří silný elektroosmotický tok, který unáší ionty i neutrální molekuly separačního tlumivého roztoku směrem ke katodě. Pokud je jako tenzid použít dodecylsíran sodný, má elektroforetická migrace aniontových micel opačný směr, tj. k anodě. Výsledkem je, že celková rychlost migrace micel je zpomalená ve srovnání s objemovým tokem elektrolytu. V případě neutrálních rozpuštěných látek, kdy se stanovovaná látka může rozdělit mezi micely a vodný tlumivý roztok a nemá elektroforetickou pohyblivost, bude migrační rychlost stanovované látky záviset pouze na rozdělovacím koeficientu mezi micelou a vodným tlumivým roztokem. Na elektroforeogramu jsou píky nenabitých látek vždy mezi indikátorem elektroosmotického toku a indikátorem micel (čas ohraničený těmito dvěma píky se nazývá separační okno). Migrační rychlost elektricky nabitých látek závisí jak na rozdělovacím koeficientu mezi micelami a vodným tlumivým roztokem, tak na elektroforetické pohyblivosti v roztoku neobsahujícím micely.

Jelikož separační mechanismus neutrálních a slabě ionizovaných látek je v MEKC v podstatě chromatografický, migrace látky a rozlišení mohou být vysvětleny termínem kapacitní faktor látky (k ) známý též jako kapacitní poměr (Dm), který je poměrem látkového množství rozpuštěných látek v micelách a látkového množství rozpuštěných látek v mobilní fázi. Pro neutrální látku je k' dán vztahem:

k'=tr-t0t01-trtm=KVsVm,

v němž značí:

tr - migrační čas rozpuštěné látky,

t0 - čas analýzy nezadržované složky (určí se nástřikem indikátoru elektroosmotického toku, který nevstupuje do micel, např. methanolu),

tm - migrační čas micel (urči se nástřikem micelového indikátoru, jako je Sudan III, který migruje nepřetržitě absorbován micelami),

K - rozdělovací koeficient rozpuštěné látky,

Vs - objem micelární fáze,

Vm - objem mobilní fáze.

Podobně je dáno rozlišení dvou těsně migrujících látek (Rs):

RS=N4.α-1α.k'bk'b+1.1-t0tm1+t0tmk'a,

N - počet teoretických pater pro jednu z látek,

α - selektivita,

k'a, k'b - kapacitní faktory látek a, b.

Podobně, ale ne identicky, jsou dány rovnice pro k' a Rs elektricky nabitých látek.

Optimalizace

Hlavní parametry, které je třeba brát v úvahu při vývoji separace pomoci MEKC, jsou parametry instrumentální a parametry roztoku elektrolytu.

• Instrumentální parametry

Napětí. Čas separace je nepřímo úměrný vloženému napětí. Zvýšení napětí však může způsobit nadměrnou tvorbu tepla, které tvoří gradient teploty a viskozity v průřezu kapiláry. Tento jev může být významný při použití vysoce vodivých tlumivých roztoků, jakými jsou roztoky obsahující micely. Nedostatečný odvod tepla způsobuje rozšíření zón a snižuje rozlišení.

Teplota. Změny teploty v kapiláře ovlivňuji rozdělovací koeficient látky mezi tlumivým roztokem a micelami, kritickou micelární koncentrací a viskozity tlumivého roztoku. Tyto parametry přispívají k migračnímu času rozpuštěných látek. Použiti dobrého chladicího systému zlepšuje reprodukovatelnost migračních časů rozpuštěných látek..

Kapilára. Stejně jako v kapilární elektroforéze ve volném roztoku ovlivňuji rozměry kapiláry (délka a vnitřní průměr), čas analýzy a účinnost separace. Prodloužení kapiláry snižuje intenzitu elektrického pole (při konstantním napětí), zvyšuje migrační čas a zvyšuje účinnost separace. Vnitřní průměr ovlivňuje odvod tepla (pro daný tlumivý roztok a intenzitu elektrického pole) a následně rozšíření zóny vzorku.

• Parametry roztoku elektrolytu

Typ tenzidu a koncentrace. Typ tenzidu ovlivňuje, stejně jako stacionární fáze v chromatografii, rozlišení, neboť spoluurčuje selektivitu separace. Hodnota log k' neutrální látky vzrůstá lineárně s koncentrací tenzidu v mobilní fázi. Protože rozlišení při MEKC dosahuje maxima, když se k' přiblíží k hodnotě tmtn, změna koncentrace tenzidu v mobilní fázi ovlivňuje dosažené rozlišení.

pH tlumivého roztoku. Ačkoli pH neovlivňuje rozdělovací koeficient neionizovaných látek, může ovlivnit elektroosmotický tok v nepokryté kapiláře. Snížení pH tlumivého roztoku snižuje elektroosmotický tok, a tím zvyšuje rozlišení neutrálních látek při MEKC. Výsledkem je delší čas analýzy.

Organická rozpouštědla. Pro zlepšení MEKC separace hydrofobních látek mohou být do roztoku elektrolytu přidaná organická rozpouštědla (methanol, propanol, acetonitril atd.). Přídavek těchto rozpouštědel obvykle snižuje migrační čas a selektivitu separace. Přídavek organických rozpouštědel ovlivňuje kritickou micelární koncentrací. Proto může být dána koncentrace tenzidu použitá pouze s určitou maximální koncentrací organického rozpouštědla, nad níž dochází k rozpadu micel. Rozpad micel v přítomnosti vysokého obsahu organického rozpouštědla neznamená vždy, že separace není dále možná, v některých případech tvoří hydrofobní interakce mezi monomerem iontového tenzidu a neutrálními látkami solvofobní komplexy, které mohou být separovány elektroforeticky.

Přísady pro chirální separaci. Pro separaci chirálních látek použitím MEKC je v micelárním systému obsažen chirální selektor buď kovalentně vázány na tenzid, nebo přidaný do micelárního separačního média. Mezi micely tvořené molekulami, které obsahují skupiny s vlastnostmi chirálního selektoru, patří soli N-dodekanoyl-L aminokyselin, soli žlučových kyselin atd. Chirálního rozlišení může být také dosaženo přidáním chirálního selektoru, jako jsou cyklodextriny, do elektrolytového roztoku, který obsahuje micelizovaný achirální tenzid.

Další přísady. Modifikace selektivity přidáním činidel do tlumivého roztoku může být prováděna různými způsoby. Přidání různých typů cyklodextrinů do tlumivého roztoku může být také použito k potlačení interakci hydrofobních látek s micelami a tím ke zvýšení selektivity pro tento typ látek.

Ke zlepšení selektivity separace se při MEKC používá přídavku látek, které mohou ovlivnit interakci rozpuštěné látky s micelou adsorpcí na micely. Touto přísadou může být druhý tenzid (ionogenní nebo neionogenní), který způsobuje vznik směsných micel nebo kationty kovů, které se rozpouštějí v micelách a tvoří koordinační komplexy s rozpuštěnými látkami.

Kvantitativní analýza

Plochy píků musí být vyděleny odpovídajícími migračními časy za vzniku korigovaných ploch, aby se kompenzoval:

• posun migračních časů od analýzy k analýze, a tun zmenšil rozptyl odezvy,

• rozdíl v odezvách složek vzorku s různými migračními časy.

Pokud se použije vnitřní standard, ověří se, že žádny pík zkoumané látky není překryt píkem vnitřního standardu.

Výpočty

Ze získaných hodnot se vypočte obsah stanovované složky nebo složek. Je-li předepsán procentuální obsah jedné nebo více složek zkoušené látky, vypočte se stanovením korigované plochy píku nebo píků jako procenta celkové korigované plochy všech píků, vyjma píků rozpouštědla nebo jakéhokoliv přidaného činidla (metoda normalizace). Doporučuje se použití automatického integračního systému (integrátoru nebo systému pro sběr a zpracování dat).

Způsobilost systému

Pro kontrolu chování systému kapilární elektroforézy se používají parametry způsobilosti systému. Výběr těchto parametrů závisí na použitém modu kapilární elektroforézy. Jsou to kapacitní faktor (k ) (pouze pro micelární elektrokinetickou chromatografii), počet teoretických pater (N), faktor symetrie píku (As) a rozlišení (Rs). V předchozích částech byly popsány teoretické výrazy pro N a Rs, ale dále jsou uvedeny praktičtější rovnice pro výpočet těchto parametrů z elektroforeogramů.

Počet teoretických pater

Počet teoretických pater (N) se vypočte pomocí výrazu:

N=5,54trwh2,

v němž značí:

tr - migrační čas nebo vzdálenost podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu sledovaného píku

wh - šířku píku v polovině jeho výšky.

Rozlišení

Rozlišení (Rs) mezi píky dvou složek s podobnými výškami se vypočte pomocí výrazu:

RS=1,18tR2-tR1wh1+wh2, kde tR2>tR1,

v němž značí:

tR1 a tR2 - migrační časy nebo vzdálenosti podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicemi spuštěnými z vrcholů dvou sousedních píků,

wh1 a wh2 - šířky píků v polovině jejich výšky.

Pokud je to vhodné, může být rozlišení vypočteno změřením výšky sedla (Hv) mezi dvěma částečně rozdělenými píky porovnávacího roztoku a výšky menšího píku (Hp) a vypočtením poměru píku k sedlu:

pv=HpHv,

Faktor symetrie píku

Faktor symetrie píku (As) se vypočte ze vztahu:

AS=w0,052d,

v němž značí:

w0,05 - šířka píku v jedné dvacetině jeho výšky,

d - vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině jeho výšky.

