Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

— teplotu,

— křivku úbytku s popisem, způsob výpočtu (viz 1. 2),

— datum a lokalitu, kde byly odebrány aktivovaný kal a odpadní voda, stav adaptace, koncentrace atd.,

— vědecké důvody pro veškeré změny v postupu zkoušky,

— podpis a datum.

XII.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Protože látky zkoušené touto metodou nejsou snadno biologicky rozložitelné, bude normálně jakýkoli úbytek DOC, ke kterému dojde pouze v důsledku biologického rozkladu, během dnů nebo týdnů, postupný, s výjimkou případů, kdy aklimatizace je náhlá, jak je to indikováno náhlým vymizením zkoušené látky po několika týdnech.

Někdy může hrát významnou úlohu fyzikálně-chemická adsorpce; to je indikováno úplným nebo částečným úbytkem přidaného DOC na začátku. K čemu dojde potom, závisí na činitelích jako je míra adsorpce a koncentrace suspendovaných látek v nepoužité odcházející vodě. Obvykle rozdíl mezi koncentrací DOC v kapalinách nad usazeninou u kontroly a ve zkoušce postupně vzrůstá z počáteční nízké hodnoty a tento rozdíl pak, pokud nedojde k aklimatizaci, zůstává na nové hodnotě po zbytek experimentu,.

Je-li třeba rozlišit mezi biologickým rozkladem (nebo částečným biologickým rozkladem) a adsorpcí, jsou nezbytné další zkoušky. Je možné je provést řadou způsobů, ale nejpřesvědčivější je použití kapaliny nad usazeninou nebo kalu jako inokula ve zkoušce vybrané ze základního souboru (nejlépe v respirometrické zkoušce).

Zkoušené látky, u kterých v této zkoušce dochází k vysokému neadsorpčnímu úbytku DOC, je třeba považovat za potenciálně biologicky rozložitelné. Částečný neadsorpční úbytek ukazuje, že u látky dochází alespoň k určitému biologickému rozkladu.

Nízké nebo nulové úbytky DOC mohou být způsobeny inhibicí mikroorganizmů zkoušenou látkou, což se může projevit také lyzí a ztrátou kalu, takže kapalina nad usazeninou je zakalená. Zkoušku je nutné opakovat s nižší koncentrací zkoušené látky.

Vyšší citlivosti je možné dosáhnout použitím specifické analytické metody nebo sloučeniny značené ^14C. V případě zkoušené látky značené uhlíkem ^14C se zachycením ^14CO2 potvrdí, že došlo k biologickému rozkladu.

Tam, kde jsou výsledky uvedeny také jako primární biologický rozklad, je třeba, pokud je to možné, uvést také vysvětlení změny chemické struktury, která vede ke ztrátě odezvy u mateřské zkoušené látky.

Je nutné uvést potvrzení platnosti metody spolu s odezvou zjištěnou u média ve slepé zkoušce.

XII.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981. Test Guideline 302 A, Decision of the Council C(81) 30 final.

PŘÍLOHA 1

Zkouška SCAS: příklad výsledků

Látka	CT (mg.l-1)	C1 - Cc (mg.l-1)	Procento biolog. rozkladu Dda	Doba trvání zkoušky (dny)
4 -acetylaminobenzen sulfonan	17,2	2,0	85	40
tetrapropylenbenzen sulfonan	17,3	8,4	51,4	40
4 - nitrofenol	16,9	0,8	95,3	40
diethylenglykol	16,5	0,2	98,8	40
anilin	16,9	1,7	95,9	40
cyklopentantetra-karboxylát	17,9	3,2	81,1	120

PŘÍLOHA 2

Příklad zkušební aparatury

[image omitted]

XIII. METODA PRO STANOVENÍ BIOAKUMULACE - PRŮTOKOVÁ ZKOUŠKA NA RYBÁCH – metoda C.13 podle přílohy směrnice Komise 98/73/ES ze dne 18. září 1998, kterou se po dvacáté čtvrté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice rady 67/548/EHS o sbližování správních a právních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek

XIII.1 METODA

Tato bioakumulační metoda je replikou metody OECD TG 305 (1996).

XIII.1.1 Úvod

V této metodě je popsán postup pro charakterizování potenciálu látek bioakumulovat se v rybách za průtokových podmínek. Ačkoliv jsou průtokové režimy preferovány, semistatické režimy se připouštějí, jsou-li splněna kritéria validace.

V metodě jsou dostatečně popsány podrobnosti pro provedení zkoušky, přičemž je poskytnuta dostatečná volnost pro přizpůsobení experimentálního uspořádání podmínkám v jednotlivých laboratořích a různým vlastnostem zkušebních látek. Metoda je nejefektivnější pro stabilní organické chemikálie s hodnotou log Pov od 1,5 do 6,0 (1), ale může být také použita na superlipofilní látky (s hodnotou log Pov > 6,0). Předběžně odhadnutý bioakumulační faktor (BCF), někdy označován jako KB, bude pro takové superlipofilní látky pravděpodobně vyšší než hodnota bioakumulačního faktoru v rovnovážném stavu (BCFss), která je očekávána z laboratorních experimentů. Předběžné odhady pro organické látky s hodnotou log Pov až asi 9,0 lze získat pomocí rovnice Binteina et al (2). Mezi parametry, které charakterizují bioakumulační potenciál, patří rychlostní konstanta příjmu (k1), rychlostní konstanta vylučování (k2) a BCFss.

Zkušební látky značení radioizotopy mohou usnadnit analýzu vzorků vody a ryb a mohou být použity v případě, že by měla být provedena identifikace a kvantifikace produktů odbourávání. Měří-li se celkový obsah radioaktivního zůstatku (například spálením nebo solubilizací tkáně), zakládá se hodnota BCF na výchozí sloučenině, všech zadržených metabolitech a také na asimilovaném uhlíku. Hodnoty BCF založené na celkovém obsahu radioaktivního zbytku tedy nemohou být přímo srovnatelné s hodnotou BCF získanou specifickou chemickou analýzou pouze výchozí sloučeniny.

V metodách se značením radioaktivními izotopy mohou být pro stanovení výchozí sloučeniny zařazeny purifikační postupy, a je-li to považováno za nezbytné, mohou být charakterizovány hlavní metabolity. Je možné rovněž kombinovat studii metabolismu ryb se studií bioakumulace analýzou a identifikací reziduí v tkáních.

XIII.1.2 Definice a jednotky

Biokoncentrace/Bioakumulace je nárůst koncentrace zkušební látky v organismu (v jeho specifické tkáni) nebo na něm vzhledem ke koncentraci zkušební látky v okolním médiu.

Bioakumulační faktor (BCF nebo KB) je koncentrace zkušební látky v rybách nebo na nich nebo v jejich specifikovaných tkáních (Cf v µg/g (ppm)) dělená koncentrací chemikálie v okolním médiu (Cw v µg/ml (ppm)), a to v každém okamžiku fáze příjmu při této zkoušce.

Bioakumulační faktor v rovnovážném stavu (BCFSS nebo KB) se po dlouhou dobu výrazně nemění; koncentrace zkušební látky v okolním médiu je po tuto dobu konstantní.

