Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

| | Baňka č. | | DOC po n dnech (mg·l-1) | | | | | | 0 | n1 | n2 | n3 | nx | | | | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | Zkušební látka a inokulum | 1 | a1 | | | | | | | a2 | | | | | | | | | a, střední hodnota Ca(t) | | | | | | | | | 2 | b1 | | | | | | | | b2 | | | | | | | | | b, střední hodnota Cb(t) | | | | | | | | | Slepá zkouška s inokulem bez zkušební látky | 3 | c1 | | | | | | | c2 | | | | | | | | | c, střední hodnota Cc(t) | | | | | | | | | 4 | d1 | | | | | | | | d2 | | | | | | | | | d, střední hodnota Cd(t) | | | | | | | | | Cbl(t)=Cc(t)+Cd(t)2 | | | | | | | |

• 1. VYHODNOCENÍ NAMĚŘENÝCH DAT

| Baňka č. | | Rozklad po n dnech | | | | | | 0 | n1 | n2 | n3 | n4 | | | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | 1 | D1=1-Ca(t)-Cbl(t)Ca(0)-Cbl(0)×100 | 0 | | | | | | 2 | D2=1-Cb(t)-Cbl(t)Cb(0)-Cbl(0)×100 | 0 | | | | | | Střední hodnota* | D=D1-D22 | 0 | | | | |

^* Hodnoty D1 a D2 by neměly být průměrovány, pokud je mezi nimi významný rozdíl.

Poznámka: Podobné formuláře lze použít pro referenční chemickou látku a kontrolu toxicity.

• 1. ABIOTICKÁ KONTROLA (nepovinná)

| | Čas (dny) | | | 0 | t | | | --- | --- | --- | | DOC (mg·l-1) ve sterilní kontrole | Cs(0) | Cs(t) |

abiotický rozklad v %=Cs(0)-Cs(t)Cs(0)×100

• 1. SPECIFICKÁ CHEMICKÁ ANALÝZA (nepovinná)

	Zbylé množství zkušební chemické látky na konci zkoušky (mg·l-1)	Primární rozklad v procentech
Sterilní kontrola	sb
Inokulované zkušební médium	sa	Sb-SaSb×100

IVC. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ UVOLŇOVÁNÍ OXIDU UHLIČITÉHO (CO2) – MODIFIKOVANÁ STURMOVA ZKOUŠKA – metoda C.4-C podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IVC.1 PODSTATA METODY

Odměřený objem inokulovaného minerálního média obsahující známou koncentraci zkušební látky (10 – 20 mg DOC nebo TOC na litr), která je jediným zdrojem uhlíku, se provzdušňuje v temnu nebo v difusním světle regulovaným proudem vzduchu bez CO2. Rozklad se sleduje po dobu 28 dnů prostřednictvím vznikajícího CO2 jímaného v roztoku hydroxidu barnatého nebo sodného, kde se stanoví titrací zbytkového hydroxidu nebo jako anorganický uhlík. Množství CO2 vzniklého ze zkušební látky (po korekci na CO2 pocházející z čistého inokula) se vyjádří v procentech TCO2. Stupeň biologického rozkladu může být také vypočten z doplňkového stanovení DOC na začátku a na konci inkubace.

IVC.2 POPIS METODY

IVC.2.1 Přístroje

• a) Baňky na 2 – 5 l vybavené provzdušňovací trubicí dosahující až ke dnu nádoby a výstupnímo tvorem;

• b) Magnetické míchačky pro zkoušení špatně rozpustných látek;

• c) Absorpční lahv;

• d) Zařízení pro regulaci a měření průtoku vzduchu;

• e) Zařízení pro odstraňování CO2 při přípravě vzduchu bez CO2, popřípadě může být použita směs kyslíku bez CO2 a dusíku bez CO2 ve správném poměru (20 % O2 a 80 % N2) z lahví se stlačenými plyny;

• f) Zařízení na stanovení CO2 buď titračně nebo pomocí analyzátoru anorganického uhlíku;

• g) Zařízení pro membránovou filtraci (podle volby);

• h) Analyzátor DOC (podle volby).

IVC.2.2 Příprava minerálního média

Příprava zásobních roztoků je popsána v části I.6.2.

Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, přidá se po 1 ml roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.

IVC.2.3 Příprava a předběžná úprava inokula

Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod, z povrchových vod, z půd nebo z jejich směsi.

Viz I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5.

IVC.2.4 Příprava baněk

Jako příklad jsou uvedeny hodnoty pro baňky na 5 litrů obsahující 3 litry suspense. V případě použití menších objemů se hodnoty úměrně upraví, musí být ovšem zajištěno, aby bylo možné přesně měřit vznikající CO2.

Do každé baňky na 5 litrů se přenese 2 400 ml minerálního média. Přidá se vhodné množství připraveného inokula (viz I.6.4.1 a I.65), aby koncentrace suspendovaných látek v konečném objemu 3 l inokulované směsi byla 30 mg·l^-1. Eventuálně lze nejdříve zředit připravený kal v minerálním médiu na suspensi o koncentraci 500 – 1 000 mg·l^-1 a poté přidat alikvotní části do baňky na 5 litrů, aby byla dosažena koncentrace 30 mg·l^-1; zajistí se tím větší přesnost. Mohou být použity i jiné zdroje inokula (viz I.6.4.2).

Inokulovaná směs se přes noc provzdušňuje vzduchem bez CO2, aby se ze systému odstranil oxid uhličitý.

Odděleně do dvojic baněk se ze zásobních roztoků přidá zkušební látka a referenční látka tak, aby koncentrace pocházející z chemických látek byla v rozmezí 10 až 20 mg DOC nebo TOC na litr; některé lahve se nasadí jako kontrola inokula bez přidání chemických látek. Špatně rozpustné látky se odváží nebo odměří přímo do baněk, nebo se postupuje podle přílohy III.

Podle potřeby se jedna baňka použije ke kontrole možného inhibičního účinku zkušební látky, a to přidáním zkušební i referenční látky ve stejných koncentracích jako v ostatních baňkách.

Podle potřeby se další baňka použije k ověření, zda se zkušební látka nerozkládá abioticky, přičemž se použije roztok chemické látky bez inokula (viz I.6.6). Sterilizace se provádí přidáním vhodné koncentrace toxické látky.

Ve všech baňkách se upraví objem na 3 l přídavkem minerálního média bez CO2. Podle potřeby lze odebrat vzorky pro stanovení DOC (viz příloha II, bod 4) a/nebo pro specifickou analýzu. Poté se na výstup plynů u baněk připojí absorpční lahve.

V případě použití hydroxidu barnatého se za každou baňku na 5 litrů zařadí tři absorpční lahve, každá obsahující 100 ml roztoku Ba(OH)2 o koncentraci 0,0125 mol·l^-1. Roztok nesmí obsahovat sraženinu síranů a uhličitanu barnatého a jeho koncentrace musí být stanovena bezprostředně před použitím. Je-li použit hydroxid sodný, spojí se 2 absorpční lahve, z nichž druhá slouží jako kontrola, že byl veškerý CO2 zachycen v první absorpční lahvi. K tomuto účelu se hodí absorpční lahve opatřené sérovými uzávěry. Do každé absorpční lahve se přidá po 200 ml roztoku NaOH o koncentraci 0,05 mol·l^-1, což postačuje k absorpci veškerého oxidu uhličitého, který by se uvolnil při úplném rozkladu látky. Roztok hydroxidu sodného, i když je čerstvě připraven, obsahuje stopy uhličitanů; korekce se provede odečtením množství uhličitanů ve slepém pokusu.

IVC.2.5 Počet baněk v typické zkoušce

Baňka 1 a 2: Zkušební suspense

Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem

Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu

Dále se doporučují se nebo se podle potřeby použijí:

Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola

Baňka 7: Kontrola toxicity

Viz také bod I.6.7.

IVC.2.6 Provedení zkoušky

Zkouška se zahájí probubláváním vzduchu bez CO2 suspensí při průtoku 30 – 100 ml·min^-1. Za účelem analýzy obsahu CO2 se pravidelně odebírají vzorky absorbentu. Doporučuje se, aby se v průběhu prvních 10 dnů prováděly analýzy každý druhý až třetí den a dále pak každý pátý den až do 28. dne, což umožní rozpoznat období 10denního období rozkladu.

Ve dnech, kdy se provádí stanovení CO2, se odpojí absorpční lahev s hydroxidem barnatým bližší zkušební baňce a roztok hydroxidu barnatého se titruje 0,05M HCl za přítomnosti fenolftaleinu jako indikátoru. Zbývající dvě absorpční lahve se posunou k baňce a na konec řady se zařadí nová absorpční lahev se 100 ml čerstvě připraveného 0,0125M hydroxidu barnatého. Titrace se provádějí podle potřeby, např. je-li pozorována v první absorpční lahvi zřetelná sraženina a před tím, než vznikne viditelná sraženina ve druhé absorpční lahvi, nebo alespoň jednou týdně. Jinou možností je provést při použití NaOH jako absorbentu odběr malého vzorku hydroxidu sodného pomocí injekční stříkačky (podle použitého analyzátoru uhlíku) z absorpční lahve, která je nejblíže k baňce. Vzorek se nastříkne přímo do IC-části analyzátoru uhlíku pro analýzu anorganického uhlíku.

Obsah druhé absorpční lahve se analyzuje pouze na konci zkoušky s cílem stanovit korekci na možný únik CO2.

IVC.3 DATA A ZPRÁVY

IVC.3.1 Zpracování výsledků

Množství CO2 zachyceného v absorpční lahvi je v případě titračního stanovení dáno vztahem:

mg CO2=100×CB-0,5×V×CA×44

kde

V = objem HCl spotřebovaný při titraci 100 ml obsahu absorpční lahve (ml),

CB = koncentrace roztoku hydroxidu barnatého (mol·l^-1),

CA = koncentrace roztoku kyseliny chlorovodíkové (mol·l^-1).

Je-li CB 0,0125 mol·l^-1 a CA 0,05 mol·l^-1, je spotřeba pro titraci 100 ml roztoku Ba(OH)2 50 ml a hmotnost CO2 je dána vztahem:

0,052×44×počet ml HCl spotřebované při titraci=1,1×ml HCl

V tomto případě se tedy k přepočtu objemu HCl spotřebovaného při titraci na hmotnost vzniklého CO2 použije faktor 1,1.