Jako parametry způsobilosti systému jsou uvedeny testy opakovatelnosti ploch (standardní odchylka ploch nebo poměrů ploch k migračním časům) a opakovatelnosti migračních časů (standardní odchylka migračních časů). Opakovatelnost migračních časů slouží jako test způsobilosti promývacího procesu kapiláry. Alternativním postupem, jak zabránit snížení opakovatelnosti migračních časů je použití relativních migračních časů vzhledem k vnitřnímu standardu.

Pro stanovení příbuzných látek je vhodná zkouška ověření poměru signálu k šumu porovnávacího roztoku (nebo určení kvantitativního limitu).

Poměr signálu k šumu

Detekční limit odpovídá hodnotě poměru signálu k šumu rovné 3, kvantitativní limit hodnotě rovné 10.

Poměr signálu k šumu (S/N) se vypočte ze vztahu:

SN=2Hh,

v němž značí:

H - výšku píku odpovídajícího dané složce na elektroforeogramu předepsaného porovnávacího roztoku, měřená mezi vrcholem píku a extrapolovanou základní linií signálu. Signál se sleduje v rozsahu rovném dvacetinásobku šířky píku v polovině jeho výšky,

h - rozsah šumu na elektroforeogramu získaného při slepé zkoušce a zaznamenaného na vzdálenosti rovné dvacetinásobku šířky píku v polovině jeho výšky na elektroforeogramu předepsaného porovnávacího roztoku. Pokud je to možné, je tato vzdálenost situována rovnoměrně na obě strany od místa, kde by se tento pík nacházel.

“

• 1. V příloze části 2 Zkušební metody, kapitola 2.5 Stanovení obsahu, kapitola 2.5.5 zní:

„

• 2.5.5 Číslo peroxidové [image omitted]

Číslo peroxidové IP udává množství aktivního kyslíku v miliekvivalentech obsažené v peroxidické formě v 1000 g látky. Stanoví se metodami níže uvedenými.

Není-li metoda v článku specifikována, použije se metoda A. Jakékoliv změny metody A na metodu B mají být validovány.

Metoda A

5,00 g zkoušené látky (m g) se převede do 250ml kuželové baňky se zabroušenou skleněnou zátkou. Přidá se 30 ml směsi objemových dílů chloroformu R a kyseliny octové ledové R (2 + 3) a třepe se do rozpuštění látky. Potom se přidá 0,5 ml jodidu draselného nasyceného RS, třepe se přesně 1 min a pak se přidá 30 ml vody R. Titruje se thiosíranem sodným 0,01 mol/l VS, který se pomalu přidává za silného třepání do změny žlutého zbarvení na téměř bezbarvé. Potom se přidá 5 ml škrobu RS a pokračuje se v titraci (n1 ml thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS) za silného třepání do odbarvení. Za stejných podmínek se provede slepá zkouška (n2 ml thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS), při níž není spotřeba thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS vyšší než 0,1 ml.

Číslo peroxidové se vypočítá podle vztahu:

Ip=10n1-n2m,

Metoda B

Zkouška se provádí za ochrany před aktinickým světlem.

50 ml směsi objemových dílů trimethylpentanu R a kyseliny octové ledové R (2 + 3) se převede do kuželové baňky a uzavře se zátkou. Krouží se baňkou do rozpuštění zkoušené látky (m g; viz tabulka 2.5.5-1). Potom se vhodnou byretou přidá 0,5 ml jodidu draselného nasyceného RS a uzavře se zátkou. Roztok se nechá stát (60 ±1) s a potom se za důkladného rovnoměrného třepání přidá 30 ml vody R.

Tab. 2.5.5-1

Předpokládané číslo peroxidové	Množství zkoušené látky (g)
0 - 12	2,00 - 5,00
12 - 20	1,20 - 2,00
20 - 30	0,80 - 1,20
30 - 50	0,500 - 0,800
50 - 90	0,300 - 0,500

Roztok se titruje thiosíranem sodným 0,01 mol/l VS (V1 ml), který se postupně přidává za silného třepání do změny žlutého zbarvení jodu na téměř bezbarvé. Potom se přidá 0,5 ml škrobu RS1 a pokračuje se v titraci za stálého třepání, zvláště ke konci titrace, aby se uvolnil všechen jod z vrstvy rozpouštědla. Po kapkách se přidává thiosíran sodný, dokud se modré zbarvení právě neodbarví.

Podle spotřeby použitého thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS, lze k titraci použít thiosíran sodný 0,1 mol/l VS.

Poznámka. Pro neutralizaci škrobového indikátoru, z důvodu oddělení horní vrstvy trimethylpentanu od vodné vrstvy, je doba nutná k přiměřenému promíchání rozpouštědla a vodné vrstvy a uvolnění zbytku jodu 15 s až 30 s pro číslo peroxidové 70 a vyšší. Doporučuje se použít thiosíran sodný 0,1 mol/l VS pro číslo peroxidové, jehož hodnota je vyšší než 150. Ke zpomalení separace fází a k snadnějšímu uvolňování jodu se může ke směsi přidat malé množství (0,5 % až 1,0 %) emulgátoru s vysokou hodnotou hydrofilně-lipofilní rovnováhy (HLB) (např. polysorbát 60).

Provede se slepá zkouška (V0 ml). Je-li spotřeba odměrného roztoku vyšší než 0,1 ml, stanovení se opakuje s novými zkoumadly.

Ip=1000.V1-V2.cm,

v němž značí:

c - koncentraci roztoku thiosíranu sodného v molech na litr.

“

• 1. V příloze části 2 Zkušební metody, kapitola 2.5 Stanovení obsahu se za kapitolu 2.5.32 doplňuje kapitola 2.5.33 a kapitola 2.5.34, které znějí:

„

• 2.5.33 Celkové bílkoviny [image omitted]

Mnohé metody stanovení obsahu popsané v této kapitole mohou být provedeny za použití komerčně dostupných souprav.

Metoda 1

Bílkovina v roztocích absorbuje ultrafialové světlo při vlnové délce 280 nm, což je způsobeno přítomností aromatických aminokyselin ve struktuře bílkoviny, hlavně tyrosinu a tryptofanu. Tato vlastnost může být využita pro stanovení obsahu. Jestliže tlumivý roztok použitý k rozpuštění bílkoviny má vyšší absorbanci než voda, obsahuje rušicí látky. Toto rušení může být odstraněno použitím tlumivého roztoku jako kontrolní kapaliny, ale přesto mohou být výsledky ovlivněny, pokud rušicí látky mají vysokou absorbanci. Při nízkých koncentracích bílkovina adsorbovaná na kyvetu může výrazně snížit obsah bílkoviny v roztoku, což může být předem vyloučeno přípravou vzorků o vyšší koncentraci nebo použitím neionogenních detergentů při přípravě.

Zkoušený roztok. Vhodné množství zkoušené látky se rozpustí v předepsaném tlumivém roztoku tak, aby koncentrace bílkoviny v získaném roztoku byla v rozmezí 0,2 mg/ml až 2 mg/ml.

Porovnávací roztok. Připraví se roztok vhodné referenční látky pro stanovení bílkovin rozpuštěné ve stejném tlumivém roztoku a o stejné koncentraci bílkoviny jako zkoušený roztok.

Postup. Zkoušený roztok, porovnávací roztok a kontrolní kapalina se během této zkoušky udržují při stejné teplotě. Měří se absorbance (2.2.25) zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku v křemenných kyvetách při 280 nm proti předepsanému tlumivému roztoku jako kontrolní kapalině. K získání správných výsledků musí být odezva lineární v rozmezí koncentrací bílkoviny.

Rozptyl světla. Přesnost stanovení bílkoviny může být zmenšena rozptylem světla ve zkoušeném vzorku. Jestliže se bílkoviny v roztoku vyskytují jako částice srovnatelné velikostí s vlnovou délkou měřeného světla (250 nm až 300 nm), rozptyl světelných paprsků vyvolá vzrůst absorbance zkoušeného vzorku. Pro výpočet absorbance při 280 nm způsobené rozptylem světla se změří absorbance zkoušeného roztoku při vlnových délkách 320 nm, 325 nm, 330 nm, 335 nm, 340 nm, 345 nm a 350 nm. Sestrojí se závislost logaritmu získaných absorbancí proti logaritmu vlnových délek a sestrojí se kalibrační křivka proložením nejvhodnějších bodů lineární regresí. Křivka se extrapoluje k získání logaritmu absorbance při 280 nm. Antilogaritmus této hodnoty je absorbance přisuzovaná rozptylu světla. K získání hodnoty absorbance bílkoviny v roztoku se získané hodnoty korigují odečtením absorbance přisuzované rozptylu světla od celkové absorbance při 280 nm. Ke snížení vlivu rozptylu světla může být použita filtrace přes filtr (0,2 µm), který neadsorbuje bílkoviny, nebo vyčeření odstředěním, zvláště, je-li roztok nápadně zakalený.

Výpočty. Pro výpočet se použijí korigované hodnoty. Koncentrace bílkoviny ve zkoušeném roztoku (CU) se vypočítá podle následujícího vztahu:

CU = CS(AU/AS),

v němž značí:

CS - koncentraci bílkoviny v porovnávacím roztoku,

AU - korigovanou absorbanci zkoušeného roztoku,

AS - korigovanou absorbanci porovnávacího roztoku.