Plató nebo rovnovážný stav je stav dosažený tehdy, je-li při grafickém vyjádření křivka časové závislosti koncentrace zkušební látky v rybách (Cf) rovnoběžná s časovou osou a tři po sobě jdoucí analýzy Cf vzorků odebraných v intervalech alespoň dvou dnů se neliší více než o ±20 % a není-li mezi těmito třemi dobami odběru žádný výrazný rozdíl. Analyzují-li se sdružené vzorky, požadují se čtyři po sobě jdoucí analýzy. V případě zkušebních látek, jejichž příjem probíhá pomalu, jsou vhodnější sedmidenní intervaly.

Bioakumulační faktory vypočtené přímo z rychlostních konstant kinetiky (k1/k2) se nazývají kinetické koncentrační faktory (BCFk).

Rozdělovací koeficient oktanol-voda (Pov) je rovnovážný poměr mezi rozpustností chemikálie v n-oktanolu a ve vodě (metoda A.8) a označuje se také jako Kow. Logaritmus hodnoty Pov se používá jako ukazatel potenciálu chemikálie bioakumulovat se ve vodních organismech.

Expozice nebo fáze příjmu je časový úsek, během něhož jsou ryby vystaveny působení zkušební chemikálii.

Rychlostní konstanta příjmu (k1) je číselná hodnota definující rychlost nárůstu koncentrace zkušební látky v testovacích rybách nebo na nich (nebo v jejich specifikovaných tkáních), jsou-li ryby této chemikálii vystaveny (k1 se vyjadřuje ve jednotce den^-1).

Po-expoziční nebo vylučovací fáze je časový úsek po přemístění testovacích ryb z média obsahujícího zkušební látku do média, které tuto látku neobsahuje, během něhož se studuje vylučování látky z testovacích ryb (nebo její čistý úbytek v nich).

Rychlostní konstanta vylučování (k2) je číselná hodnota definující rychlost poklesu koncentrace zkušební látky v testovacích rybách (nebo v jejich specifikovaných tkáních) po jejich přemístění z média obsahujícího zkušební látku do média, které tuto látku neobsahuje (k2 se vyjadřuje ve jednotce den^-1).

XIII.1.3 Princip zkušební metody

Zkouška má dvě fáze: fázi expozice (příjem) a po-expoziční fázi (vylučování). Během fáze příjmu jsou dvě oddělené skupiny ryb stejného druhu exponovány alespoň dvěma koncentracím zkušební látky. Poté jsou přemístěny do média, které zkušební látku neobsahuje, aby začala fáze vylučování. Fáze vylučování je vždy nezbytná, není-li příjem látky během fáze příjmu nevýznamný (např. je-li BCF menší než 10). Koncentrace zkušební látky v rybách nebo na nich (nebo v jejich specifikovaných tkáních) se sleduje v průběhu obou fází zkoušky. Vedle těchto dvou zkušebních koncentrací se za stejných podmínek, s výjimkou přítomnosti zkušební látky, udržuje kontrolní skupina ryb, aby mohly být na odpovídající kontrolní skupině porovnány možné nepříznivé účinky pozorované při bioakumulačních zkouškách a aby byly získány pozaďové koncentrace zkušební látky.

Fáze příjmu tvá 28 dnů, není-li prokázáno, že rovnováhy je dosaženo dříve. Délku fáze příjmu a dobu potřebnou k ustavení rovnovážného stavu lze předpovědět pomocí rovnice v příloze 3. Fáze vylučování poté začne po přemístění ryb do jiné nádrže bez zkušební látky. Je-li to možné, vypočítají se bioakumulační faktory nejlépe jako poměr (BCFss), tj. poměr koncentrace v rybách (Cf) a ve vodě (Cw) ve zřetelném rovnovážném stavu, a jako kinetický bioakumulační faktor (BCFk), tj. poměr rychlostních konstant příjmu (k1) a vylučování (k2) za předpokladu kinetiky prvního řádu. Neřídí-li se zjevně naměřené hodnoty kinetikou prvního řádu, měl by být použit složitější model (příloha 5).

Nedojde-li k rovnovážnému stavu do 28 dnů, měla by být fáze příjmu prodloužena do jeho dosažení nebo na 60 dnů, podle toho, co nastane dříve; poté začne fáze vylučování.

Rychlostní konstanta příjmu, rychlostní konstanta vylučování (úbytku) (nebo konstanty, jsou-li použity složitější modely), bioakumulační faktor a, je-li to možné, intervaly spolehlivosti každého z těchto parametrů se vypočítají z modelu, který popisuje naměřené koncentrace zkušební látky v rybách a ve vodě. Faktor BCF se vyjadřuje jako funkce celkové živé hmotnosti ryby. Pro zvláštní účely však mohou být použity specifikované tkáně nebo orgány (svalovina, játra), je-li ryba dostatečně velká nebo je-li možné ji rozdělit na jedlý (vykostěný) podíl a nejedlý podíl (vnitřnosti). Vzhledem k tomu, že u mnoha organických látek existuje zřetelný vztah mezi potenciálem bioakumulace a lipofilií, existuje také odpovídající vztah mezi obsahem tuku v testovacích rybách a pozorovanou bioakumulací takové látky. Aby se tedy snížilo kolísání výsledků pro tyto látky s vysokou lipofilií (tj. s log Pov ^> 3), měla by být bioakumulace vztažena vedle celkové hmotnosti těla také k obsahu tuku.

Obsah tuku by měl být stanoven pokud možno na stejném biologickém materiálu, jaký je použit ke stanovení koncentrace zkušební látky.

XIII.1.4 Informace o zkušební látce

Před prováděním zkoušek bioakumulace by měly být o zkušební látce známy tyto informace:

• a) rozpustnost ve vodě,

• b) rozdělovací koeficient oktanol-voda Pov (označovaný také jako Kow, stanovený metodou HPLC, viz A.8),

• c) hydrolýza,

• d) fototransformace ve vodě stanovená ozářením slunečním nebo simulovaným slunečním světlem za podmínek zkoušky bioakumulace (3),

• e) povrchové napětí (tj. u látek, u nichž nelze stanovit log Pov),

• f) tlak par,

• g) popřípadě ochota k biologickému odbourávání.

Další požadovanou informací je toxicita pro druh ryby, který má být použit, nejlépe asymptotická hodnota LC50 (tj. časově nezávislá). Musí být k dispozici vhodná analytická metoda o známé správnosti, přesnosti a citlivosti pro kvantitativní stanovení zkušební látky ve zkušebních roztocích a v biologickém materiálu a dále podrobnosti o přípravě a uchovávání vzorků. Měly by být také známy meze stanovitelnosti zkušební látky jak ve vodě, tak v rybích tkáních. Je-li použita zkušební látka značená ^14C, měla by být známá aktivita nečistot vyjádřená v procentech.