S použitím příslušných výsledků titrace se vypočte hmotnost CO2 vzniklého ze samotného inokula a inokula se zkušební látkou a jejich rozdíl je hmotnost CO2 vzniklého ze samotné zkušební látky.

Je-li např. výsledkem titrace samotného inokula 48 ml a inokula se zkušební látkou 45 ml, je množství

CO2 z inokula=1,1×50-48=2,2 mg,

CO2 z inokula a zkušební látky=1,1×50-45=5,5 mg,

a tedy hmotnost CO2 vzniklého ze zkušební látky 3,3 mg.

Biologický rozklad v procentech se vypočte podle vztahu:

rozklad v procentech=vzniklý CO2 v mg×100TCO2×přidaná zkušební látka v mg

nebo

rozklad v procentech=vzniklý CO2 v mg×100TCO2×přidaný ve zkoušce v mg×3,67

přičemž 3,67 je převodní faktor (44/12) pro uhlík a oxid uhličitý.

Rozklad v procentech se po každém období vypočte dosazením hodnoty TCO2 vypočítané pro každý den až do doby, kdy byl měřen.

Při zachytávání do NaOH se vypočte hmotnost vzniklého CO2, vyjádřeného jako anorganický uhlík v mg, vynásobením koncentrace anorganického uhlíku v absorpční lahvi objemem absorpčního roztoku.

Rozklad v procentech se vypočte podle vztahu:

TCO2 v %=anorg. C ze zkušeb. baňky v mg - anorg. C ze slep. pokusu v mgTOC přidný jako zkušební látka v mg×100

Úbytky DOC se (nepovinně) vypočítají podle bodu I.7. Tento výsledek spolu s ostatními výsledky se zaznamenají do příslušného formuláře přehledu dat.

IVC.3.2 Platnost výsledků

Obsah anorganického uhlíku ve zkušební suspensi v minerálním médiu na začátku zkoušky musí být menší než 5 % TC a celkové množství CO2 vzniklé na konci slepé zkoušky s inokulem nesmí za normálních okolností překročit 40 mg na litr média. Jsou-li hodnoty větší než 70 mg CO2 na litr, měla by být data i experimentální postup kriticky přehodnoceny.

Viz také I.5.2.

IVC.3.3 Zprávy

Viz I.8.

IVC.4 PŘEHLED DAT

Dále je uveden příklad přehledu dat:

ZKOUŠKA NA UVOLŇOVÁNÍ OXIDU UHLIČITÉHO

• 1. LABORATOŘ

• 1. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY

• 1. ZKUŠEBNÍ LÁTKA

Název:

Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg·l^-1

Počáteční koncentrace chemické látky v médiu: mg·l^-1

Celkové množství uhlíku přidaného do baňky: mg C

TCO2: mg CO2

• 1. INOKULUM

Zdroj:

Provedená úprava:

Předběžná úprava, pokud byla provedena:

Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi: mg·l^-1

• 1. TVORBA OXIDU UHLIČITÉHO A ROZLOŽITELNOST

Metoda: Ba(OH)2 / NaOH/jiná

| Čas (dny) | CO2 uvolněný ve zkoušce (mg) | CO2 uvolněný ve slepé zkoušce (mg) | Celkové množství CO2 (průměr ve zkoušce minus průměr ve slepé zkoušce) (mg) | TCO2 kumulativní CO2TCO2×100 | | | | | | | | 1 | 2 | průměr | 3 | 4 | průměr | 1 | 2 | 1 | 2 | průměr | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | 0 | | | | | | | | | | | | n1 | | | | | | | | | | | | n2 | | | | | | | | | | | | n3 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 28 | | | | | | | | | | |

Poznámka: podobný formulář lze použít i pro referenční látku a pro kontroly toxicity.

• 1. ANALÝZA UHLÍKU (podle volby)

Analyzátor uhlíku:

Čas (dny)	Slepý pokus (mg·l-1)	Zkušební látka (mg·l-1)
0	Cb(0)	C0
28*	Cb(t)	Ct
* nebo na konci kultivace

odstraňený DOC v %=1-Ct-Cb(t)C0-Cb(0)×100

• 1. ABIOTICKÝ ROZKLAD (nepovinné)

abiotický rozklad v %=tvorba CO2 ve steril. podm. po 28 dnech v mgTCO2×100

IVD. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ C.4-D podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IVD.1 PODSTATA METODY

Odměřený objem inokulovaného minerálního média obsahující známou koncentraci zkušební chemické látky (100 mg zkušební látky na litr, dávající nejméně 50 – 100 mg TSK na litr), která je jediným zdrojem organického uhlíku, se míchá v uzavřené nádobě při konstantní teplotě (tolerance ±1 °C nebo menší) na dobu 28 dnů. Spotřeba kyslíku se stanoví buď měřením množství kyslíku (elektrolyticky produkovaného), který je potřebný k udržení konstantního objemu plynu v respirační nádobce, nebo ze změn objemu nebo tlaku (nebo obojího) v aparatuře. Uvolněný CO2 se jímá v roztoku hydroxidu draselného nebo v jiném vhodném absorbentu. Množství kyslíku, které je zkoušenou látkou spotřebováno (korigované na spotřebu kyslíku inokulem ve slepé zkoušce, která se provádí současně), se vyjádří v procentech TSK nebo CHSK. Popřípadě může být z doplňkové specifické chemické analýzy provedené na začátku a na konci kultivace vypočten primární biologický rozklad a z analýzy DOC úplný biologický rozklad.

IVD.2 POPIS METODY

IVD.2.1 Přístroje

• a) vhodný respirometr;

• b) regulátor teploty s přesností na ±1 °C nebo lepší;

• c) zařízení pro membránovou filtraci (nepovinné);

• d) analyzátor uhlíku (nepovinné).

IVD.2.2 Příprava minerálního média

Příprava zásobních roztoků je popsána v části I.6.2.

Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, přidá se po 1 ml roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.

IVD.2.3 Příprava a předběžná úprava inokula

Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod, z povrchových vod, z půd nebo z jejich směsi.

Viz I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5.

IVD.2.4 Příprava baněk

S použitím zásobních roztoků se připraví samostatné sady roztoků zkušební chemické látky a referenční chemické látky v minerálním médiu o koncentraci odpovídající obvykle 100 mg chemické látky na litr (dávající nejméně 50 – 100 mg TSK na litr).

TSK se vypočte z tvorby amoniových solí, pokud lze vyloučit nitrifikaci, v opačném případě by měl být výpočet založen na tvorbě dusičnanů (viz příloha II, bod 2).

Změří se pH a v případě potřeby se upraví na 7,4 ± 0,2.

Špatně rozpustné látky se přidají v pozdějším stádiu (viz dále).

Má-li se stanovit toxicita zkušební látky, připraví se další roztok v minerálním médiu, jenž obsahuje referenční i zkušební látku, a to ve stejných koncentracích jako v roztocích obsahujících jen jednu látku.

Požaduje-li se stanovení fyzikálně-chemické spotřeby kyslíku, připraví se roztok zkušební látky obvykle o koncentraci 100 mg TSK na litr sterilizovaný přídavkem vhodné toxické látky (viz I.6.6).

Připravené objemy roztoků zkušební a referenční chemické látky se rozdělí alespoň duplicitně do baněk. Do dalších baněk se přidá pouze minerální médium (pro kontrolu inokula) a podle potřeby směs roztoku zkušební a referenční chemické látky a sterilní roztok.

Je-li zkušební chemická látka špatně rozpustná, odváží se nebo odměří v tomto stádiu přímo do baněk, nebo se postupuje podle přílohy III. Do lahví pro absorpci CO2 se přidá hydroxid draselný, pelety hydroxidu sodného nebo jiný absorbent.

IVD.2.5 Počet baněk v typické zkoušce

Baňka 1 a 2: Zkušební suspense

Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem

Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu

Dále se doporučují se nebo se podle potřeby použijí:

Baňka 6: Sterilní kontrola

Baňka 7: Kontrola toxicity

Viz také bod I.6.7.

IVD.2.6 Provedení zkoušky

V baňkách se nechá ustavit požadovaná teplota a vybrané baňky se inokulují přidáním aktivovaného kalu nebo jiného zdroje inokula, aby nebyla koncentrace suspendovaných látek větší než 30 mg·l^-1. Zařízení se sestaví, spustí se míchačka, přezkouší se na vzduchotěsnost a zahájí se měření spotřeby kyslíku. Obvykle není třeba věnovat zkoušce žádnou zvláštní pozornost, kromě nezbytných odečtů a denní kontroly teploty a míchání.

Z pravidelných častých odečtů se podle postupu uvedeného výrobcem zařízení vypočte spotřeba kyslíku. Na konci inkubace, obvykle po 28 dnech, se změří pH v baňkách, a to zvláště tehdy, je-li spotřeba kyslíku malá nebo větší než TSKNH4 (platí pro látky obsahující dusík).

V případě potřeby se na začátku a na konci odebírá vzorek z respiračních nádobek pro stanovení DOC nebo pro specifickou analýzu (viz příloha II, bod 4). Při počátečním odběru z baňky se zajistí, aby byl znám objem zkušební suspense, která v baňce zůstala. Je-li kyslík spotřebováván látkami obsahujícími dusík, stanoví se přírůstek koncentrací dusičnanů a dusitanů za 28 dnů a vypočte se korekce na spotřebu kyslíku nitrifikací (příloha V).

IVD.3 DATA A ZPRÁVY

IVD.3.1 Zpracování výsledků

Spotřeba kyslíku (mg) zkušební látkou za danou dobu (korigovaná na spotřebu kyslíku inokulem za stejnou dobu ve slepé zkoušce) se podělí hmotností zkušební látky v baňce. Získá se tak hodnota BSK vyjádřená v mg kyslíku na mg zkušební látky:

BSK=spotř. O2 zk. chem. látkou v mg - spotř. O2 ve slep zkoušce v mghmotnost zkušební chem. látky v baňce v mg=mg O2 na mg zkušební chemické látky.

Biologický rozklad v procentech se vypočte buď z rovnice:

biolog. rozklad v % = % TSK = BSKmg O2 na mg chem. látkyTSKmg O2 na mg chem. látky×100

nebo z rovnice:

% COD=BSK mg O2 na mg chem. látkyCOD mg O2 na mg chem. látky×100.

Je třeba poznamenat, že tyto dvě metody nemusí poskytovat stejné hodnoty; přednost se dává první metodě.