Metoda 2

Tato metoda (obvykle uváděná jako Lowryho stanovení) je založena na redukci fosfomolybdenan-wolframového směsného chromoforu bílkovinou ve zkoumadlu fosfomolybdenan-wolframovém, který vykazuje absorpční maximum při 750 nm. Zkoumadlo fosfomolybdenan-wolframové nejdříve reaguje se zbytky tyrosinu v bílkovině. Intenzita zbarvení je nejvyšší po 20min až 30min stání při pokojové teplotě, po této době se intenzita zbarvení postupně ztrácí.

Protože tato metoda je citlivá na rušicí látky, může se použít postup srážení bílkoviny ze zkoušeného vzorku. Většina rušicích látek vyvolává odbarvování, avšak naopak některé detergenty vyvolávají slabý růst intenzity zbarvení. Vysoké koncentrace solí mohou vyvolávat tvorbu sraženiny. Referenční látka a zkoušená bílkovina musí být shodné, protože různé druhy bílkovin mohou způsobit různou intenzitu zbarvení. Tam, kde je nutné oddělení rušicích látek od bílkoviny ve zkoušeném vzorku, je třeba před přípravou vzorku provést oddělení rušicích látek níže uvedeným postupem. Vliv rušicích látek může být minimalizován naředěním tak, aby koncentrace zkoušené bílkoviny zůstala dostatečná pro přesné měření.

K přípravě všech tlumivých roztoků a zkoumadel použitých v této metodě se použije voda destilovaná R.

Zkoušený roztok. Vhodné množství zkoušené látky se rozpustí v předepsaném tlumivém roztoku tak, aby koncentrace získaného roztoku byla v rozmezí kalibrační křivky. Vhodný tlumivý roztok udržuje pH roztoku na hodnotě 10,0 až 10,5.

Porovnávací roztoky. Referenční látka pro stanovení bílkoviny se rozpustí v předepsaném tlumivém roztoku. Tento roztok se dále zředí stejným tlumivým roztokem tak, aby se získalo nejméně pět porovnávacích roztoků o koncentraci bílkoviny rovnoměrně rozložené ve vhodném rozmezí mezi 5 µg/ml a 100 µg/ml.

Kontrolní roztok. Použije se tlumivý roztok použitý k přípravě zkoušeného roztoku a porovnávacích roztoků.

Zkoumadlo se síranem měďnatým. 100 mg síranu měďnatého R a 0,2 g vínanu sodného R se rozpustí ve vodě destilované R a zředí se jí na 50 ml. 10 g uhličitanu sodného bezvodého R se rozpustí ve vodě destilované R a zředí se jí na 50 ml. Pomalu za míchání se lije roztok uhličitanu sodného do roztoku síranu měďnatého. Použije se během 24 h.

Alkalické zkoumadlo s mědí. Smíchají se objemové díly zkoumadla se síranem měďnatým, roztoku dodecylsíranu sodného R (50 g/l) a roztoku hydroxidu sodného R (32 g/l) (1 + 2 + 1). Uchovává se při pokojové teplotě a použije se během 2 týdnů.

Zkoumadlo fosfomolybdenan-wolframové zředěné. Smíchá se 5 ml zkoumadla fosfomolybdenan-wolframového R s 55 ml vody destilované R. Uchovává se v hnědé nádobě při pokojové teplotě.

Postup. K 1,0 ml každého porovnávacího roztoku, zkoušeného roztoku a kontrolního roztoku se přidá po 1,0 ml alkalického zkoumadla s mědí a promíchá se. Nechá se stát 10 min. Přidá se po 0,5 ml zkoumadla fosfomolybdenan-wolframového zředěného, promíchá se a nechá se stát 30 min při pokojové teplotě. Absorbance (2.2.25) roztoků se měří při 750 nm proti kontrolnímu roztoku.

Výpočty. Závislost absorbance na koncentraci bílkoviny je nelineární; avšak, je-li rozmezí koncentrací použitých k přípravě kalibrační křivky dostatečně malé, blíží se přímce. Vynesou se absorbance porovnávacích roztoků proti koncentracím bílkoviny a použitím lineární regrese se sestrojí kalibrační křivka, z níž se za použití naměřené absorbance odečte koncentrace bílkoviny ve zkoušeném roztoku.

Rušicí látky. V následujícím postupu se před stanovením ke zkoušenému vzorku přidává kyselina deoxycholová-trichloroctová k odstranění rušících látek vysrážením bílkovin; tento postup může být též použit k zahuštění bílkovin ze zředěných roztoků.

K 1 ml roztoku zkoušené látky se přidá 0,1 ml roztoku natriumdeoxycholatu R (1,5 g/l). Promíchá se vířivou míchačkou a nechá se stát 10 min při pokojové teplotě. Přidá se 0,1 ml roztoku kyseliny trichlorooctové R (720 g/l) a promíchá se vířivou míchačkou. Odstřeďuje se 30 min při 3000 gn, kapalina se dekantuje a zbytek tekutiny se odstraní pipetou. Sbalená bílkovina se znovu rozpustí v 1 ml alkalického zkoumadla s mědí.

Metoda 3

Tato metoda (obvykle uváděná jako Bradfordovo stanovení) je založena na absorpčním posunu z 470 nm na 595 nm, který se získá, jestliže modř kyselá 90 se naváže na bílkovinu. Nejzřetelněji se modř kyselá 90 naváže na zbytky argininu a lysinu v bílkovině, což může vést ke změnám v odezvě obsahu různých bílkovin. Bílkovina použitá jako referenční látka musí být proto shodná se stanovovanou bílkovinou. Existuje relativně málo rušicích látek, ale je dávána přednost nepoužití detergentů a amfolytů ve zkoušeném vzorku. Silně alkalické vzorky mohou interferovat s kyselými zkoumadly.

K přípravě všech tlumivých roztoků a zkoumadel použitých v této metodě se použije voda destilovaná R.

Zkoušený roztok. Vhodné množství zkoušené látky se rozpustí v předepsaném tlumivém roztoku tak, aby absorbance získaného roztoku byla v rozmezí kalibrační křivky.

Porovnávací roztoky. Referenční látka pro stanovení bílkoviny se rozpustí v předepsaném tlumivém roztoku. Tento roztok se zředí stejným tlumivým roztokem tak, aby se získalo nejméně pět porovnávacích roztoků o koncentraci bílkoviny rovnoměrně rozložené ve vhodném rozmezí mezi 0,1 mg/ml a 1 mg/ml.

Kontrolní roztok. Použije se tlumivý roztok použitý k přípravě zkoušeného roztoku a porovnávacích roztoků.

Zkoumadlo s modří kyselou 90. 0,10 g modři kyselé 90 R se rozpustí v 50 ml lihu 96% R, přidá se 100 ml kyseliny fosforečné R, zředí se vodou destilovanou R na 1000 ml a promíchá se. Tento roztok se zfiltruje a uchovává se v hnědé nádobě při pokojové teplotě. Během uchovávání se pomalu vylučuje sraženina. Před použitím se roztok zfiltruje.

Postup. K 0,100 ml každého porovnávacího roztoku, zkoušeného roztoku a kontrolního roztoku se přidá po 5 ml zkoumadla s modří kyselou 90 a promíchají se převracením. Je třeba se vyvarovat pěnění, které může ovlivnit reprodukovatelnost. Absorbance (2.2.25) roztoků se měří při 595 nm proti kontrolnímu roztoku.

Nepoužívají se křemenné kyvety, protože se barvivo váže na tento materiál.

Výpočty. Závislost absorbance na koncentraci bílkoviny je nelineární; avšak, je-li rozmezí koncentrací použitých k přípravě kalibrační křivky dostatečně malé, blíží se přímce. Vynesou se absorbance porovnávacích roztoků proti koncentracím bílkoviny a použitím lineární regrese se sestrojí kalibrační křivka, z níž za použití absorbance se odečte koncentrace bílkoviny ve zkoušeném roztoku.

Metoda 4

Tato metoda (obvykle uváděná jako stanovení obsahu kyselinou bicinchoninovou neboli BCA) je založena na redukci měďnatých iontů (Cu^2+) na měďné (Cu^+) bílkovinou. Zkoumadlo BCA se používá k detekci měďných iontů. Reakci ruší některé látky. Vliv rušicích látek může být snížen zředěním tak, aby koncentrace zkoušené bílkoviny zůstala dostatečná pro přesné měření. Alternativně se může použít k odstranění rušicích látek postup srážení bílkoviny uvedený v metodě 2. Referenční látka a zkoušená bílkovina musí být stejné, protože různé druhy bílkovin reagují různou barevnou intenzitou.

K přípravě všech tlumivých roztoků a zkoumadel použitých v této metodě se použije voda destilovaná R.

Zkoušený roztok. Vhodné množství zkoušené látky se rozpustí v předepsaném tlumivém roztoku tak, aby koncentrace roztoku byla v rozmezí koncentrací porovnávacích roztoků.

Porovnávací roztoky. Referenční látka pro stanovení bílkoviny se rozpustí v předepsaném tlumivém roztoku. Tento roztok se zředí stejným tlumivým roztokem tak, aby se získalo nejméně pět porovnávacích roztoků o koncentraci bílkoviny rovnoměrně rozložené ve vhodném rozmezí mezi 10 µg/ml a 1200 µg/ml.

Kontrolní roztok. Použije se tlumivý roztok použitý k přípravě zkoušeného roztoku a porovnávacích roztoků.

BCA zkoumadlo. 10 g dinatriumbicinchoninatu R, 20 g uhličitanu sodného monohydrátu R, 1,6 g vínanu sodného R, 4 g hydroxidu sodného R a 9,5 g hydrogenuhličitanu sodného R se rozpustí ve vodě destilované R. Je-li třeba, upraví se pH roztokem hydroxidu sodného R nebo roztokem hydrogenuhličitanu sodného R na hodnotu 11,25, zředí se vodou destilovanou R na 1000 ml a promíchá se.