XIII.1.5 Platnost zkoušky

Aby zkouška platila, měly by platit následující podmínky:

— kolísání teploty je menší než ±2 °C,

— koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesne pod 60% nasycení,

— koncentrace zkušební látky v nádrži je udržována v intervalu ±20 % kolem střední hodnoty naměřených hodnot během fáze příjmu,

— mortalita nebo jiné nepříznivé účinky/choroby jak u kontrolních, tak u exponovaných ryb je na konci zkoušky menší než 10 %; jestliže je zkouška prodloužena na několik týdnů nebo měsíců, měl by být úhyn nebo jiné nepříznivé účinky v obou skupinách ryb menší než 5 % za měsíc nebo by neměl překročit celkem 30 %.

c1.6 Referenční sloučeniny

Použití referenčních sloučenin o známém bioakumulačním potenciálu je popřípadě užitečné pro kontrolu experimentálního postupu. Zatím nelze ještě doporučit žádné specifické látky.

XIII.1.7 Popis zkušební metody

XIII.1.7.1 Přístroje a pomůcky

V případě všech částí zařízení je třeba se důsledně vyhýbat použití materiálů, které mají schopnost rozpouštět, sorbovat nebo vyluhovat a mají nepříznivý účinek na ryby. Lze použít standardní pravoúhlé nebo válcové nádrže vyrobené z inertního materiálu a mající vhodný objem s ohledem na náplň. Použití měkkých trubek z plastu by mělo být minimalizováno. Měly by být použity trubky z teflonu (R), z korozivzdorné oceli a/nebo ze skla. Zkušenosti ukázaly, že pro látky s vysokými absorpčními koeficienty, jako jsou syntetické pyrethroidy, je potřebné silanizované sklo. V těchto případech musí být zařízení po použití zlikvidováno.

XIII.1.7.2 Voda

Ve zkoušce se používá přírodní voda a měla by být získána z nekontaminovaného zdroje stálé kvality. Ředicí voda musí mít kvalitu, která umožní přežití zvoleného druhu ryby po dobu aklimatizace a v průběhu fází zkoušky, aniž by vykazoval abnormální klinický zjev nebo chování. V ideálním případě by mělo být prokázáno, že testovací druh může v ředicí vodě přežít, růst a rozmnožovat se (např. zkouškou s laboratorní kulturou nebo zkouškou toxicity během životního cyklu). Voda by měla být charakterizována alespoň hodnotou pH, tvrdostí, celkovým obsahem nerozpuštěných látek, celkovým obsahem organického uhlíku a podle možnosti také obsahem amoniaku a dusičnanů, alkalitou a v případě mořských druhů salinitou. Všechny parametry, které jsou důležité pro optimální prospívání ryb, jsou známy, v příloze I jsou přesto uvedeny doporučené maximální koncentrace pro řadu parametrů sladkovodní a mořské vody.

Voda by měla mít po celou dobu zkoušky stejnou kvalitu. Hodnota pH by měla být v rozmezí 6,0 až 8,5, avšak během zkoušky by se pH nemělo lišit o více než ±0,5. Pro ujištění, že voda nebude mít přílišný vliv na výsledky zkoušky (například tvorbou komplexů se zkušební látkou) nebo nepříznivý vliv na stav obsádky ryb, by měly být odebírány v pravidelných intervalech její vzorky pro analýzu. Stanovení těžkých kovů (např. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), hlavních aniontů, kationtů (např. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pesticidů (např. celkový obsah organofosforových a organochlorových pesticidů), celkový obsah organického uhlíku a suspendovaných látek by měl být proveden každé tři měsíce, je-li kvalita ředicí vody relativně konstantní. Je-li prokázáno, že kvalita vody je konstantní po dobu alespoň jednoho roku, mohou být stanovení méně častá a intervaly lze prodloužit (např. každých šest měsíců).

Celkový přirozený obsah částic a rovněž obsah organického uhlíku (TOC) v ředicí vodě by měl být co nejnižší, aby nedošlo k absorpci zkušební látky na organických látkách, což může snížit její biologickou dostupnost (4). Maximální přijatelná hodnota je 5 mg/l pro částice (sušina zachycená filtrem 0,45 µm) a 2 mg/l pro celkový organický uhlík (viz příloha II). Je-li to nezbytné, měla by být voda před použitím filtrována. Příspěvek k obsahu organického uhlíku od testovacích ryb (exkrety) a ze zbytků potravy by měl být co nejmenší. V průběhu zkoušky by neměla koncentrace organického uhlíku ve zkušební nádrži překročit koncentraci organického uhlíku pocházejícího ze zkušební látky a z rozpouštědla, je-li použito, o více než 10 mg/l (±20 %).

XIII.1.7.3 Zkušební roztoky

Zásobní roztok zkušební látky se připraví ve vhodné koncentraci. Zásobní roztok by měl být připraven nejlépe jednoduchým smícháním nebo protřepáním zkušební látky s ředicí vodou. Použití rozpouštědel nebo dispersantů (solubilizačních činidel) se nedoporučuje; může však být v některých případech nezbytné pro vytvoření zásobního roztoku o vhodné koncentraci. Rozpouštědly, která mohou být použita, jsou ethanol, methanol, ethylenglykol-monomethylester, ethylenglykol-dimethylester, dimethylformamid a triethylenglykol. Dispersanty, které mohou být použity, jsou Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% methylcelulosa a HCO-40. Snadno biologicky odbouratelná činidla je třeba používat rozvážně, neboť mohou způsobit problémy s růstem bakterií v průtokových zkouškách. Zkušební látka může být značena radioaktivními izotopy a měla by být nejvyšší čistoty (např. > 98%).

Pro průtokové zkoušky je pro zajištění koncentrací testované látky nezbytný systém, který plynule dávkuje a ředí zásobní roztok zkušební látky (např. dávkovací čerpadlo, proporcionální dávkovač, saturační systém). Přijatelná je výměna nejlépe pěti objemů v každé zkušební nádrži za den. Upřednostňuje se průtokový režim, není-li to však možné (např. jsou-li testovací organismy nepříznivě ovlivňovány), může být použita semi-statická technika za předpokladu, že jsou splněna kritéria validity. Rychlosti průtoku zásobního roztoku a ředicí vody by měly být kontrolovány jak 48 hodin před zkouškou, tak poté alespoň denně během zkoušky. Tato kontrola by měla zhrnovat stanovení rychlosti průtoku v každé testovací nádrži a měla by zajistit, aby se rychlost průtoku neměnila o více než 20 % v rámci jedné nádrže nebo mezi nádržemi.

XIII.1.7.4 Výběr druhů

Důležitými kritérii pro výběr druhu jsou jeho dostupnost, možnost získat jej ve vyhovující velikosti a jeho bezproblémové udržování v laboratoři. Dalšími kritérii pro výběr druhu ryb jsou jeho rekreační, komerční a ekologický význam a rovněž srovnatelná citlivost, úspěšné dřívější použití atd. Doporučené druhy jsou uvedeny v příloze II. Mohou být použity jiné druhy, avšak zkušební postup musí být upraven, aby byly vytvořeny vhodné zkušební podmínky. V takovém případě by měly být uvedeny důvody pro výběr druhu a experimentální podmínky.