Pro látky, jež obsahují dusík, se použije vhodná hodnota TSK (pro NH4 nebo NO3) podle toho, zda se očekává nitrifikace, či nikoli (příloha II, bod 2). Jestliže k nitrifikaci dochází, avšak není úplná, vypočte se korekce na spotřebu kyslíku při nitrifikaci ze změn koncentrace dusitanů a dusičnanů (příloha V).

V případě, že se provádí nepovinné stanovení organického uhlíku a/nebo specifické chemické látky, vypočte se stupeň rozkladu podle bodu I.7.

Všechny výsledky se zaznamenají do příslušného formuláře přehledu dat.

IVD.3.2 Platnost výsledků

Obvyklá spotřeba kyslíku inokulem je 20 – 30 mg O2 na litr a neměla by být větší než 60 mg·l^-1 za 28 dnů. Hodnoty větší než 60 mg·l^-1 vyžadují kritické přehodnocení výsledků a experimentální techniky. Je-li pH mimo rozpětí 6 – 8,5 a spotřeba kyslíku zkušební látkou je menší než 60 %, měla by být zkouška opakována s nižší koncentrací zkušební látky.

Viz také I.5.2.

IVD.3.3 Zprávy

Viz I.8.

IVD.4 PŘEHLED DAT

Dále je uveden příklad přehledu dat:

ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ

• 1. LABORATOŘ

• 1. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY

• 1. ZKUŠEBNÍ LÁTKA

Název:

Koncentrace zásobního roztoku: mg·l^-1

Počáteční koncentrace v médiu, C0: mg·l^-1

Objem zkušební baňky (V): ml

TSK nebo CHSK: v mg O2 na mg zkušební látky (NH4, NO3):

• 1. INOKULUM

Zdroj:

Provedená úprava:

Předběžná úprava, pokud byla provedena:

Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi: mg·l^-1

• 1. SPOTŘEBA KYSLÍKU: BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST

| | Čas (dny) | | | | | | | | | | | | | | 0 | | 7 | | 14 | | | 21 | | | 28 | | | | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | Spotřeba O2 (mg) zkušební látkou | 1 | | | | | | | | | | | | | | 2 | | | | | | | | | | | | | | | a, průměr | | | | | | | | | | | | | | | Spotřeba O2 (mg) ve slepé zkoušce | 3 | | | | | | | | | | | | | | 4 | | | | | | | | | | | | | | | b, průměr | | | | | | | | | | | | | | | Korigovaná BSK (mg) | a1-bm | | | | | | | | | | | | | | a2-bm | | | | | | | | | | | | | | | BSK na mg zkušební látky | a1-bC0V | | | | | | | | | | | | | | a2-bC0V | | | | | | | | | | | | | | | Rozklad v % BSKTSK×100 | D1 (a1) | | | | | | | | | | | | | | D2 (a2) | | | | | | | | | | | | | | | Průměr* | | | | | | | | | | | | | | | V = objem média ve zkušební baňce | | | | | | | | | | | | | |

^* Hodnoty D1 a D2 by neměly být průměrovány, je-li mezi nimi výrazný rozdíl.

Poznámka: Podobný formulář lze použít i pro referenční látku a pro kontroly toxicity.

• 1. KOREKCE NA NITRIFIKACI (viz příloha V)

Den	0	28	Rozdíl
i)	Koncentrace dusičnanů (mg N na litr)			(N)
ii)	Kyslíkový ekvivalent (4,57 × N × V) (mg)	—	—
iii)	Koncentrace dusitanů (mg N na litr)			(N)
iv)	Kyslíkový ekvivalent (3,43 × N × V) (mg)	—	—
ii + iv)	Celkový kyslíkový ekvivalent	—	—

• 1. ANALÝZA UHLÍKU (podle volby)

Analyzátor uhlíku:

Čas (dny)	Slepá zkouška (mg·l-1)	Zkušební látka(mg·l-1)
0	(Cbl(0))	(C0)
28*	(Cbl(t))	(Ct)
* nebo na konci inkubace

odstraněný DOC v %=1-Ct-Cbl(t)C0-Cbl(0)×100

• 1. SPECIFICKÁ ANALÝZA (nepovinné)

Sb = koncentrace ve fyzikálně-chemické kontrole (sterilní) po 28 dnech,

Sa = koncentrace v inokulované baňce po 28 dnech.

biologický rozklad v %=Sb-SaSb×100

• 1. ABIOTICKÝ ROZKLAD (nepovinné)

a = spotřeba kyslíku ve sterilních baňkách po 28 dnech v mg,

spotřeba kyslíku na mg zkušební chemické látky=aC0V

(viz oddíl 1 a 3)

abiotický rozklad v %=a×100C0V×TSK.

IVE. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ZKOUŠKY V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH – metoda C.4-E podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IVE.1. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Roztok zkušební látky v minerálním médiu, obvykle o koncentraci 2 až 5 mg·l^-1, se inokuluje malým množstvím mikroorganismů ze směsné kultury a udržuje se ve zcela naplněných uzavřených lahvičkách, v temnu a při konstantní teplotě. Rozklad se sleduje po dobu 28 dnů prostřednictvím analýzy rozpuštěného kyslíku. Množství spotřebovaného kyslíku po korekci na souběžnou slepou zkoušku s inokulem se vyjádří jako TSK nebo CHSK.

IVE.2 POPIS METODY

IVE.2.1 Přístroje a pomůcky

• a) Lahve pro analýzu BSK se skleněnými zátkami, např. na 250 − 300 ml.

• b) Vodní lázeň nebo inkubátor pro udržování lahviček při konstantní teplotě (tolerance ±1 °C nebo menší) v temnu.

• c) Velké skleněné lahve na 2 − 5 l pro přípravu média a pro naplnění lahviček pro analýzu BSK.

• d) Kyslíková elektroda a oxymetr nebo vybavení a činidla pro Winklerovu titrační metodu.

IVE.2.2 Příprava minerálního média

Příprava zásobních roztoků je popsána v části I.6.2.

Smísí se po 1 ml roztoků a) až d) a doplní se vodou na 1 litr.

IVE.2.3 Příprava inokula

Inokulum se obvykle získává z výstupu z druhého stupně čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky zpracovávající převážně domovní odpadní vody. Alternativním zdrojem inokula může být povrchová voda. Obvykle se použije jedna kapka (0,05 ml) až 5 ml filtrátu na litr média; k nalezení optimálního objemu dané odpadní vody může být nezbytné provést pokusy (viz I.6.4.2 a I.6.5).

IVE.2.4 Příprava lahviček

Minerální médium se alespoň 20 min silně provzdušňuje. Všechny série zkoušek se provedou s minerálním médiem ze stejné dávky. Obecně je médium připraveno k použití po 20 h stání při zkušební teplotě. Pro kontrolu se stanoví obsah kyslíku v médiu; jeho obsah by měl být asi 9 mg·l^-1 při 20 °C. Všechny operace přenosu média nasyceného vzduchem a jeho plnění se provedou tak, aby nevznikaly bublinky, např. pomocí nasávaček.

Připravují se shodné skupiny lahviček pro analýzu BSK pro stanovení se zkušební látkou a referenční látkou v souběžných sériích experimentů. Připraví se dostatečný počet lahviček, včetně slepých pokusů, tak, aby v každém zvoleném časovém intervalu, např. 0, 7, 14, 21 a 28 dnů, bylo možné provést alespoň dvě měření spotřeby kyslíku. K tomu, aby bylo možné rozpoznat 10denní období rozkladu, může být potřeba více lahviček.

Velké lahve se přibližně do jedné třetiny naplní provzdušněným médiem. Poté se zvlášť do jednotlivých velkých lahví přidá dostatečný objem zásobního roztoku zkušební látky a referenční látky, a to obvykle tak, aby nebyla konečná koncentrace chemických látek větší než 10 mg·l^-1. Ke slepému pokusu v další velké lahvi se nepřidávají žádné chemické látky.

S cílem zajistit, aby aktivita inokula nebyla omezená, nesmí koncentrace kyslíku v lahvičkách pro analýzu BSK klesnout pod 0,5 mg·l^-1. Toto omezuje koncentraci zkušební látky na 2 mg·l^-1. Pro látky, které se špatně rozkládají, a pro látky s nízkou hodnotou TSK lze použít koncentraci 5 - 10 mg·l^-1. V některých případech se doporučuje provést souběžné série měření při dvou různých koncentracích zkušební látky, např. při 2 a 5 mg·l^-1. Obvykle se TSK počítá na základě tvorby amonných solí, ale v případech, kdy se předpokládá nitrifikace nebo kdy dochází k nitrifikaci, se TSK vypočte na základě tvorby dusičnanů (TSKNO3, viz příloha II, bod 2). V případech, kdy nitrifikace není úplná, se provede korekce na změny analyticky stanovených koncentrací dusitanů a dusičnanů (viz příloha V).

Má-li být vyšetřena toxicita zkušební látky (např. v případě dříve zjištěné nízké biologické rozložitelnosti), je nezbytné nasadit další sérii lahviček.

Připraví se další velká láhev s provzdušněným minerálním médiem (naplněná asi do jedné třetiny objemu), do které se přidá zkušební a referenční chemická látka o konečné koncentraci obvykle stejné jako v případě ostatních velkých lahví.

Roztoky ve velkých lahvích se inokulují výstupem z druhého stupně čistírny odpadních vod (jedna kapka nebo 0,05 až 5 ml·l^-1) nebo z jiného zdroje inokula, jako je např. říční voda (viz I.6.4.2). Nakonec se lahve doplní na objem provzdušněným minerálním médiem za použití hadičky, která sahá na dno, aby se dosáhlo dostatečného promíchání.

IVE.2.5 Počet lahviček v typické zkoušce

V typické zkoušce se použijí následující lahvičky:

nejméně 10 lahviček se zkušební látkou a inokulem (zkušební suspense),

nejméně 10 lahviček pouze s inokulem (slepá zkouška s inokulem),

nejméně 10 lahviček s referenční látkou a inokulem (kontrolní zkouška postupu),

a podle potřeby 6 lahviček se zkoušenou látkou, referenční látkou a inokulem (kontrola toxicity). Pro rozpoznání 10denního období rozkladu je však potřebný dvojnásobný počet lahviček.