BCA zkoumadlo s mědí. Smíchá se 1 ml roztoku síranu měďnatého R (40 g/l) s 50 ml BCA zkoumadla.

Postup. 0,1 ml každého porovnávacího roztoku, zkoušeného roztoku a kontrolního roztoku se smíchá se 2 ml BCA zkoumadla s mědí. Roztoky se udržují 30 min při 37 °C, zaznamená se čas a směs se ochladí na pokojovou teplotu. Do 60 min od konce inkubace se měří absorbance (2.2.25) porovnávacích roztoků a zkoušeného roztoku v křemenných kyvetách při 562 nm proti kontrolnímu roztoku. Po ochlazení roztoků na pokojovou teplotu se intenzita zbarvení pravidelně zvyšuje.

Výpočty. Závislost absorbance na koncentraci bílkoviny je nelineární; avšak, je-li rozmezí koncentrací použitých k přípravě kalibrační křivky dostatečně malé, blíží se přímce. Vynesou se absorbance porovnávacích roztoků proti koncentracím bílkoviny a použitím lineární regrese se sestrojí kalibrační křivka, z níž se za použití naměřené absorbance odečte koncentrace bílkoviny ve zkoušeném roztoku.

Metoda 5

Tato metoda (obvykle uváděna jako biuretové stanovení obsahu) je založena na interakci měďnatých iontů (Cu^2+) s bílkovinou v alkalickém roztoku; výsledná absorbance se měří při 545 nm. Tato zkouška vykazuje minimální rozdíly mezi ekvivalentem IgG a vzorky albuminu. Přidání hydroxidu sodného a zkoumadla biuretového jako složeného zkoumadla, nedostatečné promíchání po přídavku hydroxidu sodného a nebo nadbytečná doba mezi přídavkem hydroxidu sodného a přídavkem zkoumadla biuretového mohou způsobit u vzorků IgG vyšší odezvu než u vzorků albuminu. K minimalizaci vlivu rušicích látek na stanovení bílkovin se může použít metoda kyseliny trichlorooctové u zkoušených vzorků s obsahem bílkoviny nižším než 500 µg/ml.

K přípravě všech tlumivých roztoků a zkoumadel použitých v této metodě se použije voda destilovaná R.

Zkoušený roztok. Vhodné množství zkoušené látky se rozpustí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby koncentrace roztoku byla v rozmezí koncentrací porovnávacích roztoků.

Porovnávací roztoky. Referenční látka pro stanovení bílkoviny se rozpustí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Tento roztok se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby se získaly nejméně tři porovnávací roztoky o koncentraci bílkoviny rovnoměrně rozložené ve vhodném rozmezí mezi 0,5 mg/ml a 10 mg/ml.

Kontrolní roztok. Použije se roztok chloridu sodného R (9 g/l).

Zkoumadlo biuretové. 3,46 g síranu měďnatého R se rozpustí v 10 ml horké vody destilované R a nechá se ochladit (roztok A). 34,6 g citronanu sodného R a 20,0 g uhličitanu sodného bezvodého R se rozpustí v 80 ml horké vody destilované R a nechá se ochladit (roztok B). Roztoky A a B se smíchají a zředí se vodou destilovanou R na 200 ml. Použije se během 6 měsíců. Zkoumadlo nelze použít, jestliže se zakalí nebo obsahuje-li sraženinu.

Postup. K jednomu objemovému dílu zkoušeného roztoku se přidá stejný objemový díl roztoku hydroxidu sodného R (60 g/l) a promíchá se. Ihned se přidá zkoumadlo biuretové, odpovídající 0,4 objemovým dílům zkoušeného roztoku, a rychle se promíchá. Nechá se stát nejméně 15 min při 15 °C až 25 °C. Během 90 min po přidání biuretového zkoumadla se měří absorbance (2.2.25) porovnávacích roztoků a zkoušeného roztoku v maximu při 545 nm proti kontrolnímu roztoku. Pro výpočet obsahu bílkoviny se nepoužije žádný z roztoků, který měl zákal nebo sraženinu.

Výpočet. Závislost absorbance na koncentraci bílkoviny je téměř lineární v daném rozmezí koncentrací bílkoviny v porovnávacích roztocích. Vynesou se absorbance porovnávacích roztoků proti koncentracím bílkoviny a použitím lineární regrese se sestrojí kalibrační křivka. Vypočítá se korelační koeficient kalibrační křivky. Vhodný systém je takový jehož přímka má korelační koeficient nejméně 0,99. Z kalibrační křivky se za použití naměřené absorbance odečte koncentrace bílkoviny ve zkoušeném roztoku.

Rušicí látky. Aby se minimalizoval vliv rušicích látek, může se bílkovina ze zkoušené látky srážet takto: 0,1 objemového dílu roztoku kyseliny trichlorooctové R (500 g/l) se přidá k 1 objemovému dílu zkoušeného roztoku, supernatantní tekutina se odstraní, sraženina se rozpustí v malém množství hydroxidu sodného 0,5 mol/l RS. Tento roztok se použije k přípravě zkoušeného roztoku.

Metoda 6

Tato fluorimetrická metoda je založena na derivatizaci bílkoviny s o-ftalaldehydem, který reaguje s primárními aminy bílkoviny (N-terminální aminokyseliny a ε-aminoskupiny lysinových zbytků). Citlivost zkoušky může být zvýšena hydrolýzou bílkoviny provedenou před přídavkem o-ftalaldehydu. Hydrolýza umožňuje α-aminoskupinám obsaženým v aminokyselinách reagovat se zkoumadlem ftalaldehydovým. Tato metoda vyžaduje velmi malá množství bílkoviny. Je nutné se vyvarovat nebo vyloučit primární aminy, jako např. trometamol a tlumivé roztoky s aminokyselinami, protože reagují se zkoumadlem ftalaldehydovým. Amoniak při vysoké koncentraci reaguje s ftalaldehydem. Reagují-li aminy s ftalaldehydem, je získaná fluorescence nestabilní. Použití automatizovaného postupu ke standardizaci tohoto postupu může zlepšit správnost a přesnost zkoušky.

K přípravě všech tlumivých roztoků a zkoumadel použitých v této metodě se použije voda destilovaná R.

Zkoušený roztok. Vhodné množství zkoušené látky se rozpustí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby koncentrace roztoku byla v rozmezí koncentrací porovnávacích roztoků. Před přidáním zkoumadla ftalaldehydového se upraví pH na hodnotu 8 až 10,5.

Porovnávací roztoky. Referenční látka pro stanovení bílkoviny se rozpustí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Tento roztok se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby se získalo nejméně pět porovnávacích roztoků o koncentraci bílkoviny rovnoměrně rozložené ve vhodném rozmezí mezi 10 µg/ml a 200 µg/ml. Před přidáním zkoumadla ftalaldehydového se upraví pH na hodnotu 8 až 10,5.

Kontrolní roztok. Použije se roztok chloridu sodného R (9 g/l).

Tlumivý roztok boritanový. 61,83 g kyseliny borité R se rozpustí ve vodě destilované R, upraví se pH roztokem hydroxidu draselného R na hodnotu 10,4, zředí se vodou destilovanou R na 1000 ml a promíchá se.

Ftalaldehydový zásobní roztok. 1,20 g ftaldialdehydu R se rozpustí v 1,5 ml methanolu R, přidá se 100 ml tlumivého roztoku boritanového a promíchá se. Přidá se 0,6 ml roztoku lauromakrogolu 23 R (300 g/l) a promíchá se. Uchovává se při pokojové teplotě a použije se během tří týdnů.

Zkoumadlo ftalaldehydové. K 5 ml ftalaldehydového zásobního roztoku se přidá 15 µl 2-merkaptoethanolu R. Připraví se nejméně 30 min před použitím. Použije se během 24 h.

Postup. 10 µl zkoušeného roztoku a po 10 µl každého z porovnávacích roztoků se smíchá s 0,1 ml zkoumadla ftalaldehydového a nechá se stát 15 min při pokojové teplotě. Přidají se 3 ml hydroxidu sodného 0,5 mol/l RS a promíchá se. Měří se intenzity fluorescence (2.2.21) porovnávacích roztoků a zkoušeného roztoku při excitační vlnové délce 340 nm a emisní vlnové délce v rozmezí 440 nm až 455 nm. Fluorescence daného vzorku se měří jen jednou, neboť záření snižuje intenzitu fluorescence.

Výpočty. Závislost fluorescence na koncentraci bílkoviny je lineární. Vynesou se intenzity fluorescence porovnávacích roztoků proti koncentracím bílkoviny a použitím lineární regrese se sestrojí kalibrační křivka. Z kalibrační křivky a z intenzity fluorescence zkoušeného roztoku se stanoví koncentrace bílkoviny ve zkoušeném roztoku.

Metoda 7

Tato metoda je založena na dusíkové analýze jako prostředku stanovení bílkovin. Rušení způsobené přítomností dalších látek obsahujících dusík ve zkoušené látce může ovlivnit stanovení bílkoviny touto metodou. Metodou stanovení dusíku se vzorek během analýzy rozkládá, ale metoda není omezena na přítomnost bílkoviny ve vodných prostředích. Postup A. Provede se postupem uvedeným ve zkoušce Dusík mineralizací s kyselinou sírovou (2.5.9), nebo se použije komerčně dostupné zařízení pro stanovení dusíku podle Kjeldahla.