XIII.1.7.5 Chov ryb

Obsádka ryb se nechá aklimatizovat alespoň dva týdny při zkušební teplotě a krmí se odpovídající potravou stejného typu jako v průběhu zkoušky.

Po 48 hodinách aklimatizace se zaznamená úhyn a použijí se následující kritéria:

— úhyn vyšší než 10 % populace za sedm dnů: vyměnit celou obsádku;

— úhyn 5 až 10 % populace za sedm dnů: nechat aklimatizovat dalších sedm dnů;

— úhyn nižší než 5 % populace za sedm dnů: násada se přijímá; dojde li během dalších sedmi dnů k úhynu vyššímu než 5 %, celá násada se vymění.

Zajistí se, aby ryby použité pro zkoušku nevykazovaly pozorovatelné nemoci a abnormality. Všechny nemocné ryby se vymění. Dva týdny před zkouškou nebo v průběhu zkoušky nesmí být léčeny nemoci u ryb.

XIII.1.8 Provedení zkoušky

XIII.1.8.1 Předběžná zkouška

Může být užitečné provést předběžný experiment s cílem optimalizovat zkušební podmínky konečné zkoušky, např. výběr koncentrace (koncentrací) zkušební látky, délka fáze příjmu a fáze vylučování.

XIII.1.8.2 Délka fáze příjmu

Předpověď délky fáze příjmu lze získat z praktických zkušeností (např. z dřívější studie nebo z akumulace podobné chemikálie) nebo z určitých empirických vztahů využívajících znalosti buď rozpustnosti ve vodě, nebo rozdělovacího koeficientu oktanol-voda pro zkušební látku (viz příloha 3).

Fáze příjmu tvá 28 dnů, není-li prokázáno, že rovnováhy je dosaženo dříve. Nedojde-li k rovnovážnému stavu do 28 dnů, měla by být fáze příjmu prodloužena do jeho dosažení, přičemž se provádějí další měření, nebo na 60 dnů, podle toho, co nastane dříve.

XIII.1.8.2.2 Délka fáze vylučování

Doba odpovídající polovině délky fáze příjmu je obvykle dostatečná k tomu, aby došlo k přiměřenému (např. 95%) snížení obsahu látky v organismu (vysvětlení odhadu viz příloha 3). Jestliže doba nezbytná pro dosažení 95% úbytku je neúčelně dlouhá, překračuje například dvakrát normální délku fáze příjmu (tj. více než 56 dnů), může být použita kratší doba (tj. dokud není koncentrace zkušební látky menší než 10 % koncentrace v rovnovážném stavu). V případě látek se složitějším charakterem příjmu a vylučování, než jaký je popsán modelem ryby s jedním kompartmentem řídícím se kinetikou prvního řádu, však delší fáze vylučování umožní stanovit rychlostní konstanty úbytku. Délka fáze však může být určena dobou, po kterou zůstává koncentrace zkušební látky v rybách nad mezí detekce analytické metody.

XIII.1.8.2.3 Počet testovacích ryb

Počet ryb na jednu zkušební koncentraci se zvolí tak, aby pro každý odběr byly k dispozici čtyři ryby na jeden vzorek. Je-li požadována větší statická síla, bude na vzorek nezbytných více ryb.

Použijí-li se pohlavně dospělé ryby, uvede se, zda byly v experimentu použity ryby samičího nebo samčího pohlaví (nebo – uvede se pohlaví ryb použitých v experimentu). V případě použití obou pohlaví společně by mělo být před započetím expozice prokázáno, že rozdíl v obsahu tuku mezi oběma pohlavími není významný; oddělení samců a samic může být nezbytné.

V každé zkoušce se vyberou ryby podobné hmotnosti, tak aby hmotnost nejmenší z nich nebyla nižší než dvě třetiny hmotnosti největší ryby. Všechny by měly být stejného stáří a měly by pocházet ze stejného zdroje. Vzhledem k tomu, že se jeví, že stáří a hmotnost ryby mají často významný vliv na hodnoty BCF (1), musí být tyto podrobnosti přesně zaznamenány. Doporučuje se zvážit před zkouškou dílčí vzorek obsádky ryb s cílem odhadnout střední hmotnost.

XIII.1.8.2.4 Násada

Volí se vysoký poměr množství vody k množství ryb, aby se minimalizovalo snížení koncentrace Cw způsobené přidáním ryb na začátku zkoušky a také proto, aby nedošlo k poklesu koncentrace rozpuštěného kyslíku. Je důležité, aby rychlost nasazování byla přiměřená použitému druh. V každém případě se obvykle doporučuje rychlost nasazování 0,1 až 1,0 g ryb (živá hmotnost) na litr vody za den. Vysoká rychlost nasazování může být zvolena, je-li prokázáno, že požadovaná koncentrace zkušební látky může být udržována v mezích ±20 % a že koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesne pod 60% nasycení.

Při volbě režimu nasazování má být přihlédnuto k obvyklému přirozenému prostředí ryb. Například ryby žijící u dna mohou vyžadovat při stejném obejmu vody větší plochu dna než pelagické druhy ryb.

XIII.1.8.2.5 Krmení

Během aklimatizace a po dobu zkoušky se ryby krmí vhodnou potravou se známým obsahem tuku a celkových bílkovin podávanou v množství dostatečném pro udržení zdravého stavu a pro udržení tělesné hmotnosti. Ryby se krmí denně v průběhu aklimatizace a po dobu zkoušky množstvím přibližně 1 až 2 % tělesné hmotnosti; tím se udrží v průběhu zkoušky obsah tuku u většiny druhů ryb na relativně konstantní úrovni. Množství krmiva by mělo být například jednou týdně nově přepočítáno, aby byla udržena odpovídající tělesná hmotnost a obsah tuku. Hmotnost ryb v každé nádrži může být pro tento výpočet odhadnuta z hmotnosti ryb naposledy odebraných z dotyčné nádrže. Ryby, které zůstaly v nádrži, se neváží.

Nezkrmená potrava a exkrety se odstraňují z nádrží denně krátce po krmení (30 minut až jednu hodinu). Nádrže se udržují v celém průběhu zkoušky v co nejvyšší čistotě, aby byla koncentrace organických látek co nejnižší, neboť přítomnost organického uhlíku může snižovat biologickou dostupnost zkušební látky (1).

Poněvadž mnoho krmiv pochází z rybí moučky, mělo by být krmivo analyzováno na přítomnost zkušební látky. Je rovněž žádoucí, aby bylo krmivo analyzováno na přítomnost pesticidů a těžkých kovů.

XIII.1.8.2.6 Světlo a teplota

Fotoperioda je obvykle 12 až 16 hodin a teplota (±2 °C) by měla odpovídat testovacímu druhu (viz příloha 2). Druh a charakteristiky osvětlení by měly být známy. Měla by být věnována pozornost možné fototransformaci zkušební látky za světelných podmínek studie. Měly by být použito vhodné osvětlení, aby nedošlo k expozici ryb fotoproduktům nevyskytujícím se v přírodě. V některých případech může být vhodné použít filtr pro odfiltrování UV záření s vlnovou délkou kratší než 290 nm.