IVE.2.6 Provedení zkoušky

Všechny připravené roztoky se ihned po přípravě rozdělí do příslušné skupiny lahviček pro analýzu BSK, a to pomocí hadičky zavedené do spodní čtvrtiny velké lahve (nikoliv ke dnu) tak, aby se všechny lahvičky pro analýzu BSK zcela naplnily. Jemně se poklepe, aby se odstranily bublinky. V lahvičkách se Winklerovou metodou nebo pomocí oxymetru ihned stanoví obsah rozpuštěného kyslíku k počátku zkoušky (k času nula). Obsah lahviček lze konzervovat pro pozdější analýzu přídavkem síranu manganatého a hydroxidu sodného (prvním Winklerovým činidlem). Před provedením zbývajících kroků Winklerovy metody se pečlivě uzavřené lahvičky obsahující kyslík vázaný ve formě hydratovaného oxidu manganitého skladují v temnu nejdéle 24 h při teplotě 10 − 20 °C. Zbývající souběžně připravené lahvičky se uzavřou tak, aby v nich nezůstaly bublinky vzduchu, a inkubují se v temnu při 20 °C. Každá série musí být doprovázena úplnou sérií slepého pokusu s inokulovaným médiem. Ve všech sériích se během 28 dnů inkubace v pravidelných intervalech (nejméně jednou týdně) stanoví alespoň ve dvou lahvičkách obsah rozpuštěného kyslíku.

Týdenní vzorky umožní stanovení rozkladu v procentech ve 14denním období rozkladu, zatímco vzorky odebírané každé 3 − 4 dny umožní rozpoznat 10denní období rozkladu, což vyžaduje dvojnásobný počet lahviček.

U látek obsahujících dusík se provede korekce na spotřebu kyslíku při nitrifikaci. K tomuto účelu se stanoví koncentrace rozpuštěného kyslíku oxymetrem a poté se z lahvičky pro analýzu BSK odebere vzorek pro stanovení dusitanů a dusičnanů. Z přírůstku koncentrace dusitanů a dusičnanů se vypočte množství spotřebovaného kyslíku (viz příloha V).

IVE.3 DATA A ZPRÁVY

IVE.3.1 Zpracování výsledků

Nejprve se vypočte BSK, ke které došlo po každé časové periodě, a to odečtením spotřeby kyslíku (v mg O2 na litr) ve slepém pokusu s inokulem od spotřeby, zkušební chemickou látkou. Takto korigovaná spotřeba se vydělí koncentrací zkušební látky (mg·l^-1) a získá se specifická BSK v mg kyslíku na mg zkušební látky. Biologická rozložitelnost v procentech se vypočte jako podíl specifické BSK a specifické TSK (vypočtené podle přílohy II, bodu 2) nebo CHSK (stanovené analyticky, viz příloha II, bod 3), tedy:

BSK=spotř. O2 zk. chem. látkou v mg - spotř. O2 ve slep. pokusu v mghmotnost zkušební chem. látky v baňce v mg=mg O2 na mg zkušební chemické látky.

rozklad v %=BSK mg O2 na mg zkušeb. chem. látkyTSK mg O2 na mg zkušeb. chem. látky×100

nebo

rozklad v %=BSK mg O2 na mg zkušeb. chem. látkyCOD mg O2 na mg zkušeb. chem. látky×100

Je třeba poznamenat, že tyto dvě metody nemusí poskytovat stejné hodnoty; přednost se dává první metodě.

Pro látky, jež obsahují dusík, se použije odpovídající hodnota TSK (pro NH4 nebo NO3) podle toho, zda se očekává nitrifikace, či nikoli (příloha II, bod 2). Jestliže k nitrifikaci dochází, avšak není úplná, vypočte se korekce na spotřebu kyslíku při nitrifikaci ze změn koncentrace dusitanů a dusičnanů (příloha V).

IVE.3.2 Platnost výsledků

Spotřeba kyslíku ve slepém pokusu s inokulem by neměla být po 28 dnech vyšší než 1,5 mg·l^-1. Vyšší hodnoty vyžadují přešetření experimentální techniky. Zbytková koncentrace kyslíku ve zkušebních lahvičkách by neměla nikdy klesnout pod 0,5 mg·l^-1. Takto nízké úrovně kyslíku jsou platné pouze tehdy, lze-li použitou metodou stanovení rozpuštěného kyslíku tak nízké úrovně přesně změřit.

Viz také I.5.2.

IVE.3.3 Zprávy

Viz I.8.

IVE.4 PŘEHLED DAT

Dále je uveden příklad přehledu dat:

ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH

• 1. LABORATOŘ

• 1. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY

• 1. ZKUŠEBNÍ LÁTKA

Název:

Koncentrace zásobního roztoku: mg·l^-1

Počáteční koncentrace v lahvičce: mg·l^-1

TSK nebo CHSK: v mg O2 na mg zkušební látky

• 1. INOKULUM

Zdroj:

Provedená úprava:

Předběžná úprava, pokud byla provedena:

Koncentrace v reakční směsi: mg·l^-1

• 1. STANOVENÍ ROZPUŠTĚNÉHO KYSLÍKU:

Metoda: Winklerova metoda / oxymetr

Analýzy lahviček

| Doba kultivace (d) | Rozpuštěný kyslík (mg·l-1) | | | | | | | 0 | n1 | n2 | | | | | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | Slepá zkouška (bez chemické látky) | 1 | C1 | | | | | | 2 | C2 | | | | | | | Průměr | mb=C1+C22 | | | | | | | Zkušební chemická látka | 1 | a1 | | | | | | 2 | a2 | | | | | | | Průměr | mt=a1+a22 | | | | | |

Poznámka: podobný formulář lze použít i pro referenční látku a pro kontroly toxicity.

• 1. KOREKCE NA NITRIFIKACI (viz příloha V)

Doba kultivace	0	n1	n2	n3
i)	Koncentrace dusičnanů (mg N na litr)
ii)	Změna koncentrace dusičnanů (mg N na litr)	—
iii)	Kyslíkový ekvivalent (mg·l-1)	—
iv)	Koncentrace dusitanů (mg N na litr)
v)	Změna koncentrace dusitanů (mg N na litr)	—
vi)	Kyslíkový ekvivalent (mg·l-1)	—
iii + vi)	Celkový kyslíkový ekvivalent (mg·l-1)	—

• 1. ÚBYTEK ROZPUŠTĚNÉHO KYSLÍKU: ROZKLAD V PROCENTECH

| | Úbytek po n dnech (mg·l-1) | | | | | n1 | n2 | n3 | | | | --- | --- | --- | --- | --- | | LAHVIČKA 1: mt0-mtx-mb0-mbx | | | | | | LAHVIČKA 2: mt0-mtx-mb0-mbx | | | | | | LAHVIČKA 1: | | | | | | % D1=mt0-mtx-mb0-mbx×100konc. zkuš. chem. látky × TSK | | | | | | LAHVIČKA 2: | | | | | | % D2=mt0-mtx-mb0-mbx×100konc. zkuš. chem. látky × TSK | | | | | | průměr*% D=D1-D22 | | | | |

^* Hodnoty nelze průměrovat, je-li mezi nimi výrazný rozdíl.

mt0 = hodnota pro zkušební lahvičku v čase 0

mtx = hodnota pro zkušební lahvičku v čase x

mb0 = hodnota pro slepý pokus v čase 0

mbx = hodnota pro slepý pokus v čase x

Použijí se rovněž korekce na nitrifikaci z bodu iii + vi v oddílu 6.

• 1. ÚBYTEK ROZPUŠTĚNÉHO KYSLÍKU VE SLEPÉM POKUSU

Spotřeba kyslíku ve slepém pokusu je mb0-mb28 v mg·l^-1. Tato spotřeba je důležitá pro platnost zkoušky. Měla by být menší než 1,5 mg·l^-1.

IVF. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ZKOUŠKY MITI – metoda C.4-F podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IVF.1 PODSTATA METODY

Měření spotřeby kyslíku v míchaném roztoku nebo suspensi zkušební chemické látky v minerálním médiu inokulovaném speciální kulturou neadaptovaných mikroorganismů se provádí automaticky po dobu 28 dnů za tmy v uzavřeném respirometru při 25 ± 1 °C. Uvolňovaný oxid uhličitý se jímá v hydroxidu sodném. Biologická rozložitelnost se vyjádří jako spotřeba kyslíku (korigovaná na slepý pokus) vyjádřená v procentech teoretické spotřeby kyslíku (TSK). Primární biologická rozložitelnost vyjádřená v procentech se rovněž vypočte z doplňkové specifické chemické analýzy provedené na začátku a na konci kultivace, popřípadě z analýzy DOC.

IVF.2 POPIS METODY

IVF.2.1 Přístroje a pomůcky

• a) automatický elektrolytický měřič BSK nebo respirometr standardně vybavený 6 baňkami na 300 ml opatřenými uzávěry obsahujícími absorbent CO2;

• b) místnost s konstantní teplotou nebo vodní lázeň nastavená na 25 ± 1 °C;

• c) zařízení pro membránovou filtraci (nepovinné);

• d) analyzátor uhlíku (nepovinné).

IVF.2.2 Příprava minerálního média

a)	Dihydrogenfosforečnan draselný, KH2PO4	8,50
	Hydrogenfosforečnan didraselný, K2HPO4	21,75 g
	Hydrogenfosforečnan disodný dodekahydrát, Na2HPO4·12H2O	44,60 g
	Chlorid amonný, NH4Cl	1,70 g
	Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. pH roztoku musí být 7,2.
b)	Síran hořečnatý heptahydrát, MgSO4·7H2O	22,50 g
---	---	---
	Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.
c)	Chlorid vápenatý bezvodý, CaCl2	27,50 g
---	---	---
	Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.
d)	Chlorid železitý hexahydrát, FeCl3·6H2O	0,25 g
---	---	---
	Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

Spojí se po 3 ml roztoků a), b), c), a d) a doplní se na 1 litr.

IVF.2.3 Příprava inokula

Odeberou se čerstvé vzorky nejméně z deseti lokalit, kde se používají a vypouštějí různé chemické látky. Z míst, jako jsou čistírny městských a průmyslových odpadních vod, řeky, jezera a moře se odeberou litrové vzorky kalu, povrchových půd, vody atd., které se pečlivě smíchají. Po odstranění vyplavených látek a ustálení se pH supernatantu upraví na 7 ± 1 hydroxidem sodným nebo kyselinou fosforečnou.