Postup B. Komerčně dostupné zařízení lze použít pro dusíkovou analýzu. Nejpoužívanější instrumentální metodou je pyrolýza (tj. spalování vzorku v kyslíku při teplotách blížících se 1000 °C), při které z dusíku přítomného ve zkoušené látce vznikají oxid dusnatý (NO) a další oxidy dusíku (NOX). Některá zařízení mění oxidy dusíku na dusík (plyn), který se stanovuje termálně vodivostním detektorem. Jiná zařízení míchají oxid dusnatý (NO) s ozonem (O3) za vzniku excitovaného oxidu dusičitého (NO2^*), který při rozpadu emituje světlo a může být stanoven chemiluminiscenčním detektorem. Referenční bílkovina, která je relativně čistá a složením se shoduje se zkoušenými bílkovinami, se používá k optimalizaci nástřiků a parametrů pyrolýzy a k dosažení konzistence při analýze.

Výpočty. Koncentrace bílkoviny se vypočítá dělením obsahu dusíku ve vzorku o známé koncentraci obsahu bílkoviny. Známý obsah dusíku bílkoviny může být stanoven z chemického složení bílkoviny nebo porovnáním s vhodnou referenční látkou.

• 2.5.34 Kyselina octová v syntetických peptidech [image omitted]

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. Připraví se způsobem popsaným v článku.

Porovnávací roztok. Připraví se roztok kyseliny octové ledové R (0,10 g/l) ve směsi objemových dílů mobilní fáze B a mobilní fáze A (5 + 95).

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 µm),

• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,2 ml/min:

• mobilní fáze A - 0,7 ml kyseliny fosforečné R se zředí vodou R na 1000 ml; pH se upraví hydroxidem sodným koncentrovaným RS na hodnotu 3,0,

• mobilní fáze B - methanol R2,

Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)
0 - 5	95	5
5 - 10	95 → 50	5 → 50
10 - 20	50	50
20 - 22	50 → 95	50 → 5
22 - 30	95	5

• spektrofotometrického detektoru, 210 nm.

Nastříkne se 10 µl porovnávacího roztoku a 10 µl zkoušeného roztoku. Na získaných chromatogramech je retenční čas kyseliny octové 3 min až 4 min. Základní linie představuje strmý vzestup po začátku lineárního gradientu, který odpovídá eluci peptidu z kolony. Stanoví se obsah kyseliny octové v peptidu.

“

• 1. V příloze části 2 Zkušební metody, kapitola 2.6 Biologické zkoušky, kapitola 2.6.14 zní:

„

• 2.6.14 Bakteriální endotoxiny [image omitted]

Zkouška na bakteriální endotoxiny se používá k důkazu nebo stanovení endotoxinů pocházejících z gramnegativních bakterií za použití lyzátu z amebocytů ostrorepa (Limulus polyphemus nebo Tachypleus tridentatus). Ke zkoušce se používají tři metody: gelová, která je založena na tvorbě gelu, turbidimentrická, založená na vývoji zákalu po vazbě endogenního substrátu, a chromogenní, založená na vývoji zbarvení po vazbě se syntetickým peptidochromogenním komplexem.

V této stati je popsáno šest metod:

Metoda A. Gelová metoda: limitní zkouška

Metoda B. Gelová metoda: semikvantitativní zkouška

Metoda C. Turbidimetrická kinetická metoda

Metoda D. Chromogenní kinetická metoda

Metoda E. Chromogenní metoda konečného bodu

Metoda F. Turbidimetrická metoda konečného bodu

Zkouška se provede kteroukoli ze šesti metod. V případě nejistého nebo sporného výsledku, není-li v článku uvedeno jinak, se učiní konečné rozhodnutí podle metody A.

Zkouška se provádí způsobem, který vylučuje kontaminaci endotoxinem.

Zařízení

Z veškerého skla a ostatního tepelně odolného zařízení se endotoxin odstraní validovaným postupem v horkovzdušném sterilizátoru. Obvykle používaný minimální čas a teplota jsou 30 min a 250 °C. Používají-li se zařízení z plastu, jako např. mikrotitrační destičky a pipetovací špičky k automatickým pipetám, použije se materiál, který je prokazatelně prostý detegovatelného endotoxinu a interferujících účinků.

Poznámka. V této stati jsou označením zkumavka míněny všechny druhy nádob, včetně jamek mikrotitrační destičky.

Příprava zásobního roztoku standardního endotoxinu

Připravuje se z referenčního standardního endotoxinu, který byl kalibrován proti mezinárodnímu standardu, např. referenční endotoxin BRP.

Účinnost endotoxinu se vyjadřuje v mezinárodních jednotkách. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Poznámka. Jedna mezinárodní jednotka (m.j.) endotoxinu se rovná jedné endotoxinové jednotce (e.j.).

Příprava a uchovávání zásobního roztoku standardního endotoxinu se provádí postupem uvedeným v příbalové informaci a v označení na obalu.

Příprava roztoků standardního endotoxinu

Zásobní roztok standardního endotoxinu se silně protřepe a připraví se z něho odpovídající sériová ředění ve vodě pro zkoušku na bakteriální endotoxiny (voda pro BET).

Ředění se použijí co nejdříve, aby se zabránilo poklesu účinnosti způsobenému adsorpcí.

Příprava roztoků ke zkoušení

Roztoky ke zkoušení se připraví rozpuštěním nebo naředěním účinné látky nebo léčivého přípravku ve vodě pro BET. Některé látky nebo přípravky je vhodnější rozpouštět nebo ředit v jiných vodných roztocích. Je-li třeba, upraví se pH zkoušeného roztoku nebo jeho ředění tak, aby pH směsi lyzátu a zkoušeného roztoku bylo v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. To je u přípravků obvykle v rozsahu pH 6,0 až 8,0; pH je možno upravit kyselinou, zásadou nebo vhodným tlumivým roztokem podle doporučení výrobce lyzátu. Kyseliny a zásady se mohou připravit z koncentrátů nebo z pevné látky a vody pro BET v nádobách prostých detegovatelného endotoxinu. Tlumivé roztoky se validují, že neobsahují detegovatelný endotoxin ani interferující faktory.

Stanovení nejvyššího účinného ředění

Nejvyšší účinné ředění (MVD) je nejvyšší přípustné ředění vzorku, ve kterém ještě lze stanovit limitní koncentraci endotoxinu MVD. Vypočítá podle vzorce:

MVD=limitní koncentrace endotoxinu×koncentrace zkoušeného roztokuλ

Limitní koncentrace endotoxinu. Pro účinné látky k parenterálnímu podání se limitní koncentrace endotoxinu vypočítá na základě dávky ze vzorce:

KM,

v němž značí:

K - prahovou pyrogenní dávku endotoxinu na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu,

M - nejvyšší doporučenou dávku přípravku na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu.

Limitní koncentrace endotoxinu se u účinných látek pro parenterální podání v článcích uvádí v jednotkách, jako např. m.j./ml, m.j./mg, m.j./j. biologické účinnosti.

Koncentrace zkoušeného roztoku:

• v mg/ml, jestliže limitní koncentrace endotoxinu je uvedena na hmotnost (m.j./mg),

• v m.j./ml, jestliže limitní koncentrace endotoxinu je uvedena na jednotku biologické účinnosti (m.j./j.),

• v ml/ml, jestliže limitní koncentrace endotoxinu je uvedena na objem (m.j./ml).

λ - deklarovaná citlivost lyzátu naměřená gelovou metodou (m.j./ml) nebo nejnižší koncentrace endotoxinu použitá při přípravě standardní křivky turbidimetrickou nebo chromogenní metodou.

GELOVÁ METODA (METODY A a B)

Gelová metoda umožňuje detekci nebo kvantitativní stanovení endotoxinů a spočívá ve vysrážení lyzátu v přítomnosti endotoxinů. Koncentrace endotoxinů, která způsobí vysrážení lyzátu za standardních podmínek, je deklarovaná citlivost lyzátu. Pro ověření přesnosti a validity zkoušky se ověří citlivost lyzátu a provede se zkouška na interferující faktory, jak je popsáno v části 1. Předběžné zkoušení.

• 1. PŘEDBĚŽNÉ ZKOUŠENÍ

(i) Ověření deklarované citlivosti lyzátu

Před použitím ve zkoušce se deklarovaná citlivost λ, vyjádřená v m.j./ml, ověří na čtyřech vzorcích. Ověření citlivosti lyzátu se provede v případě, že se použije nová šarže lyzátu nebo dojde-li ke změně podmínek zkoušky, které by mohly ovlivnit její výsledek.

Naředěním zásobního roztoku standardního endotoxinu vodou pro BET se připraví nejméně čtyři koncentrace referenčních roztoků odpovídající 2λ, λ, 0,5λ a 0,25λ.

Jeden objem roztoku lyzátu se smíchá se stejným objemem jednoho z ředění referenčního roztoku (např. objemy 0,1 ml) ve zkumavce. Jestliže se použijí zkumavky nebo ampule s obsahem lyofilizovaného lyzátu pro jednu zkoušku, přidají se roztoky přímo do zkumavky nebo do ampule. Směs se inkubuje za konstantních podmínek doporučených výrobcem lyzátu (obvykle (37 ±1) °C, (60 ±2) min) za vyloučení vibrací. Zkouška celistvosti gelu: každá ze čtyř zkumavek se vyjme z termostatu a otočí plynulým pohybem vzhůru o 180°. Jestliže se vytvořil pevný gel, který po otočení zkumavky zůstane na místě, hodnotí se výsledek jako pozitivní. Výsledek je negativní, jestliže nevznikne celistvý gel.