XIII.1.8.2.7 Zkušební koncentrace

Ryby jsou vystaveny za průtokových podmínek alespoň dvěma koncentracím zkušební látky ve vodě. Vyšší (nejvyšší) koncentrace zkušební látky se obvykle volí tak, aby byla na úrovni 1 % její asymptotické hodnoty akutní LC50 a aby byla desetkrát vyšší než je mez detekce této látky ve vodě při použití analytické metody. Nejvyšší zkušební koncentraci lze také stanovit dělením akutní 96hodinové LC50 příslušným poměrem akutní/chronická letální dávka (u některých chemikálií může koeficient ležet mezi 3 a 100). Je-li to možné, volí se druhá (další) koncentrace tak, aby se lišila od výše uvedené faktorem 10. Není-li to možné z důvodu kritéria 1 % z LC50 nebo z důvodu kritéria meze detekce, může být použit nižší faktor než 10 nebo by mělo být zváženo použití zkušební látky značené ^14C. Žádná koncentrace by neměla překročit rozpustnost látky.

Je-li použito rozpouštěcí činidlo, neměla by být jeho koncentrace vyšší než 0,1 ml/l a mělo by být stejné ve všech zkušebních nádržích. Jeho příspěvek, společně s příspěvkem zkušební látky, k celkovému obsahu organického uhlíku ve zkušební vodě by měl být znám. Avšak maximální snaha by měla být vynaložena k zamezení použití takovýchto látek.

XIII.1.8.2.8 Kontroly

Vedle zkušební série by měla být založena kontrola sestávající z ředicí vody, která popřípadě obsahuje rozpouštěcí činidlo, pokud bylo zjištěno, že toto činidlo nemá žádné účinky na ryby. Není-li tomu tak, měly by být založeny obě kontroly.

XIII.1.8.3 Četnost měření kvality vody

V průběhu zkoušky by měly být v každé nádrži měřeny množství rozpuštěného kyslíku, TOC, pH a teplota. Celková tvrdost a popřípadě salinita by měly být měřeny v kontrolách a v jedné nádrži s vyšší (nejvyšší) koncentrací. Množství rozpuštěného kyslíku a popřípadě salinita by měly být měřeny alespoň třikrát – na začátku, přibližně uprostřed a na konci fáze příjmu – a jednou týdně ve fázi vylučování. Hodnota TOC by měla být měřena na začátku zkoušky (24 hodin a 48 hodin před započetím fáze příjmu) před nasazením ryb a alespoň jednou týdně jak v průběhu fáze příjmu, tak v průběhu fáze vylučování. Teplota by měla být měřena denně, pH na začátku a na konci každé fáze a tvrdost vody jednou v průběhu zkoušky. Teplota by měla být měřena nejlépe nepřetržitě alespoň v jedné nádrži.

XIII.1.8.4 Odběr vzorků a analýza ryb a vody

XIII.1.8.4.1 Časový rozvrh odebírání vzorků ryb a vody

Voda ze zkušebních nádrží se pro stanovení koncentrace zkušební látky odebírá před nasazením ryb a během fáze příjmu i během fáze vylučování. Voda se odebírá alespoň ve stejnou dobu jako ryby a před krmením. Během fáze příjmu se stanovují koncentrace zkušební látky, aby se ověřilo, že jsou v souladu s kritérii validity.

Ryby se odebírají alespoň pětkrát během fáze příjmu a alespoň čtyřikrát během fáze vylučování. Vzhledem k tomu, že v mnoha případech bude obtížné s tímto počtem vzorků vypočítat rozumně přesný odhad hodnoty BCF, zejména jde-li o jinou než jednoduchou kinetiku prvního řádu, může být účelné odebírat vzorky v obou fázích častěji (viz příloha 4). Dodatečné vzorky se uloží a analyzují až poté, co se výsledky prvního kola analýz ukáží jako nedostatečné pro výpočet hodnoty BCF o požadované přesnosti.

Příklad přijatelného časového rozvrhu odběru vzorků je uveden v příloze 4. Jiné plány lze snadno odvodit pomocí jiné předpokládané hodnoty Pov, jejíž pomocí se vypočítá expoziční doba pro 95% příjem.

V odběru vzorků se pokračuje během fáze příjmu do ustavení rovnovážného stavu nebo po dobu 28 dnů, podle toho, co nastane dříve. Není-li rovnovážného stavu dosaženo do 28 dnů, v odběru se vzorků se pokračuje do ustavení rovnovážného stavu nebo do 60 dnů, podle toho, co nastane dříve. Před zahájením fáze vylučování se ryby přemístí do čistých nádrží.

XIII.1.8.4.2 Odběr vzorků a příprava vzorků

Vzorky vody pro analýzy se odebírají například odsáváním potrubím z inertního materiálu ze středu zkušební nádrže. Vzhledem k tomu, že se biologicky nedostupná frakce zkušební látky nedá často oddělit od biologicky dostupné frakce ani filtrací, ani odstředěním (zejména v případě superlipofilních chemikálií, tj. chemikálií s log Pov > 5) (1), (5), nemohou být vzorky takto zpracovány. Namísto toho je třeba učinit opatření pro to, aby nádrže byly udržovány co nejčistší, a obsah organického uhlíku by měl být pravidelně monitorován jak během fáze příjmu, tak během fáze vylučování.

Při každém odběru se z nádrží odebere vhodný počet ryb (obvykle alespoň čtyři). Odebrané ryby se rychle omyjí pod tekoucí vodu, osuší se „do sucha“, ihned se usmrtí nejvhodnější humánní metodou a zváží se.

Ryby a voda se pokud možno analyzují ihned po odběru s cílem předejít degradaci nebo ztrátám a vypočítat přibližné rychlosti příjmu a vylučování ještě v průběhu zkoušky. Okamžitá analýza rovněž zabrání zpoždění ve stanovení plató při jeho dosažení.

Nedojde-li k okamžité analýze, vzorky se vhodným způsobem uchovají. Před zahájením studie je třeba zjistit informace o řádné metodě uchovávání vzorků s ohledem na dotyčnou zkušební látku – například hluboké zmrazení, udržování při 4 °C, délka uchovávání, vyluhování atd.

XIII.1.8.4.3 Kvalita analytické metody

Vzhledem k tomu, že celý postup je určen hlavně správností, přesností a citlivostí analytické metody použité pro analýzu zkušební látky, je třeba experimentálně kontrolovat, že přesnost a reprodukovatelnost chemické analýzy a rovněž výtěžek zkušební látky jak z vody, tak ze vzorů ryb jsou pro dotyčnou analytickou metodu dostatečné. Kontroluje se také, zda se zkušební látka nevyskytuje v použité ředicí vodě.

Hodnoty Cw a Cf se podle potřeby korigují podle výtěžku a pozaďových hodnot kontrol. Vzorky ryb a vody se zpracovávají tak, aby se minimalizovala kontaminace a ztráty (např. v důsledku absorpce odběrovým zařízením).