Vhodným objemem filtrovaného supernatantu se naplní nádoba na aktivaci kalu a kapalina se 23½ h provzdušňuje. Třicet minut po ukončení provzdušňování se odlije přibližně jedna třetina celkového objemu supernatantu a k usazenému materiálu se přidá stejný objem roztoku (pH 7), který obsahuje vždy po 0,1 % glukosy, peptonu a dihydrogenfosforečnanu draselného, a obnoví se provzdušňování. Tento postup se opakuje jednou denně. Kalová jednotka musí být provozovaná podle zásad správné laboratorní praxe: odtok má být čirý, teplota má být udržována při 25 ± 2°C, pH má být 7 ± 1, kal se má dobře usazovat, provzdušňování musí být za všech okolností dostatečné, mají být přítomni prvoci a aktivita kalu se má kontrolovat pomocí referenční látky nejméně každé tři měsíce. Inokulum se nepoužívá dříve než po 1 měsíci kultivace, ale ne později než po čtyřech měsících. Proto se v pravidelných intervalech jednou za tři měsíce odebírají vzorky z 10 míst.

K udržení stejné aktivity čerstvého a starého kalu se filtrovaný supernatant aktivovaného použitého kalu mísí se stejným objemem filtrovaného supernatantu čerstvě odebraného kalu pocházejícího z deseti zdrojů a směs se kultivuje podle výše uvedeného postupu. Kal se použije jako inokulum až 18 – 24 h po uvedeném zpracování.

IVF.2.4 Příprava baněk

Připraví se následujících 6 baněk:

Baňka č. 1: zkušební chemická látka v ředicí vodě, 100 mg·l^-1

Baňky č. 2, 3, 4: zkušební chemická látka v minerálním médiu, 100 mg·l^-1

Baňka č. 5: referenční látka (např. anilin) v minerálním médiu, 100 mg·l^-1

Baňka č. 6: pouze minerální médium

Špatně rozpustné chemické látky se odváží nebo odměří, nebo se zpracují podle přílohy III, s výjimkou těch, u nichž nesmějí být použita rozpouštědla ani emulgátory. Do speciálních uzávěrů všech lahví se přidá absorbent oxidu uhličitého. pH v baňkách č. 2, 3 a 4 se upraví na 7,0.

IVF.2.5 Provedení zkoušky

Baňky č. 2, 3, 4 (zkušební suspense), č. 5 (kontrola aktivity), č. 6 (slepý pokus s inokulem) se inokulují malým množstvím inokula tak, aby byla výsledná koncentrace kalu 30 mg·l^-1. Do lahve č. 1 se inokulum nepřidává, slouží jako abiotická kontrola. Zařízení se sestaví, přezkouší se na vzduchotěsnost, spustí se míchačka a v temnu se zahájí měření spotřeby kyslíku. Denně se kontroluje teplota, míchání, coulometrický zapisovač spotřeby kyslíku a zaznamenají se všechny změny barvy obsahu baněk. Spotřeba kyslíku pro 6 baněk se odečítá přímo, např. šestikanálovým zapisovačem, čímž se získá křivka BSK. Na konci kultivace, obvykle po 28 dnech, se změří pH v baňkách a stanoví se zbytková koncentrace zkušební chemické látky a jejích produktů rozkladu a v případě zkoušení látek rozpustných ve vodě také koncentrace DOC (postup podle přílohy II, bodu 4). Zvláštní pozornost je třeba věnovat těkavým látkám. Pokud se předpokládá nitrifikace, stanoví se podle možnosti koncentrace dusičnanů a dusitanů.

IVF.3 DATA A ZPRÁVY

IVF.3.1 Zpracování výsledků

Spotřeba kyslíku (mg) zkušební látkou za danou dobu (korigovaná na spotřebu inokulem za stejnou dobu ve slepém pokusu) se podělí hmotností použité zkušební látky. Získá se tak hodnota BSK vyjádřená v mg kyslíku na mg zkušební látky:

BSK=spotř. O2 zk. chem. látkou v mg - spotř. O2 ve slepé zkoušce v mghmotnost zkušební chem. látky v baňce v mg=mg O2 na mg zkušební chemické látky.

Biologický rozklad v procentech se vypočte buď z rovnice:

biolog. rozklad v % = % TSK=BSK mg O2 na mg chem. látkyTSK mg O2 na mg chem. látky×100.

Pro směsi se TSK vypočte z elementární analýzy, tak jako pro jednoduché sloučeniny. Použije se odpovídající hodnota TSK (TSKNH4 nebo TSKNO3) podle toho, zda se očekává nitrifikace, či nikoli (příloha II, bod 2). Jestliže k nitrifikaci dochází, avšak není úplná, vypočte se korekce na spotřebu kyslíku při nitrifikaci ze změn koncentrace dusitanů a dusičnanů (příloha V).

Vypočte se primární biologický rozklad v procentech z úbytku specifické (výchozí) chemické látky (viz I.7.2):

Dt=Sb-SaSb×100

Zjistí-li se při měření fyzikálně-chemického úbytku ztráta zkušební chemické látky v baňce č. 1, zaznamená se to a jako koncentrace zkušební látky (Sb) po 28 dnech se pro výpočet biologické rozložitelnosti dosadí tato koncentrace.

Stanovuje-li se koncentrace DOC (nepovinné), vypočte se konečná hodnota biologického rozkladu v procentech podle vztahu:

Dt=1-Ct-CbtC0-Cb0×100

jak je uvedeno v bodě I.7.1. Zjistí-li se při měření fyzikálně-chemického úbytku ztráta DOC v baňce č. 1, použije se při výpočtu biologického rozkladu v procentech tato koncentrace DOC.

Všechny výsledky se zaznamenají do přehledu dat.

IVF.3.2 Platnost výsledků

Obvyklá spotřeba kyslíku inokulem je 20 – 30 mg O2 na litr a neměla by být větší než 60 mg·l^-1 za 28 dnů. Hodnoty větší než 60 mg·l^-1 vyžadují kritické přehodnocení výsledků a experimentální techniky. Je-li pH mimo rozpětí 6 – 8,5 a spotřeba kyslíku zkušební látkou je menší než 60 %, měla by být zkouška opakována s nižší koncentrací zkušební látky.

Viz také I.5.2.

V případě, že rozklad anilinu vypočtený ze spotřeby kyslíku nepřekročí po 7 dnech 40 % a po 14 dnech 65 %, považuje se zkouška za neplatnou.

IVF.3.3 Zprávy

Viz I.8.

IVF.4 PŘEHLED DAT

Dále je uveden příklad přehledu dat:

ZKOUŠKA MITI (I)

• 1. LABORATOŘ

• 1. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY

• 1. ZKUŠEBNÍ LÁTKA

Název:

Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg·l^-1

Počáteční koncentrace chemické látky v médiu, C0: mg·l^-1

Objem reakční směsi, V: ml

TSK: mg O2 na litr

• 1. INOKULUM

Místa odběru kalu:

1)...				6)...
2)...				7)...
3)...				8)...
4)...				9)...
5)...				10)...

Koncentrace suspendovaných látek v aktivovaném kalu po aklimatizaci se syntetickými splašky mg·l^-1.

Objem aktivovaného kalu v litru konečného média = ... ml

Koncentrace kalu v konečném médiu = ... mg·l^-1

• 1. SPOTŘEBA KYSLÍKU: BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST

Typ použitého respirometru:

| | Čas (dny) | | | | | | | | 0 | 7 | 14 | 21 | 28 | | | | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | Spotřeba O2 (mg) zkušební látkou | a1 | | | | | | | | a2 | | | | | | | | | a3 | | | | | | | | | Spotřeba O2 (mg) ve slepé zkoušce | b | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Korigovaná spotřeba O2(mg) | a1-b a2-b a3-b | | | | | | | | | | | | | | | | | BSK na mg zkušební látky | a-bC0V | Baňka 1 | | | | | | | | Baňka 2 | | | | | | | | | Baňka 3 | | | | | | | | Rozklad v % BSKTSK×100 | | 1 | | | | | | | | 2 | | | | | | | | | 3 | | | | | | | | | Průměr* | | | | | | |

Poznámka: podobný formulář lze použít i pro referenční látku.

^* Hodnoty nelze průměrovat, je-li mezi nimi výrazný rozdíl.

• 1. ANALÝZA UHLÍKU (podle volby)

Analyzátor uhlíku:

| Baňka | DOC | úbytek DOC v % | Průměr | | | | | Naměřená hodnota | Korigovaná hodnota | | | | | | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | Voda + zkušební látka | a | | | | — | — | | Kal + zkušební látka | b1 | | b1-c | | | | | Kal + zkušební látka | b2 | | b2-c | | | | | Kal + zkušební látka | b3 | | b3-c | | | | | Kontrolní slepá zkouška | c | | — | | — | — |

odstraněný DOC v %=a-b-ca×100

• 1. DATA ZE SPECIFICKÉ CHEMICKÉ ANALÝZY

	Zbytkové množství zkušební chemické látky na konci zkoušky	Rozklad v %
Slepá zkouška s vodou	Sb
Inokulované médium	Sa1
Sa2
Sa3

rozklad v %=Sb-SaSb×100

Rozklad v % se vypočte pro baňky a1, a2, a3.

• 1. POZNÁMKY

Připojí se křivka závislosti BSK na čase, je-li k dispozici.

PŘÍLOHA I

ZKRATKY A DEFINICE

DO: Rozpuštěný kyslík (dissolved oxygen) (mg·l^-1) je koncentrace kyslíku, který je rozpuštěn ve vodném vzorku.

BSK: Biochemická spotřeba kyslíku (biochemical oxygen demand, BOD) (g) je množství kyslíku, jež je v průběhu metabolizace zkušební látky spotřebováno mikroorganismy; vyjadřuje se také jako spotřeba kyslíku v gramech na gram zkušební látky. (Viz metoda C.5).

CHSK: Chemická spotřeba kyslíku (chemical oxygen demand, COD) (g) je množství kyslíku, jež je spotřebováno v průběhu oxidace zkušební látky horkým kyselým dichromanem; je měřítkem množství přítomných oxidovatelných látek; vyjadřuje se také v gramech kyslíku spotřebovaného na gram zkušební látky. (Viz metoda C.6).

DOC: Rozpuštěný organický uhlík (dissolved organic carbon) je celkový organický uhlík, který je přítomný v roztoku nebo projde přes filtr o velikosti pórů 0,45 μm nebo zůstane v supernatantu po odstřeďování po dobu 15 min při zrychlení 40 000 m·s^-2 (asi 4 000 g).