Zkoušku nelze hodnotit, jestliže nejnižší koncentrace referenčních roztoků dává ve všech zkumavkách negativní výsledek.

Konečný bod je poslední pozitivní výsledek v sériových ředěních endotoxinu. Vypočítá se průměrná hodnota logaritmů koncentrací konečného bodu a poté antilogaritmus průměrné hodnoty pomocí následujícího vzorce:

Geometrický průměr koncentrace konečného bodu = antilog ∑ef,

v němž značí:

Ʃe - součet logaritmů koncentrací konečného bodu použitých řad ředění,

ƒ - počet zkumavek.

Geometrický průměr koncentrací konečných bodů je naměřená citlivost roztoku lyzátu (m.j./ml). Jestliže je výsledek v rozmezí 0,5λ až 2λ, je deklarovaná citlivost potvrzena a používá se ve zkouškách s tímto lyzátem.

(ii) Zkouška na interferující faktory

Připraví se roztoky A, B, C a D podle tabulky 2.6.14-1 a použijí se zkoušené roztoky v ředění nižším než MVD tak, aby neobsahovaly detegovatelné množství endotoxinů a provede se zkouška postupem uvedeným v části 1. Předběžné zkoušení, (i) Ověření deklarované citlivosti lyzátu.

Geometrický průměr koncentrací konečných bodů roztoků B a C se stanoví za použití pojmů uvedených v části 1. Předběžné zkoušení, (i) Ověření deklarované citlivosti lyzátu.

Zkouška na interferující faktory se opakuje, jestliže nastaly nějaké změny v experimentálních podmínkách, které pravděpodobně ovlivní výsledek zkoušky.

Tab. 2.6.14-1

Roztok	Koncentrace endotoxinu/ roztok, k němuž se endotoxin přidá	Ředidlo	Ředicí faktor	Počáteční koncentrace endotoxinu	Počet zkumavek
A	žádná/zkoušený roztok	-	-	-	4
B	2λ/zkoušený roztok	zkoušený roztok	1	2λ	4
2	1λ	4
4	0,5λ	4
8	0,25λ	4
C	2λ/voda pro BET	voda pro BET	1	2λ	2
2	1λ	2
4	0,5λ	2
8	0,25λ	2
D	žádná/voda pro BET	-	-	-	2

Roztok A - roztok zkoušeného přípravku bez detegovatelných endotoxinů,

Roztok B - zkouška na interferující faktory,

Roztok C - kontrola deklarované citlivosti lyzátu,

Roztok D - negativní kontrola (voda pro BET).

Zkoušku lze hodnotit, jestliže v žádné zkumavce roztoků A a D nedojde k reakci a výsledek v roztoku C potvrdí deklarovanou citlivost lyzátu.

Jestliže citlivost lyzátu stanovená v roztoku B není nižší než 0,5λ a není vyšší než 2λ, zkoušený roztok v daných podmínkách neobsahuje interferující faktory. Jinak roztok interferuje se zkouškou.

Jestliže přípravek interferuje v podmínkách zkoušky a jeho ředění je nižší než MVD, zkouška na přítomnost interferujících látek se opakuje s vyšším ředěním, které však nepřesahuje MVD. Použití lyzátu o vyšší citlivosti umožňuje vyšší ředění zkoušeného přípravku a to může přispět k vyloučení interference.

Interference může být odstraněna vhodným postupem, jako je filtrace, neutralizace, dialýza nebo zahřátí. Průkaz, že zvoleným postupem byly účinně odstraněny interferující faktory bez ztráty endotoxinů, se provede opakovanou zkouškou na interferující faktory s tím, že se ke zkoušenému přípravku přidá standardní endotoxin a pak se provede zvolený postup.

• 1. LIMITNÍ ZKOUŠKA (METODA A)

(i) Postup

Připraví se roztoky A, B, C a D podle tabulky 2.6.14-2 a zkouška se provede postupem uvedeným v části 1. Předběžné zkoušení, (i) Ověření deklarované citlivosti lyzátu.

Tab. 2.6.14-2

Roztok	Koncentrace endotoxinu/roztok, ke kterému byl přidán endotoxin	Počet zkumavek
A	bez endotoxinu/ředěný zkoušený roztok	2
B	2λ/ředěný zkoušený roztok	2
C	2λ/voda pro BET	2
D	bez endotoxinu/voda BET	2

Připraví se roztoky A a B (pozitivní kontrola vzorku) v ředění nepřesahujícím MVD a použijí se postupy uvedené v části 1. Předběžné zkoušení (ii) Zkouška na interferující faktory. Roztoky B a C (pozitivní kontroly) obsahují standardní endotoxin v koncentraci odpovídající dvojnásobku deklarované citlivosti lyzátu. Roztok D (negativní kontrola) obsahuje vodu pro BET.

(ii) Hodnocení

Zkoušku lze hodnotit, jestliže ve všech zkumavkách pozitivních kontrolních roztoků B a C je pozitivní výsledek a v obou zkumavkách negativního kontrolního roztoku D je negativní výsledek.

Zkoušený přípravek vyhovuje podmínkám zkoušky, jestliže v obou zkumavkách roztoku A je negativní výsledek.

Jestliže je v obou zkumavkách roztoku A výsledek pozitivní, pak:

• je-li zkoušený přípravek naředěn na hodnotu MVD, nevyhovuje zkoušce,

• je-li zkoušený přípravek naředěn na nižší hodnotu než je MVD, zkouška se opakuje s ředěním nepřesahujícím MVD.

Zkouška se opakuje, jestliže je v jedné ze zkumavek roztoku A zjištěn pozitivní výsledek a ve druhé zkumavce výsledek negativní. Zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce, je-li při opakování v obou zkumavkách roztoku A negativní výsledek.

• 1. SEMIKVANTITATIVNÍ ZKOUŠKA (METODA B)

(i) Postup

Ve zkoušce se stanoví množství bakteriálních endotoxinů ve zkoušeném roztoku titrací do konečného bodu. Připraví se roztoky A, B, C a D podle tabulky 2.6.14-3 a zkouška se provede postupem uvedeným v části 1. Předběžné zkoušení (i) Ověření deklarované citlivosti lyzátu.

Tab 2.6.14-3

Roztok	Koncentrace endotoxinu/roztok, ke kterému byl přidán endotoxin	Ředidlo	Ředicí faktor	Počáteční koncentrace endotoxinu	Počet zkumavek
A	bez endotoxinu/ zkoušený roztok	voda pro BET	1	-	2
2	-	2
4	-	2
8	-	2
B	2λ/zkoušený roztok			2λ	2
C	2λ/voda pro BET	voda pro BET	1	2λ	2
2	1λ	2
4	0,5λ	2
8	0,25λ	2
D	bez endotoxinu/voda pro BET	-	-	-	2

Roztok A - zkoušený roztok v ředění nepřevyšujícím MVD, se kterým byla provedena zkouška na interferující faktory. Další ředění zkoušeného roztoku nesmí přesáhnout MVD. Použije se voda pro BET a připraví se dvě řady ředění: 1, 1/2, 1/4 a 1/8 ve vztahu k ředění, se kterým byla provedena zkouška na interferující faktory. Je-li to vhodné, použijí se další ředění,

Roztok B - roztok A obsahující standardní endotoxin v koncentraci 2λ (pozitivní kontrola přípravku),

Roztok C - dvě řady zkumavek s vodou pro BET obsahující standardní endotoxin v koncentraci 2λ, 1λ, 0,5λ a 0,25λ,

Roztok D - voda pro BET (negativní kontrola).

(ii) Výpočet a hodnocení

Zkoušku lze hodnotit, jestliže jsou splněny následující tři podmínky:

(a) obě zkumavky roztoku D (negativní kontrola) jsou negativní,

(b) obě zkumavky roztoku B (pozitivní kontrola) jsou pozitivní,

(c) geometrický průměr koncentrace roztoku C v konečném bodu je v rozmezí 0,5λ až 2λ.

Pro stanovení koncentrace endotoxinu v roztoku A se vypočítá koncentrace konečného bodu v každé řadě ředění vynásobením faktoru ředění každého konečného bodu citlivosti lyzátu (λ).

Koncentrace endotoxinu ve zkoušeném roztoku je geometrický průměr koncentrací konečného bodu ve zkumavkách (viz vyjádření uvedené v části 1 Předběžné zkoušení, (i) Ověření deklarované citlivosti lyzátu). Jestliže byl zkoušený roztok ředěn, vypočítá se koncentrace endotoxinu v původním roztoku vynásobením výsledku ředicím faktorem.

Nedává-li žádné ředění zkoušeného roztoku pozitivní výsledek a zkoušku lze hodnotit, označí se koncentrace endotoxinu jako nižší než λ (nebo byl-li zkoušen ředěný vzorek, jako λ × nejnižší ředicí faktor vzorku). Jsou-li všechna ředění pozitivní, koncentrace endotoxinu se zaznamená jako rovná nebo vyšší než nejvyšší ředicí faktor násobený λ (např. podle Tab. 2.6.14-3, počáteční ředicí faktor × 8 × λ).

Přípravek vyhovuje požadavkům zkoušky, jestliže koncentrace endotoxinu je nižší než koncentrace uvedená v jednotlivém článku.

FOTOMETRICKÉ METODY (METODY C, D, E a F)

• 1. TURBIDIMENTRICKÉ METODY (METODY C a F)

U těchto metod se fotometricky měří vzestup zákalu. Podle požitého principu se tyto metody označují jako turbidimetrická zkouška konečného bodu nebo turbidimetrická kinetická zkouška.