XIII.1.8.4.4 Analýza vzorků ryb

Je-li ve zkoušce použit materiál značený radioizotopy, je možné provést analýzu s celkovou aktivitou (tj. s výchozí látkou i s metabolity) nebo lze provést separaci, tak aby mohla být výchozí látka analyzována samostatně. V rovnovážném stavu nebo na konci fáze příjmu, podle toho, k čemu dojde dříve, mohou být stanoveny také hlavní metabolity. Je-li hodnota BCF vypočtená z celkové aktivity reziduí ≥ 1 000 %, může být účelné, a pro určité kategorie chemikálií, např. pesticidy, je to důrazně doporučeno, identifikovat a kvantifikovat produkty odbourávání představující ≥ 10 % celkového množství reziduí v tkáních ryb v rovnovážném stavu. Jsou-li produkty odbourávání představující ≥ 10 % celkové aktivity reziduí identifikovány a kvantifikovány, doporučuje se také identifikovat a kvantifikovat produkty odbourávání ve vodě.

Koncentrace zkušební látky by měla být obvykle stanovena pro každou jednotlivou zváženou rybu. Není-li to možné, mohou být vzorky při každém odběru sdružovány, avšak sdružování omezuje statistické postupy, které lze na data aplikovat. Pokud na specifickém statistickém postupu a na síle záleží, měl by být ve zkoušce nasazen dostatečný počet ryb vyhovující požadovanému sdružování a požadované síle (6), (7).

Hodnota BCF by měla být vyjádřena jako funkce celkové živé hmotnosti a v případě lipofilních látek také jako funkce obsahu tuku. Obsah tuku v rybách se stanoví pokud možno při každém odběru. Pro stanovení obsahu tuku by měla být použita vhodná metoda (odkazy 8 a 2 v příloze 3). Jako standardní metoda může být doporučena technika extrakce do chloroformu/methanolu (9). Různé metody nedávají stejné hodnoty (10), je proto důležité uvést podrobnosti o použité metodě. Je-li to možné, měla by být analýza tuků provedena na extraktu připravenému pro analýzu zkušební látky, neboť tuky musí být často před chromatografickou analýzou odstraněny. Obsah tuku v rybách (v mg/kg živé hmotnosti) na konci experimentu by se neměl lišit od obsahu na počátku od více než ±25 %. Měl by být uveden také podíl pevných látek v tkáních, aby bylo možné provést přepočet koncentrace tuků z živé hmotnosti na hmotnost sušiny.

XIII.2 DATA

XIII.2.1 Zpracování výsledků

Křivka příjmu zkušební látky se sestrojí vynesením její koncentrace v rybách nebo na nich (nebo ve specifikovaných tkáních) v průběhu fáze příjmu proti času v lineárním měřítku. Dosáhla-li křivka plató, tj. začíná být rovnoběžná s časovou osou, vypočítá se hodnota BCFss v rovnovážném stavu z poměru

Cf v rovnovážném stavu (střední hodnota)Cw v rovnovážném stavu (střední hodnota)

Není-li rovnovážného stavu dosaženo, je možné vypočítat hodnotu BCFss s dostatečnou přesností pro posouzení rizika z „rovnovážného stavu v 80% (1,6/k2) nebo 95% (3,0/k2) rovnováze. Také koncentrační faktor BCFk se stanoví jako poměr dvou rychlostních konstant prvního řádu k1/k2. Rychlostní konstanta vylučování se obvykle stanoví z křivky vylučování (tj. grafu poklesu koncentrace zkušební látky v rybách v čase). Rychlostní konstanta příjmu se poté vypočte pomocí hodnoty k2 a hodnoty Cf odvozené z křivky příjmu (viz také příloha 5). Upřednostňovanou metodou pro získání hodnoty BCFk a rychlostních konstant k1 a k2 je metoda nelineárního odhadu parametrů s využitím počítače (11). K výpočtu hodnot k1 a k2 lze jinak použít grafické metody. Není-li zjevně křivka vylučování křivkou prvního řádu, měly by být použity složitější modely (viz odkazy v příloze 3) a měl by být konzultován biostatistik.

XIII.2.2 Interpretace výsledků

Výsledky by měly být interpretovány opatrně v případě, že naměřené koncentrace zkušebních roztoků se pohybují na úrovních blízkých mezi detekce analytické metody.

Jasně vymezené křivky příjmu a úbytku jsou ukazatelem dobré kvality dat o bioakumulaci. Rozdíl konstant příjmu/vylučování pro dvě zkušební koncentrace by měl být nižší než 20 %. Pozorované významné rozdíly v rychlostech příjmu/vylučování mezi dvěma použitými zkušebními koncentracemi by měly být zaznamenány a mělo by být uvedeno jejich možné vysvětlení. Interval spolehlivosti hodnot BCF u dobře navržených studií se všeobecně blíží ±20 %.

XIII.3 ZPRÁVY

Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

XIII.3.1 Zkušební látka

— fyzikální povaha a popřípadě fyzikálně-chemické vlastnosti,

— chemické identifikační údaje (včetně obsahu organického uhlíku, je-li to třeba),

— v případě značení radioaktivními izotopy jejich přesná poloha a aktivita příměsí, vyjádřená v procentech.

XIII.3.2 Testovací druh

— vědecký název, kmen, zdroj, případné předběžné ošetření, aklimatizace, stáří, rozpětí velikostí atd.

XIII.3.3 Zkušební podmínky

— použitý zkušební postup (např. průtokový nebo semistatický),

— typ a charakteristiky použitého osvětlení a fotoperioda (fotoperiody),

— uspořádání zkoušky (např. počet a velikost zkušebních nádrží, rychlost výměny objemu vody, počet opakování, počet ryb v jednom opakování, počet zkušeních koncentrací, délka fází příjmu a vylučování, četnost odběru vzorků ryb a vzorků vody),

— metoda přípravy zásobních roztoků a častost jejich obnovování (je-li použito rozpouštěcí činidlo,musí být uvedena jeho koncentrace a jeho příspěvek k obsahu organického uhlíku ve vodě),

— nominální zkušební koncentrace, střední hodnoty naměřených koncentrací ve zkušebních nádržích, jejich směrodatné odchylky a metody jejich stanovení,

— zdroj ředicí vody, popis jakékoliv předchozí úpravy, výsledky jakéhokoliv prokazování schopnosti zkušebních ryb žít v této vodě a charakteristiky vody: hodnota pH, tvrdost, teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku, úroveň zbytkového chloru (je-li měřena), obsah celkového organického uhlíku, obsah suspendovaných látek, (popřípadě) salinita zkušebního média a výsledky jakýchkoliv jiných provedených měření,

— kvalita vody ve zkušebních nádržích, hodnota pH, tvrdost vody, obsah TOC, teplota a koncentrace rozpuštěného kyslíku,

— podrobné informace o krmení (například typ krmiva, zdroj, složení – alespoň pokud možno obsah tuku a bílkovin, podávané množství a četnost),

— informace o zpracování vzorků ryb a vody, včetně podrobností o přípravě, uchovávání, o extrakci a analytických postupech (a přesnosti), pokud jde o zkušební látku a obsah tuku (je-li měřen).