TSK: Teoretická spotřeba kyslíku (theoretical oxygen demand, ThOD) (mg) je celkové množství kyslíku nezbytné pro úplnou oxidaci chemické látky; vypočte se z molekulového vzorce látky (viz příloha II, bod 2) a vyjadřuje se také jako množství kyslíku v mg nezbytné na mg zkušební látky.

TCO2: Teoretický oxid uhličitý (theoretical carbon dioxide, ThCO2) je množství oxidu uhličitého, které by mělo vzniknout ze známého nebo změřeného obsahu uhlíku ve zkušební látce za předpokladu její úplné mineralizace; vyjadřuje se v mg oxidu uhličitého uvolněného z 1 mg zkušební látky.

TOC: Celkový organický uhlík (total organic carbon) ve vzorku je součtem organického uhlíku v roztoku a v suspensi.

IC: Anorganický uhlík (inorganic carbon).

TC: Celkový uhlík (total carbon) je součtem organického a anorganického uhlíku ve vzorku.

Primární biologický rozklad:

jsou změny chemické struktury látky způsobené biologickým působením, vedoucí ke ztrátě specifických vlastnosti látky.

Úplný biologický rozklad (aerobní):

je stupeň rozkladu látky dosažený po jejím úplném zužitkování mikroorganismy, vedoucí k produkci oxidu uhličitého, vody, minerálních solí a nové mikrobiální buněčné hmoty (biomasy).

Snadno biologicky rozložitelná:

je dohodnutá klasifikace chemických látek, které prošly screeningovými zkouškami úplné biologické rozložitelnosti; tyto zkoušky jsou tak přísné, že lze předpokládat, že se látky budou ve vodném prostředí za aerobních podmínek rychle a úplně biologicky rozkládat.

Biologicky rozložitelná:

je klasifikace chemických látek, pro něž existuje nepochybný důkaz o jejich biologické rozložitelnosti (primární nebo konečné) v kterékoli uznávané zkoušce biologické rozložitelnosti.

Odstranitelnost:

je náklonnost látek k jejich odstranění při biologickém čištění odpadních vod, aniž by byl nepříznivě ovlivněn normální průběh čisticích pochodů. Látky snadno biologicky rozložitelné jsou obecně odstranitelné, avšak ne všechny rozložitelné látky jsou odstranitelné. Mohou zde působit také abiotické procesy.

Fáze iniciace:

je doba, ve zkoušce na úbytek rozpuštěného organického uhlíku, od inokulace do dosažení alespoň 10% biologického rozkladu. Fáze iniciace je často různě dlouhá a špatně reprodukovatelná.

Doba rozkladu:

je doba od konce fáze zdržení do dosažení 90 % maximální dosažitelné úrovně rozkladu.

10denní období rozkladu:

je 10 dnů, které následují bezprostředně po dosažení 10% rozkladu.

PŘÍLOHA II

VÝPOČET A STANOVENÍ NĚKTERÝCH SOUHRNNÝCH PARAMETRŮ

V závislosti na zvolené zkušební metodě se vyžaduje určení některých souhrnných parametrů. V následujícím oddíle je popsán výpočet těchto hodnot. Využití těchto parametrů je popsáno u jednotlivých metod.

• 1. Obsah uhlíku

Obsah uhlíku se počítá ze známého elementárního složení nebo se stanoví analýzou prvků ve zkušební látce.

• 1. Teoretická spotřeba kyslíku (TSK)

Teoretickou spotřebu kyslíku (TSK) lze vypočítat ze znalosti elementárního složení nebo z výsledků analýzy prvků. Pro látku

CcHhClclNnNanaOoPpSs

bez nitrifikace,

• TSKNH4=162c+12h-cl-3n+3s+52p+12na-oM v mg/mg

nebo s nitrifikací,

TSKNH4=162c+12h-cl+52n+3s+52p+12na-oM

• 1. Chemická spotřeba kyslíku (CHSK)

Chemická spotřeba kyslíku (CHSK) se stanoví metodou C.6.

• 1. Rozpuštěný organický uhlík (DOC)

Rozpuštěným organickým uhlíkem je podle definice organický uhlík přítomný ve vodném roztoku chemické látky nebo směsi, který projde přes filtr o velikosti pórů 0,45 μm.

Odeberou se vzorky ze zkušebních nádob a ihned se filtrují pomocí filtračního zařízení s vhodným membránovým filtrem. Prvních 20 ml (toto množství může být při použití malých filtrů zmenšeno) se odstraní. 10 – 20 ml, nebo v případě nástřiku menší objem (objem závisí na množství potřebném pro analýzu), se uschová pro analýzu uhlíku. Koncentrace DOC se stanoví pomocí analyzátoru organického uhlíku, který umožňuje přesné stanovení koncentrace uhlíku, která je menší nebo rovna 10 % počáteční koncentrace DOC použité ve zkoušce.

Zfiltrované vzorky, které není možné analyzovat ve stejný pracovní den, se uchovávají v ledničce 48 h při 2 – 4 °C nebo delší dobu při teplotě nižší než –18 °C.

Poznámky:

Membránové filtry jsou často impregnovány povrchově aktivními látkami za účelem jejich hydrofilizace. Filtr tedy může obsahovat až několik mg rozpustného organického uhlíku, který může ovlivnit stanovení biologické rozložitelnosti.

Povrchově aktivní látky a jiné rozpustné organické látky se z filtrů odstraňují vyvařením třikrát jednu hodinu v deionizované vodě. Filtry lze poté skladovat 1 týden ve vodě. Při použití filtračních patron pro jedno použití se musí u každé šarže ověřit, zda neobsahuje rozpustný organický uhlík.

V závislosti na typu membránového filtru může docházet k adsorpci zkušební látky na filtru. Doporučuje se ověřit, zda k adsorpci zkušební chemické látky na filtru nedochází.

Místo filtrace lze použít k rozlišení TOC od DOC odstřeďování při 40 000 m·s^-1 (4 000 g) po dobu 15 min. Tato metoda však není spolehlivá při počáteční koncentraci DOC < 10 mg·l^-1, protože buď nelze odstranit všechny bakterie, nebo se zpětně rozpouští uhlík, který je součástí bakteriální plasmy.

LITERATURA

— Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 12th ed., Am. Publ. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 1965, p 65.

— Wagner, R. von Wasser, 1976, vol 46, 139.

— DIN-Entwurf 38 409, Teil 41 – Deutsches Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasserund Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- und Stoffkenngrössen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschuss Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e.V.

— Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol 13(1), 169.

PŘÍLOHA III

VYHODNOCENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI ŠPATNĚ ROZPUSTNÝCH LÁTEK

Při zkouškách biologické rozložitelnosti špatně rozpustných látek si zaslouží zvláštní pozornost následující aspekty.

Zatímco odběr vzorků homogenních kapalin je problémem jen zřídka, u tuhých látek se doporučuje provést homogenizaci vhodnými prostředky, aby v důsledku nehomogenity nedošlo k chybám. Zvláštní pozornost musí být věnována odběrům reprezentativních vzorků o několika miligramech ze směsí látek, které obsahují velké množství nečistot.

V průběhu zkoušek lze použít různé způsoby míchání. Je třeba věnovat pozornost tomu, aby míchání bylo přiměřené právě pro udržení látky v disperzi a nedocházelo k přehřívání, nadměrnému pěnění a nadměrným třecím silám.

Může se použít emulgátor vytvářející stabilní disperzi chemické látky. Nesmí být toxický pro bakterie a nesmí se biologicky rozkládat nebo pěnit za zkušebních podmínek.

Stejná kritéria jako pro emulgátory platí i pro rozpouštědla.

U tuhých zkušebních látek se nedoporučuje používat tuhé nosiče, mohou však být vhodné v případě olejovitých látek.

Použijí-li se pomocné látky, jako jsou emulgátory, rozpouštědla a nosiče, musí být proveden slepý pokus s pomocnou látkou.

Pro studium biologické rozložitelnosti špatně rozpustných látek lze použít kteroukoli ze tří respirometrických zkoušek (zkouška na úbytek CO2, na BSK, zkouška MITI).

LITERATURA

— de Morsier, A. et al. Biodegradation tests for poorly soluble compounds. Chemosphere, 1987, 16, 833.

— Gerike, P. The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, 13, 169.

PŘÍLOHA IV

VYHODNOCENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI LÁTEK POTENCIÁLNĚ TOXICKÝCH PRO INOKULUM

Je-li chemická látka podrobena zkoušení snadné biologické rozložitelnosti a jeví se jako biologicky nerozložitelná, doporučuje se postupovat při požadavku rozlišit inhibiční působení od odolnosti látky vůči rozkladu následujícím způsobem (Reynolds et al., 1987).

Ve zkouškách toxicity i ve zkouškách biologické rozložitelnosti se použijí podobná nebo stejná inokula.

K posouzení toxicity chemických látek zkoušených ve zkouškách snadné biologické rozložitelnosti se doporučuje použít zkoušku inhibice dýchání aktivovaného kalu (směrnice 88/302/EHS), stanovení BSK nebo metodu inhibice růstu nebo kombinaci těchto metod.

Nemá-li dojít k inhibici z důvodu toxicity, měla by být koncentrace zkušební látky použitá ve zkouškách snadné biologické rozložitelnosti menší než 1/10 hodnoty EC50 (nebo menší než EC20) zjištěné zkouškou toxicity. Látky s EC50 > 300 mg·l^-1 pravděpodobně nemají při zkouškách snadné biologické rozložitelnosti toxické účinky.

Hodnoty EC50 < 20 mg·l^-1 mohou při následném zkoušení působit potíže. Měly by být použity nízké koncentrace, což vyžaduje použít přísné a citlivé zkoušky v uzavřených lahvičkách nebo materiál značený ^14C. Použití vyšších koncentrací zkušební látky může být popřípadě umožněno nasazením aklimatizovaného inokula. V tomto případě se však ztrácí specifické kritérium zkoušky snadné biologické rozložitelnosti.

LITERATURA

Reynolds, L. et al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere, 1987, 16, 2259.

PŘÍLOHA V

KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI

Chyby způsobené tím, že při stanovení spotřeby kyslíku ve zkouškách látek, které neobsahují dusík, není vzata v úvahu nitrifikace, nejsou významné (nejsou větší než 5 %), i když je oxidace amoniakálního dusíku ve zkušebních nádobách a ve slepém pokusu nepravidelná. U zkušebních látek obsahujících dusík může dojít ke značným chybám.