Turbidimetrická zkouška konečného bodu (Metoda F) je založena na kvantitativním poměru mezi koncentrací endotoxinu a zákalem (absorbance nebo transmitance) reakční směsi na konci inkubační doby.

Turbidimetrická kinetická zkouška (Metoda C) měří buďto čas (začátek času) potřebný k tomu, aby reakční směs dosáhla předem stanovené absorbance, nebo rychlost vývoje zákalu.

Zkouška se provádí při teplotě inkubace doporučené výrobcem lyzátu (obvykle 37 °C ±1 °C).

• 1. CHROMOGENNÍ METODY (METODY D a E)

U těchto metod se měří chromofor uvolněný z vhodného chromogenního peptidu při reakci endotoxinů s lyzátem. Podle použitého principu se tyto metody označují jako chromogenní zkouška konečného bodu nebo chromogenní kinetická zkouška.

Chromogenní zkouška konečného bodu (Metoda E) je založena na kvantitativním poměru mezi koncentrací endotoxinu a množstvím uvolněného chromoforu v závěru inkubace.

Chromogenní kinetická zkouška (Metoda D) měří buďto čas (začátek času) potřebný k tomu, aby reakční směs dosáhla předem stanovené absorbance, nebo rychlost vývoje zbarvení.

Zkouška se provádí při teplotě inkubace doporučené výrobcem lyzátu (obvykle 37 °C ±1 °C).

• 1. PŘEDBĚŽNÉ ZKOUŠENÍ

K zajištění přesnosti nebo platnosti turbidimetrických a chromogenních zkoušek se provádějí předběžná zkoušení, aby se zajistilo, že kritéria pro standardní křivku jsou vhodná a že zkoušený roztok ve zkoušce neinterferuje.

Validace zkoušky se požaduje, když byla učiněna jakákoliv změna experimentálních podmínek, která pravděpodobně ovlivní výsledek zkoušky.

(i) Zajištění kritérií pro standardní křivku

K přípravě nejméně tří koncentrací pro standardní křivku se použije roztok standardního endotoxinu. Zkouška se provede nejméně ve třech zkumavkách každého ředění standardního endotoxinu tak, jak je doporučeno výrobcem lyzátu (poměry objemu, inkubační čas, teplota, pH atd.)

Jestliže je v kinetické metodě požadováno rozmezí vyšší než 2 log, musí se doplnit další standardy k podpoře logaritmického zvýšení v průběhu standardní křivky.

Absolutní hodnota korelačního koeficientu | r | musí být vyšší nebo rovna 0,980 pro rozmezí koncentrací endotoxinu uvedených výrobcem lyzátu.

(ii) Zkouška na interferující faktory

Zvolí se koncentrace endotoxinu ve středu nebo v blízkosti střední hodnoty endotoxinové standardní křivky.

Připraví se roztoky A, B, C a D, jak je uvedeno v tabulce 2.6.14-4. Zkouška se provede nejméně na dvojici zkumavek těch roztoků, které doporučuje výrobce lyzátu (objem zkoušeného roztoku a roztoku lyzátu, vzájemný poměr objemu zkoušeného roztoku a roztoku lyzátu, inkubační čas atd.).

Tab. 2.6.14-4

Roztok	Koncentrace endotoxinu	Roztok, k němuž se přidá endotoxin	Počet zkumavek
A	žádná	zkoušený roztok	nejméně 2
B	střední koncentrace standardní křivky	zkoušený roztok	nejméně 2
C	nejméně tři koncentrace (nejnižší koncentrace je označena λ)	voda pro BET	každá koncentrace nejméně 2
D	žádná	voda pro BET	nejméně 2

Roztok A - zkoušený roztok ředěný nejvýše na MVD,

Roztok B - zkoušený přípravek ve stejném ředění jako roztok A obsahující endotoxin, jehož koncentrace se rovná nebo se blíží střední hodnotě standardní křivky,

Roztok C - roztok standardního endotoxinu v koncentraci, která byla použita při validaci metody postupem uvedeným v části 3. Předběžné zkoušení, (i) Zajištění kritérií pro standardní křivku (pozitivní kontroly),

Roztok D - voda pro BET (negativní kontrola).

Odečtením průměrné koncentrace endotoxinu (byla-li naměřena) v roztoku od koncentrace endotoxinu v roztoku, ke kterému byl endotoxin přidán se vypočítá průměrná hodnota záchytu přidaného endotoxinu.

Zkoušený roztok se považuje za prostý interferujících faktorů, jestliže v podmínkách zkoušky je naměřená koncentrace endotoxinu, přidaného ke zkoušenému roztoku, po odečtení jakéhokoli množství endotoxinu detegovaného v roztoku, ke kterému nebyl přidán endotoxin v rozmezí 50 % až 200 % koncentrace přidaného endotoxinu.

Je-li záchyt endotoxinu mimo stanovený rozsah, je nutno odstranit interferující faktory postupem popsaným v části Gelová metoda 1. Předběžné zkoušení, (ii) Zkouška na interferující faktory. Účinnost ošetření se ověří opakováním zkoušky na interferující faktory.

• 1. ZKOUŠENÍ

(i) Postup

Postupuje se, jak je uvedeno v části 3. Předběžné zkoušení, (ii) Zkouška na interferující faktory.

(ii) Výpočet

Vypočítá se koncentrace endotoxinu pro každou zkumavku roztoku A pomocí standardní křivky připravené ze série pozitivních kontrol, roztok C.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže jsou splněny tři následující podmínky:

(a) výsledek v roztoku D (negativní kontrola) nepřesahuje limit slepého vzorku uvedený v popisu pro použitý lyzát,

(b) výsledky série pozitivních kontrol, roztok C, vyhovují požadavkům pro validaci uvedených v části 3. Předběžné zkoušení, (i) Zajištění kritérií pro standardní křivku (pozitivní kontroly),

(c) záchyt endotoxinu, vypočítaný z koncentrace endotoxinu nalezené v roztoku B po odečtení koncentrace endotoxinu nalezené v roztoku A, je v rozmezí 50 % až 200 %.

(iii) Hodnocení

Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže průměrná koncentrace endotoxinu ve zkumavkách roztoku A po opravě naředění a koncentrace je nižší než limit endotoxinu pro přípravek.

• 1. ZKOUMADLA

(i) Roztok lyzátu

Lyzát z amebocytů se rozpustí ve vodě pro BET nebo v tlumivém roztoku podle doporučení výrobce lyzátu opatrným mícháním. Rekonstituovaný lyzát se uchovává v lednici nebo zmražený podle návodu výrobce.

(ii) Amebocytový lyzát

Lyzát z amebocytů je lyofilizovaný přípravek, který se získává z lyzátu amebocytů ostrorepů (Limulus polyphemus nebo Tachypleus tridentatus). Toto zkoumadlo se vztahuje pouze na přípravky vyrobené v souladu s nařízeními odpovědné autority.

Lyzát z amebocytů reaguje po přidání endotoxinu s některými ß-glukany. Dostupné jsou též lyzáty, které nereagují s glukany; jsou připraveny odstraněním G faktoru reagujícího s glukany nebo inhibicí amebocytového systému, který reaguje s faktorem G. Tyto přípravky se mohou použít ve zkoušce na endotoxin v přítomnosti glukanů.

(iii) Voda pro BET (voda pro zkoušku na bakteriální endotoxiny)

Voda pro BET je voda pro injekce R nebo voda připravená jinými postupy, která nedává reakci s lyzátem použitým k detekci limitu zkoumadla.

Následující část je uvedena pro informaci a jen jako návod; netvoří závaznou část obecných metod.

Zkouška na bakteriální endotoxiny: pokyny

• 1. Úvod

Endotoxiny pocházející z gramnegativních bakterií jsou nejčastější příčinou toxických reakcí vyplývajících z kontaminace farmaceutických přípravků pyrogenními látkami; pyrogenní účinnost endotoxinů je mnohem vyšší než účinnost jiných pyrogenních látek. Endotoxiny jsou lipopolysacharidy. Ačkoli množství pyrogenních látek s odlišnou strukturou je malé, obecně platí, že nepřítomnost bakteriálních endotoxinů v přípravku je známkou absence pyrogenních složek za předpokladu, že lze vyloučit přítomnost neendotoxinových pyrogenních látek.

Přítomnost endotoxinu v přípravku může být zakryta faktory interferujícími s reakcí mezi amebocytárním lyzátem a endotoxiny. Proto analytik, chce-li nahradit zkoušku na pyrogenní látky na králících, která je požadována lékopisným článkem, zkouškou na endotoxiny, musí prokázat, že dotyčný přípravek lze zkoušet validovaným způsobem; to může obsahovat postup na odstranění interferujících faktorů.

Jak je uvedeno ve zkoušce na bakteriální endotoxiny, je třeba mít dostatečné informace o následujících dvou aspektech dříve, než bude zkouška se vzorkem uznána za validovanou:

• 1.1 Prokáže se vhodnost materiálů ke zkoušce. Musí se zajistit nepřítomnost endotoxinu ve vodě pro BET a v ostatních zkoumadlech a musí kontrolovat citlivost lyzátu, aby se potvrdila citlivost deklarovaná výrobcem.

• 1.2 Protože zkoušený přípravek může ve zkoušce interferovat, přezkouší se citlivost lyzátu v nepřítomnosti i v přítomnosti zkoušeného přípravku. Mezi oběma hodnotami citlivosti se nezjistí signifikantní rozdíl.

Zkouška na bakteriální endotoxiny (2.6.14) vyjmenovává metody na odstranění interferujících faktorů; v případě interference se po použití takové metody provede jiná zkouška, aby se ověřilo, zda se interference neutralizovala nebo odstranila.