XIII.3.4 Výsledky

— výsledky jakýchkoliv provedených předběžných studií,

— úhyn kontrolních ryb a ryb v každé expoziční nádrži a jakékoliv pozorované neobvyklé chování,

— obsah tuku v rybách (je-li stanoven při zkoušce),

— křivky (včetně všech naměřených dat) příjmu a vylučování zkušební chemikálie rybami, doba dosažení rovnovážného stavu,

— hodnoty Cf a Cw (popřípadě se směrodatnými odchylkami a rozpětím) pro všechny odběry (hodnota Cf se vyjadřuje v µg/g živé hmotnosti (ppm) celého těla nebo specifikované tkáně, např. tuku, a Cw se vyjadřuje v µg/ml (ppm)); hodnoty Cw pro kontroly (měly by být uvedeny také hodnoty pozadí),

— bioakumulační faktor v rovnovážném stavu (BCFss) a/nebo kinetický koncentrační faktor (BCFk) a popřípadě 95% intervaly spolehlivosti pro rychlostní konstanty příjmu a vylučování (úbytku) (vše vztaženo na celý organismus a na celkový obsah tuku v rybě, je-li stanoven, nebo na její specifikovanou tkáň), intervaly spolehlivosti a směrodatné odchylky (jsou-li k dispozici) a metody výpočtu/analýzy dat pro každou použitou koncentraci zkušební látky,

— v případě použití látek značených radioaktivními izotopy a je-li to nutné, musí být uvedena akumulace jakýchkoliv detekovaných metabolitů,

— všechny zvláštnosti zkoušky, všechny odchylky od těchto postupů a ostatní relevantní informace.

Všem výsledkům typu „nedetekováno při uvedené mezi detekce“ by mělo být předcházeno předběžným odzkoušením metod a uspořádání experimentu, neboť takové výsledky nelze použít pro výpočet rychlostních konstant.

XIII.4 LITERATURA

(1) Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117-156.

(2) Bintein S., Devillers J., Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29-390.

(3) OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3.

(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.

(5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.

(6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.

(7) US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human or animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.

(8) Compaan H. (1980) in „The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation“, Ch. 2.3, Part II. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands.

(9) Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099-1105.

(10) Randall R. C., Lee H., Ozretich R. J., Lake J. L., Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp 1431-1436.

(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method - Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen, N. Nyholm.

(12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.

PŘÍLOHA 1

Chemické charakteristiky přijatelné ředicí vody

	Látka	Koncentrační limit
1	Nerozpuštěné látky	5 mg/l
2	Celkový obsah organického uhlíku	2 mg/l
3	Neionizovaný amoniak	1 µg/l
4	Zbytkový chlor	10 µg/l
5	Celkové organofosforové pesticidy	50 ng/l
6	Celkové organochlorové pesticidy a polychlorované bifenyly	50 ng/l
7	Celkový organický chlor	25 ng/l
8	Hliník	1 µg/l
9	Arsen	1 µg/l
10	Chrom	1 µg/l
11	Kobalt	1 µg/l
12	Měď	1 µg/l
13	Železo	1 µg/l
14	Olovo	1 µg/l
15	Nikl	1 µg/l
16	Zinek	1 µg/l
17	Kadmium	100 ng/l
18	Rtuť	100 ng/l
19	Stříbro	100 ng/l

PŘÍLOHA 2

Doporučené druhy ryb pro zkoušení

	Doporučený druh	Doporučené rozpětí zkušební teploty (°C)	Doporučená celková délka těla testovacích jedinců (cm)
1	Danio rerio1 (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan), danio pruhované	20 - 25	3,0 ± 0,5
2	Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque), střevle	20 - 25	5,0 ± 2,0
3	Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus), kapr obecný	20 - 25	5,0 ± 3,0
4	Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck and Schlegel), halančík japonský	20 - 25	4,0 ± 1,0
5	Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters), živorodka duhová	20 - 25	3,0 ± 1,0
6	Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque), slunečnice	20 - 25	5,0 ± 2,0
7	Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum), pstruh duhový	13 - 17	8,0 ± 4,0
8	Gasterosteus aculeatus (Teleostei Gasterosteidae) (Linnaeus), koljuška tříostná	18-20	3,0 ± 1,0

^1 Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B., Vol. 252, p. 231.

V různých zemích byly použity různé druhy estuarinních a mořských druhů, například:

ryba z čeledi Scienidae (Smuhovití)	Leiostomus xanthurus
halančík	Cyprinodon variegatus
ryba z čeledi Argentinidae (Stříbronicovití)	Menidia beryllina
ryba z čeledi Enbiotocidae (Příbojkovití)	Cymatogaster aggregata
platýz z čeledi Pleuronectidae	Parophrys vertulus
vranka z čeledi Cottidae	Leptocottus armatus
koljuška tříostná	Gasterosteus aculeeatus
mořčák z čeledi Moronidae	Dicentracus labrax
ouklej obecná	Alburnus alburnus

Dostupnost ryb

Sladkovodní ryby uvedené v seznamu se snadno chovají a/nebo jsou dobře dostupné po celý rok, zatímco dostupnost mořských nebo estuarijních ryb je omezena na určité země. Lze je množit a chovat buď v rybích farmách, nebo v laboratoři za kontrolovaných zdravotních a parazitologických podmínek tak, aby ryby byly zdravé a byly známého původu. Tyto ryby jsou dostupné v mnoha částech světa.

PŘÍLOHA 3

Předpověď délky fáze příjmu a fáze vylučování

• 1. Předpověď délky fáze příjmu

Před provedením zkoušky lze získat odhad hodnoty k2 a odtud lze získat dobu nezbytnou pro dosažení určitého stupně rovnovážného stavu (v procentech) z empirických vztahů mezi k2 a rozdělovacím koeficientem n-oktanol/voda (Pov) nebo mezi k2 a rozpustností ve vodě (s).

Odhad hodnoty k2 (den^-1) lze získat například z následujícího empirického vztahu (1):

log10k2=-0,414 log10Pov+1,47 r2=0,95	(1)

Další vztahy viz odkaz 2.

Není-li rozdělovací koeficient (Pov) znám, lze jej odhadnout (3) ze znalosti rozpustnosti látky ve vodě (s) pomocí vztahu:

log10Pov=0,862 log10s+0,710 r2=0,994	(2)

kde s = rozpustnost (v mol/l): (n = 36).

Tyto vztahy platí pouze pro chemikálie s hodnotou log Pov od 2 do 6,5 (4).

Dobu, za kterou dojde k dosažení určitého stupně rovnovážného stavu vyjádřeného v procentech, lze získat pomocí odhadu hodnoty k2, z obecné rovnice kinetiky popisující příjem a vylučování (kinetika prvního řádu):

dCfdt=k1.Cw-k2.Cf

nebo je-li Cw konstanta:

Cf=k1k2·Cw1-e-k2t	(3)

Blíží-li se rovnovážný stav (t→∞), může být rovnice 3 zjednodušena (5), (6) na

Cf=k1k2·Cw nebo Cf/Cw=k1/k2=BCF

Pak k1/k2· Cw přiblížením koncentrace v rybách v „rovnovážném stavu“ (Cf,s).