Dochází-li k nitrifikaci, avšak nikoli úplné, musí být spotřeba kyslíku reakční směsí korigována na množství kyslíku spotřebovaného na oxidaci amoniaku a amonných iontů na dusitany a dusičnany, jsou-li změny koncentrace dusitanů a dusičnanů během kultivace stanoveny pomocí následujících rovnic:

2 NH4Cl + 3 O2 = 2 HNO2 + 2 HCl + 2 H2O (1)

2 HNO2 + O2 = 2 HNO3 (2)

Celkově:

2 NH4Cl + 4 O2 = 2 HNO3 + 2 HCl + 2 H2O (3)

Podle rovnice 1 je spotřeba kyslíku při oxidaci 28 g dusíku obsaženého v NH4Cl na dusitan 96 g, tzn., že přepočítávací faktor je 3,43 (96/28). Stejně tak je podle rovnice 3 spotřeba kyslíku při oxidaci na dusičnan 128 g, tzn. přepočítávací faktor je 4,57 (128/28).

Protože popsané reakce následují po sobě, přičemž jsou realizovány odlišnými druhy bakterií, může koncentrace dusitanů stoupat i klesat; při poklesu roste odpovídajícím způsobem koncentrace dusičnanů. Spotřeba kyslíku při tvorbě dusičnanů se tedy vypočte vynásobením přírůstku koncentrace dusičnanů faktorem 4,57, zatímco spotřeba kyslíku při tvorbě dusitanů se vypočte vynásobením přírůstku koncentrace dusitanů faktorem 3,43, nebo při poklesu obsahu dusitanů se ztráty kyslíku vypočtou vynásobením poklesu koncentrace faktorem -3,43.

To znamená:

spotřeba O2 při tvorbě dusičnanů = 4,57 × přírůstek koncentrace dusičnanů (4)

spotřeba O2 při tvorbě dusitanů = 3,43 × přírůstek koncentrace dusitanů (5)

ztráta O2 při úbytku dusitanů: = −3,43 × pokles koncentrace dusitanů (6)

Tedy

spotřeba O2 při nitrifikaci = ± 3,43 × změna koncentrace dusitanů + 4,57 × změna koncentrace dusičnanů (7)

a proto

spotřeba O2 v důsledku oxidace C = celková pozorovaná spotřeba – spotřeba v důsledku nitrifikace (8)

Jinými slovy, pokud se stanoví pouze celkový oxidovaný N, je možno za spotřebu kyslíku v důsledku nitrifikace považovat v prvém přiblížení hodnotu 4,57 x přírůstek oxidovaného dusíku.

Korigovaná hodnota spotřeby kyslíku v důsledku oxidace C se potom porovnává s TSK NH3 vypočítanou podle přílohy II.

V. METODA PRO STANOVENÍ ROZLOŽITELNOSTI – BIOCHEMICKÁ SPOTŘEBA KYSLÍKU – metoda C.5 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

V.1 METODA

V.1.1 ÚVOD

Metoda je určena pro měření biochemické spotřeby kyslíku (BSK) tuhých nebo kapalných organických látek.

Data získaná při této zkoušce platí pro látky rozpustné ve vodě; těkavé látky a látky s nízkou rozpustností ve vodě lze touto metodou alespoň v zásadě rovněž zkoušet.

Metodu lze použít pouze pro organické látky, které nemají v koncentracích používaných při zkoušce inhibiční účinek na bakterie. Není-li daná látka při koncentracích používaných ve zkoušce rozpustná, může být nezbytné použít pro dosažení dobré dispergace zkušebního materiálu zvláštní postupy, např. dispergaci ultrazvukem.

Informace o toxicitě chemické látky mohou být užitečné při interpretaci nízkých hodnot výsledku zkoušky a při volbě vhodných zkušebních koncentrací.

V.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Biochemická spotřeba kyslíku (BSK) je definována jako množství rozpuštěného kyslíku, které je nutné k biochemické oxidaci určitého objemu roztoku látky za předepsaných podmínek.

Výsledky se vyjadřují v gramech spotřeby kyslíku (BSK) na 1 g zkušební látky.

V.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Je žádoucí použít vhodnou referenční látku pro kontrolu aktivity inokula.

V.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Předem stanovené množství látky rozpuštěné nebo dispergované ve vhodném, dobře provzdušněném médiu se inokuluje mikroorganismy a kultivuje se v temnu za stálé, definované teploty.

BSK se stanoví z rozdílu mezi obsahem rozpuštěného kyslíku na začátku a na konci zkoušky. Zkouška musí trvat nejméně pět dní a nejdéle 28 dní.

Souběžně musí být provedena slepá zkouška bez obsahu zkušební látky.

V.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

Stanovení BSK nelze považovat za ověřené stanovení biologické rozložitelnosti látky. Tuto zkoušku lze považovat pouze za screeningovou zkoušku.

V.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

Připraví se předběžný roztok nebo disperse zkušební látky o koncentraci vhodné pro použitou metodu. Poté se stanoví BSK některou vhodnou vnitrostátní nebo mezinárodní standardizovanou metodou.

V.2 DATA A HODNOCENÍ

BSK předběžného roztoku se vypočte vybranou normalizovanou metodou a přepočte se na BSK vyjádřenou v gramech na 1 g zkušební látky.

V.3 ZPRÁVY

Uvede se použitá metoda.

Biochemická spotřeba kyslíku se vypočte jako průměr výsledků alespoň tří platných měření.

Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků a které by mohly ovlivnit výsledek, zejména pokud jde o nečistoty, fyzikální stav, toxické účinky a vlastní složení zkušební látky.

Použití přísad pro inhibici biologické nitrifikace musí být uvedeno.

V.4 LITERATURA

Seznam příkladů standardizovaných metod:

NF T 90-103: Determination of the biochemical oxygen demand.

NBN 407: Biochemical oxygen demand.

NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemisch zuurstofverbruik (BZV).

The determination of biochemical oxygen demand, Methods for the examination of water and associated materials, HMSO, London.

ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n days.

VI. METODA PRO STANOVENÍ ROZLOŽITELNOSTI - CHEMICKÁ SPOTŘEBA KYSLÍKU – metoda C.6 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

VI.1 METODA

VI.1.1 ÚVOD

Metoda je určena pro měření chemické spotřeby kyslíku (CHSK) tuhých nebo kapalných organických látek prováděné standardním dohodnutým způsobem za pevně stanovených laboratorních podmínek.

Pro provedení této zkoušky a pro interpretaci výsledků jsou užitečné informace o chemickém vzorci látky (např. zda jde o soli halogenů, železnaté soli organických sloučenin, organické sloučeniny chloru).

VI.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Chemická spotřeba kyslíku (CHSK) je mírou oxidovatelnosti látky, která se vyjadřuje jako ekvivalentní množství kyslíku oxidačního činidla spotřebovaného látkou za pevně stanovených laboratorních podmínek.

Výsledek se vyjadřuje jako množství spotřebovaného kyslíku (COD) v gramech na 1 g zkušební látky.

VI.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

VI.1.4. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Předem stanovené množství látky rozpuštěné nebo dispergované ve vodě se za přítomnosti síranu stříbrného jako katalyzátoru oxiduje dichromanem draselným v prostředí koncentrované kyseliny sírové pod zpětným chladičem. Přebytečný dichroman se stanoví titrací odměrným roztokem síranu amonno-železnatého.

U látek obsahujících chlór se pro omezení rušení chloridy přidává síran rtuťnatý^*.

VI.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

Vzhledem k dohodnutým podmínkám stanovení je CHSK „ukazatelem oxidovatelnosti“ a jako takový se používá pro hodnocení organických látek.

Ve zkoušce mohou rušit chloridy; na stanovení CHSK mohou mít rovněž vliv anorganické redukční a oxidační látky.

U některých cyklických sloučenin a u řady těkavých sloučenin (např. u nižších mastných kyselin) nedochází v této zkoušce k úplné oxidaci.

VI.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

Připraví se počáteční roztok nebo disperse látky tak, aby bylo dosaženo CHSK od 250 do 600 mg·l^-1.

Poznámky:

U špatně rozpustných nebo nedispergovatelných látek lze jemně rozmělněnou látku nebo kapalinu v množství odpovídajícím 5 mg CHSK odvážit a vpravit přímo do experimentální aparatury s vodou.

Často je výhodné, zejména v případě špatně rozpustných látek, stanovit CHSK upravenou metodou, tj. v uzavřeném systému s vyrovnávačem tlaku (H. Kelkenberg, 1975). Touto upravenou metodou lze často úspěšně kvantifikovat i látky, u nichž je stanovení konvenční metodou obtížné – např. kyselinu octovou. Metoda však také selhává v případě pyridinu. Zvýší-li se koncentrace dichromanu draselného předepsaná v (1), na 0,25 N (0,0416 M), usnadní se přímé navažování 5 – 10 mg látky, což je důležité pro stanovení CHSK látek obtížně rozpustných ve vodě (2).

Jinak se CHSK stanoví vhodnou vnitrostátní nebo mezinárodní metodou.

VI.2 DATA A HODNOCENÍ

CHSK obsahu experimentální baňky se vypočte vybranou normalizovanou metodou a přepočte se na CHSK vyjádřenou v gramech na 1 g zkušební látky.

VI.3 ZPRÁVY

Uvede se odkaz na použitou metodu.

Chemická spotřeba kyslíku se vypočte jako průměr výsledků alespoň tří měření. Jsou-li známy, musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků a které by mohly ovlivnit výsledek, zejména pokud jde o nečistoty, fyzikální stav a základní vlastnosti zkušební látky.

Uvede se použití síranu rtuťnatého za účelem omezení rušení chloridy.

VI.4 LITERATURA

(1) Kelkenberg, H. Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 8, 146.

(2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, 13, 169.

Seznam příkladů normovaných metod:

NBNT 91-201	Determination of the chemical oxygen demand.
ISBN O 11 7512494	Chemical oxygen demand (dichromat value) of polluted and waste waters.
NF T 90-101	Determination of the chemical oxygen demand.
DS 217	Water analysis —Determination of the chemical oxygen demand.
DIN 38409-H-41	Determination of the chemical oxygen demand (COD) within the range above 15 mg per litre.
NEN 3235 5.3	Bepaling van bet chemisch zuurstofverbruik.
ISO 6060	Water Quality: Chemical oxygen demand dichromate methods.