V tomto dodatku jsou vysvětleny důvody pro požadavky obsažené ve zkoušce na bakteriální endotoxiny, dále je pojednáno o odečítání a interpretaci výsledků.

Nahrazení zkoušky na pyrogenní látky na králících v lékopisném článku zkouškou s lyzátem z amebocytů je v podstatě použitím alternativní analytické metody, a proto vyžaduje validaci. Některé pokyny k jejímu provedení jsou uvedeny v části 11.

V článku příslušného přípravku je uvedena referenční metoda na stanovení endotoxinů, není-li tato metoda uvedena, použije se metoda A. Je-li použita jiná než referenční metoda, musí laboratorní pracovník prokázat, že je tato metoda vhodná pro daný přípravek a jsou jí dosaženy konzistentní výsledky jako s metodou referenční (viz též část 13).

• 1. Metoda

Přidání endotoxinů k lyzátu z amebocytů může skončit vznikem zákalu, sraženiny nebo gelu; pouze vznik gelu byl v lékopise použit jako rozhodující kritérium u prvního typu zkoušky na bakteriální endotoxiny. Výhodou byla jednoduchost založená na rozhodnutí, zda přípravek vyhovuje nebo nevyhovuje na základě prostým okem patrné přítomnosti nebo nepřítomnosti gelu. Kvantitativní metody uvedené jako metody C, D, E a F byly vyvinuty později: vyžadují více přístrojového vybavení, ale dají se snadněji automatizovat pro správné zkoušení velkého počtu vzorků jednoho přípravku.

Endotoxiny se mohou adsorbovat na povrch zkumavek nebo pipet z určitých plastů nebo typů skla. Uvolnění látek z plastických materiálů může vyvolat interferenci. Proto se mají používané materiály kontrolovat; složení následujících šarží zkumavek nebo pipet se mohou mírně lišit, a proto se doporučuje, aby laboratorní pracovník opakoval takové zkoušky před použitím nové šarže materiálů.

Rozhodnutí použít zkoušku na bakteriální endotoxiny jako limitní zkoušku je dáno tím, že za prvé musí být definována prahová koncentrace endotoxinu pro zkoušený přípravek a za druhé, že cílem zkoušky je znát, zda-li je koncentrace endotoxinu v přípravku pod nebo nad hranicí této prahové hodnoty. Kvantitativními metodami C, D, E a F je možné stanovit koncentraci endotoxinu ve zkoušeném vzorku, ale pro soulad s lékopisem a v rutinní kontrole jakosti je konečná otázka, zda tato koncentrace je nebo není vyšší než požadovaný limit.

Při stanovování prahové koncentrace endotoxinu u zkoušeného přípravku je nutno brát zřetel na dávku přípravku: práh má být určen tak, aby zajistil pokud je koncentrace endotoxinu v přípravku pod prahovou hodnotou, že ani nejvyšší dávka podaná zamýšleným způsobem za hodinu neobsahuje dostatek endotoxinu k vyvolání toxické reakce.

Jestliže je koncentrace endotoxinu v přípravku přesně rovna prahové hodnotě, vznikne gel, jako v případě, kdy je koncentrace endotoxinu mnohem vyšší a přípravek nevyhoví zkoušce, protože nelze rozlišit mezi koncentrací přesně se rovnající prahové koncentraci a mezi koncentrací vyšší. Pouze v případě, kdy nevznikne gel, může analytik rozhodnout, že koncentrace endotoxinu je pod prahovou koncentrací.

U pevných přípravků je třeba prahovou koncentraci endotoxinu na jednotku hmotnosti nebo mezinárodní jednotku přípravku převést na koncentraci endotoxinu v mililitru zkoušeného roztoku, neboť zkoušku lze provádět pouze u roztoků. Přípravky, které existují pouze v tekutém stavu, jako jsou infuzní roztoky, jsou uvedeny dále.

Limitní koncentrace endotoxinu: limitní koncentrace endotoxinu pro účinnou látku podávanou parenterálně se definuje na základě dávky a vypočítá se podle vzorce:

KM,

v němž značí:

K - prahovou pyrogenní dávku endotoxinu na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu,

M - nejvyšší doporučenou dávku přípravku na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu.

Limitní koncentrace endotoxinu závisí na druhu přípravku a jeho způsobu podání a je uvedena v jednotlivých článcích. Hodnoty K jsou uvedeny v tabulce 2.6.14-5.

Tab. 2.6.14-5

Způsob podání	K (v mezinárodních jednotkách endotoxinu na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu)
intravenózní	5,0
intravenózní pro radiofarmaka	2,5
intrathekální	0,2

Které ředění přípravku se má použít ve zkoušce, aby byla naprostá jistota, že negativní výsledek zkoušky znamená, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než limitní koncentrace endotoxinu a že pozitivní výsledek znamená, že lyzát detegoval koncentraci endotoxinu rovnou nebo vyšší, než je limitní koncentrace endotoxinu? Toto ředění závisí na limitní koncentraci endotoxinu a na citlivosti lyzátu: označuje se jako nejvyšší účinné ředění (MVD) a tato hodnota se může vypočítat ze vzorce:

MVD=limitní koncentrace endotoxinu×koncentrace zkoušeného roztokuλ

Koncentrace zkoušeného roztoku:

• v mg/ml, jestliže limitní koncentrace endotoxinu je stanovena na hmotnost (m.j./mg),

• v mj./ml, jestliže limitní koncentrace endotoxinu je stanovena na jednotku biologické účinnosti (m.j./j.),

• v ml/ml, jestliže limitní koncentrace endotoxinu je stanovena na objem (m.j./ml).

λ je deklarovaná citlivost lyzátu naměřená gelovou metodou (m.j./ml) nebo nejnižší koncentrace endotoxinu použitá při přípravě standardní křivky turbidimetrickou nebo chromogenní metodou.

Jestliže hodnota nejvyššího účinného ředění není celým číslem, pak je možno pro rutinní účel zvolit odpovídající celé číslo nižší než je MVD (čímž je míněno připravit roztok přípravku, který je méně zředěn, než uvádí MVD). V tomto případě negativní výsledek zkoušky ukazuje, že koncentrace endotoxinu v přípravku se nachází pod hladinou limitní hodnoty. Je-li však koncentrace endotoxinu v přípravku v takovéto zkoušce nižší než ELC, ale dostatečně vysoká k tomu, aby při reakci s lyzátem došlo k tvorbě gelu, může být zkouška hodnocena za těchto podmínek jako pozitivní. Tudíž, je-li zkouška s tímto „vhodným“ ředicím faktorem pozitivní, je nutno přípravek ředit na MVD a zkoušku opakovat. V jakémkoli případě pochybností nebo sporu se použije MVD.

To zdůrazňuje důležitost ověření citlivosti lyzátu.

Příklad

Zkouší se roztok sodné soli fenytoinu, obsahující 50 mg/ml (zamýšlený pro intravenózní podání). Stanoví se MVD za použití následujících proměnných:

M - nejvyšší lidská dávka = 15 mg na kilogram hmotnosti za hodinu,

c - 50 mg/ml,

K - 5 m.j. endotoxinu na kilogram za hodinu v mezinárodních jednotkách,

λ - 0,4 m.j. endotoxinu v mililitru.

Řešení:

MVD=5.5015.10,4=41,67

Pro rutinní zkoušení tohoto přípravku je vhodné ředit 1 ml zkoušeného roztoku na 20 ml (MVD/2 zaokrouhleno na nejbližší menší celé číslo). Je-li však zkouška pozitivní, bude analytik muset ředit 1 ml na 41,67 ml a opakovat zkoušku. Ředění na 41,67 ml je rovněž nutné, jestliže se zkouškou má ukončit spor.

• 1. Referenční materiál

Referenční endotoxin BRP je určen pro použití jako porovnávací přípravek. Byl přezkoušen proti mezinárodnímu standardu endotoxinu a jeho účinnost je vyjádřena v mezinárodních jednotkách endotoxinu v jedné lahvičce. Mezinárodní jednotka endotoxinu je definována jako specifická účinnost obsažená v definovaném množství mezinárodního standardu.

Pro rutinní účely je možno použít jiný přípravek endotoxinu, jestliže byl přezkoušen proti mezinárodnímu standardu endotoxinu nebo endotoxinu BRP a jeho účinnost je vyjádřena v mezinárodních jednotkách endotoxinu.

Poznámka: Jedna mezinárodní jednotka (m.j.) endotoxinu je rovna jedné endotoxinové jednotce (e.j,).

• 1. Voda pro BET

Zkoušení na nepřítomnost endotoxinu v této látce zkouškou na pyrogenní látky na králíku bylo vyloučeno z praktických a teoretických důvodů:

• 4.1 Zkouška na králíku není dostatečně citlivá, aby mohla detegovat endotoxin ve vodě pro BET, určené ke zkoušení přípravků s velice nízkou limitní koncentrací endotoxinu.

• 4.2 Relativně nízká přesnost teplotní odpovědi u králíka vede k opakování na mnoha králících.

• 4.3 Termíny „pyrogenní látky“ a „endotoxiny“ označují skupiny látek, které nejsou zcela totožné.

Text zkoušky na bakteriální endotoxiny ukazuje, že i jiná metoda, než je trojnásobná destilace, se může použít k přípravě vody pro BET. Reverzní osmóza byla použita s dobrým výsledkem; někteří analytici mohou dávat přednost vodě destilované více než třikrát. V každém případě musí použitá metoda zaručit, že výsledný produkt je prost zjistitelných endotoxinů.