VII. METODA PRO STANOVENÍ ABIOTICKÉHO ROZKLADU – HYDROLÝZA JAKO FUNKCE pH – metoda C.7 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

VII.1 METODA

Metoda je založena na Pokynech OECD pro zkoušení (1).

VII.1.1 ÚVOD

Hydrolýza je důležitá reakce ovlivňující abiotický rozklad. Tato reakce má zvláštní význam u látek, které jsou málo biologicky rozložitelné; může ovlivnit stálost látky v životním prostředí.

Většina reakcí hydrolýzy probíhá jako reakce pseudoprvního řádu, a poločasy jsou tedy nezávislé na koncentraci. To zpravidla dovoluje extrapolaci výsledků získaných s laboratorními koncentracemi na podmínky v životním prostředí.

Mimoto byly u několika typů chemických sloučenin publikovány příklady uspokojivé shody výsledků naměřených v čisté vodě a v přírodních vodách (2).

Při provádění této zkoušky je užitečné znát hodnotu tlaku par dané látky.

Metoda je použitelná pouze pro látky rozpustné ve vodě. Nečistoty mohou ovlivnit výsledky.

Chování látek při hydrolýze by mělo být zkoumáno při hodnotách pH, které se obvykle vyskytují v životním prostředí (pH 4 − 9).

VII.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Hydrolýzou se rozumí reakce látky RX s vodou. Tuto reakci lze znázornit prostou výměnou skupiny X za skupinu OH:

RX+HOH→ROH+HX	(1)

Rychlost, kterou klesá koncentrace látky RX, je dána vztahem:

rychlost=k.H2O.RX	(2)

Protože je voda přítomna vůči zkoušené látce ve velkém přebytku, označuje se obvykle tento typ reakce jako reakce pseudoprvního řádu, ve které je pozorovaná rychlostní konstanta dána vztahem:

kpozorov.=k.H2O	(3)

Tuto konstantu lze určit pro danou hodnotu pH a teplotu T z výrazu:

kpozorov.=2,303t×logC0Ct	(4)

kde

t = čas,

C0 = koncentrace látky v čase 0,

Ct = koncentrace látky v čase t,

2,303 = přepočítací faktor mezi přirozeným logaritmem a dekadickým logaritmem.

Koncentrace se vyjádří v g·l^-1 nebo v mol·l^-1.

Konstanta kpozorov. má rozměr [čas]^-1.

„Poločas“ t½ je definován jako doba potřebná pro snížení koncentrace látky o 50 %,

Ct=1/2·C0(5)

Z rovnic (4) a (5) plyne, že

t1/2=0,693/kpozorov.	(6)

VII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

Jako referenční látky byly použity následující látky (1):

Kyselina acetylsalicylová (aspirin),

O,O-diethyl-O-(2-isopropyl-6-methylpyrimidin-4-yl)fosforothioát (dimpylát, diazinon).

VII.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Látka se rozpustí ve vodě v nízké koncentraci; pH a teplota se regulují.

Vhodnou analytickou metodou se sleduje pokles koncentrace látky v závislosti na čase.

Sestrojí se graf závislosti logaritmů koncentrací na čase, a je-li závislost lineární, lze zjistit rychlostní konstantu reakce prvního řádu ze směrnice přímky (viz bod 2).

Není-li možné stanovit rychlostní konstantu pro danou teplotu přímo, je obvykle možné odhadnout ji pomocí Arrheniovy rovnice, která udává teplotní závislost rychlostních konstant. Z průběhu lineární závislosti logaritmů rychlostních konstant, získaných při vhodných teplotách, na převrácené hodnotě absolutní teploty (K) lze extrapolací získat hodnotu rychlostní konstanty, kterou nebylo možné stanovit přímo.

VII.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

V odkazu (2) se uvádí, že měření rychlostních konstant hydrolýzy lze u 13 tříd organických sloučenin provádět s vysokou přesností.

Reprodukovatelnost závisí zejména na regulaci pH a teploty a může být ovlivněna přítomností mikroorganismů a ve speciálních případech koncentrací rozpuštěného kyslíku.

VII.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

VII.1.6.1 Reakční činidla

VII.1.6.1.1 Pufrační roztoky

Zkouška se provádí při třech hodnotách pH: 4,0, 7,0 a 9,0.

K tomuto účelu se za použití chemikálií čistoty p.a. a destilované nebo deionizované vody připraví pufrační roztoky. Některé příklady pufračních roztoků jsou uvedeny v doplňku.

Použitý pufrační roztok může mít vliv na rychlost hydrolýzy; je-li tomu tak, je třeba zvolit jiný pufrační roztok. V odkazu (2) se doporučuje použít namísto fosforečnanových pufračních roztoků boritanové a acetátové pufrační roztoky.

Není-li známa hodnota pH pufračních roztoků při zkušební teplotě, lze ji stanovit s přesností na ±0,1 pH-metrem kalibrovaným při zvolené teplotě.

VII.1.6.1.2 Zkušební roztoky

Zkušební látka se rozpustí ve zvoleném pufračním roztoku a koncentrace by neměla překročit 0,01 mol·l^-1 nebo polovinu koncentrace nasyceného roztoku, podle toho, která z těchto hodnot je nižší.

Použití organických rozpouštědel mísitelných s vodou se doporučuje jen u látek s nízkou rozpustností ve vodě.

Množství tohoto rozpouštědla by mělo být menší než 1 % a nemělo by mít vliv na proces hydrolýzy.

VII.1.6.2 Aparatura

Použijí se skleněné baňky se zabroušenými zátkami, pro něž není vhodné používat mazací tuk.

Pokud jsou chemická látka nebo pufrační roztok těkavé, nebo provádí-li se zkouška při zvýšené teplotě, upřednostňují se baňky zatavené nebo jinak uzavřené a s omezeným prostorem nad roztokem.

VII.1.6.3 Analytická metoda

Použitá metoda musí být specifická pro stanovení zkušební látky při zkušebních koncentracích a může být i kombinací vhodných analytických technik.

Použitá analytická metoda bude záviset na povaze látky a musí být dostatečně přesná a citlivá pro zjištění úbytku počáteční koncentrace o 10 %.

VII.1.6.4 Zkušební podmínky

Zkoušky se provádí v termostatovaném prostoru nebo za použití termostatované lázně nastavené na zvolenou teplotu s tolerancí ±0,5 °C. Teplota se udržuje a měří s přesností na ±0,1 °C. Vhodnými opatřeními je třeba zabránit fotolýze.

U snadno oxidovatelných látek je nezbytné odstranit rozpuštěný kyslík (např. 5minutovým probubláváním roztoku dusíkem nebo argonem před přípravou roztoku).

VII.1.6.5 Zkušební postup

VII.1.6.5.1 Předběžná zkouška

U všech látek se provede předběžná zkouška při teplotě 50 ± 0,5°C pro tři hodnoty pH: 4,0, 7,0 a 9,0. Provede se dostatečný počet měření, aby bylo možné pro každé pH odhadnout, zda je při 50 °C poločas (t½) menší než 2,4 h nebo zda po 5 dnech dojde k hydrolýze méně než 10 %. (Lze odvodit, že tyto hodnoty odpovídají za podmínek, které se nejčastěji vyskytují v životním prostředí (25 °C), poločasu kratšímu než jeden den, resp. delšímu než 1 rok). Jestliže se v předběžném experimentu ukáže, že při 50 °C dojde při všech třech hodnotách pH (4, 7, 9) za 2,4 h k hydrolýze 50 nebo více procent zkušební látky, nebo že po 5 dnech dojde k hydrolýze méně než 10 % zkušební látky, nejsou další experimenty nezbytné.

V ostatních případech a pro hodnoty pH, u nichž výše uvedené podmínky nenastanou, se provede zkouška 1.

VII.1.6.5.2 Zkouška 1

Zkouška 1 se provede při jedné teplotě, nejlépe při 50 ± 0,5 °C, a pokud možno za sterilních podmínek při pH, pro něž se v předběžné zkoušce ukázala nutnost dalších zkoušek.

Zvolí se dostatečný počet vzorků, aby byl pokryt stupeň hydrolýzy 20 až 70 % a bylo tak možné ověřit, že jde při specifikovaném pH o reakci pseudoprvního řádu.

Pro každé pH, při němž se zkouška 1 provede, se stanoví řád reakce.

Odhad rychlostní konstanty při 25 °C:

Rozhodnutí o dalším experimentálním postupu závisí na tom, zda lze ze zkoušky 1 usuzovat na reakci pseudoprvního řádu, či nikoliv.

Pokud nelze ze zkoušky 1 s jistotou usuzovat na reakci pseudoprvního řádu, je třeba provést další experimenty podle zkoušky 2.

Vyplývá-li s jistotou ze zkoušky 1, že jde o rekci pseudoprvního řádu, provedou se další experimenty podle zkoušky 3. (Za speciálních okolností lze vypočítat rychlostní konstanty při 25 °C z konstant při 50 °C vypočtených s použitím výsledků zkoušky 1, viz bod 3.2).

VII.1.6.5.3 Zkouška 2

Tato zkouška se provede při každém pH, pro něž se její provedení ukázalo na základě výsledků zkoušky 1 nezbytným, a to

— buď při teplotě nižší než 40 °C,

— nebo při dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liší nejméně o 10 °C.

Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se má provést zkouška 2, se v přiměřených intervalech zvolí nejméně 6 bodů tak, že stupeň hydrolýzy je v oblasti 20 až 70 %.

Pro jedno pH a pro jednu teplotu se provede měření dvakrát. Pokud se zkouška 2 provádí při dvou teplotách nad 50 °C, provede se měření dvakrát nejlépe při nižší z těchto dvou teplot.

Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se provede zkouška 2, se podle možnosti uvede grafický odhad poločasu (t½).

VII.1.6.5.4 Zkouška 3

Tato zkouška se provede při každém pH, pro něž se její provedení ukázalo na základě výsledků zkoušky 1 nezbytným, a to

— buď při teplotě nižší než 40 °C,

— nebo při dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liší nejméně o 10 °C.

Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se má provést zkouška 3, se zvolí tři body, první v čase 0, druhý a třetí při stupni hydrolýzy vyšším než 30 %; vypočte se konstanta kpozorov. a poločas t½.

VII.2 DATA