Rovnice 3 může být přepsána na rovnici:

Cf=Cf,s1-e-k2t nebo CfCfs=1-e-k2t	(4)

Použitím rovnice 4 lze předpovědět dobu potřebnou k dosažení určitého stupně rovnovážného stavu vyjádřeného v procentech, je-li hodnota k2 předem odhadnuta z rovnice 1 nebo 2.

Je pravidlem, že statisticky optimální délka fáze příjmu pro získání statisticky přijatelných dat (BCFk) je doba nezbytná k tomu, aby křivka sestrojená vynesením logaritmu koncentrace zkušební látky v rybách proti času v lineárním měřítku dosáhla svého středního bodu, popřípadě 1,6k2, neboli 80 % rovnovážného stavu, ale ne více než 3,0k2, neboli 95 % rovnovážného stavu (7).

Doba nezbytná pro dosažení 80 % rovnovážného stavu je při použití rovnice 4:

0,80=1-e-k2t80	nebo	t80=1,6k2	(5).

Podobně 95 % rovnovážného stavu je dosaženo:

t95=3,0k2	(6).

Například délka fáze příjmu (up) pro zkušební látku s log Pov = 4 je (při použití rovnic 1, 5 a 6):

log10k2=-0,414·4+1,47	k2=0,652 den-1

up (80 %) = 1,6/0,652, tj. 2,45 dnů (59 hodin)

nebo up (95 %) = 3,0/0,652, tj. 4,60 dnů (110 hodin).

Podobně pro zkušební látku s hodnotou s = 10^-5 mol/l (log(s) = 5,0) je délka fáze (při použití rovnic 1, 2, 5 a 6):

log10Pov=0,862 -5,0+0,710=5,02

log10k2=-0,414 5,02+1,47

k2 = 0,246 den^-1

up (80 %) = 1,6/0,246, tj. 6,5 dnů (156 hodin)

nebo up (95 %) = 3,0/0,246, tj. 12,2 dnů (293 hodin).

Rovnice

teq=6,54×10-3Pov + 55,31	(hodin)

může být eventuelně použita pro výpočet doby potřebné pro dosažení efektivního rovnovážného stavu (4).

• 1. Předpověď délky fáze vylučování

Předpověď doby nezbytné pro snížení obsahu látky v organismu na určitou procentuální úroveň počáteční koncentrace může být rovněž získána z obecné rovnice kinetiky popisující příjem a vylučování (kinetika prvního řádu) (1), (8):

V případě fáze vylučování se Cw předpokládá rovna nule. Rovnice může být zjednodušena na rovnici:

dCfdt=k1·CwneboCf=Cf,0·e-k2t

kde Ct,0 je koncentrace na počátku fáze vylučování. 50% vyloučení bude dosaženo v čase (t50):

CfCt,0=12=e-k2tnebot50=0,693k2

Podobně 95% vyloučení bude dosaženo v čase

t95=3,0k2

Je-li pro první fázi zvoleno dosažení 80% příjmu (1,6/k2) a pro fázi vylučování je zvoleno dosažení 95% úbytku (3,0/k2), je délka fáze vylučování přibližně dvojnásobkem délky fáze příjmu.

Je však důležité poznamenat, že odhady jsou založeny na předpokladu, že se příjem a vylučování řídí kinetikou prvního řádu. Neřídí-li se zjevně kinetikou prvního řádu, měl by být použit složitější model (např. odkaz (1)).

Literatura (k příloze 3)

(1) Spacie A., Hamelink J. L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, pp. 309-320.

(2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCFs derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.

(3) Chiou C. T., Schmedding D. W. (1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), pp. 4-10.

(4) Hawker D. W., Connell D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp. 701-707.

(5) Branson D. R., Blau G. E., Alexander H. C., Neely W. B. (1975). Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp. 785-792.

(6) Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W., Bourdeau P. H. Part 4.4, pp. 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd N.Y.

(7) Reilly P. M., Bajramovic R., Blau G. E., Branson D. R., Sauerhoff M. W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kisnetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp. 614-622.

(8) Könemann H., Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp. 3-19.

PŘÍLOHA 4

Teoretický příklad plánu odběru vzorků pro bioakumulační zkoušky látek s logPov = 4

| Odběr vzorků ryb | Plán dob odběru vzorků | Počet vzorků vody | Počet ryb na vzorek | | | | Minimální požadovaná četnost (dny) | Dodatečný odběr vzorků | | | | --- | --- | --- | --- | --- | | Fáze příjmu | −1 0 | | 2(*) 2 | Přídavek 45 až 80 ryb | | 1. | 0,3 | 0,4 | 2 (2) | 4 (4) | | 2. | 0,6 | 0,9 | 2 (2) | 4 (4) | | 3. | 1,2 | 1,7 | 2 (2) | 4 (4) | | 4. | 2,4 | 3,3 | 2 (2) | 4 (4) | | 5. | 4,7 | | 2 | 6 | | Fáze vylučování | | | | Přenesení ryb do vody neobsahující zkušební chemikálii | | 6. | 5,0 | 5,3 | | 4 (4) | | 7. | 5,9 | 7,0 | | 4 (4) | | 8. | 9,3 | 11,2 | | 4 (4) | | 9. | 14,0 | 17,5 | | 6 (4) |

(^*) Odběr vzorku vody po dodání alespoň tří „objemů nádrže“.

Hodnoty v závorkách jsou počty vzorků (vody, ryb), které mají být odebrány, je prováděn dodatečný odběr.

Poznámka: Předběžný odhad k2 pro logPov rovný 4,0 je 0,652 den^-1. Celková délka experimentu je stanovena na

3 × up = 3 × 4,6 dnů, tj. 14 dnů. Odhad hodnoty „up“ viz příloha 3.

PŘÍLOHA 5

Omezení modelu

U většiny bioakumulačních dat se předpokládá, že jsou „rozumně“ dobře popsány jednoduchým modelem se dvěma kompartmenty/dvěma parametry, jak je patrné z přímky, která aproximuje body pro koncentrace v rybách během fáze vylučování, je-li vynesena na semilogaritmickém papíru. (Nelze-li tyto body popsat přímkou, měl by být použit složitější model (viz například Spacie a Hamelik, odkaz 1 v příloze 3).

Grafická metoda stanovení rychlostní konstanty vylučování (úbytku) k2

Koncentrace zkušební látky nalezená v každém vzorku ryb se vynese na semi-logaritmickém papíru proti času odběru vzorků. Směrnice této přímky je rovna k2.

k2=lnCf1/Cf2t2-t1

[image omitted]

Je třeba si všimnout, že odchylky od přímky mohou znamenat složitější model vylučování, než je kinetika prvního řádu. Pro analýzu typů vylučování, které se odchylují od kinetiky prvního řádu, mohou být použity grafické metody.

Grafická metoda stanovení rychlostní konstanty příjmu k1

Při dané konstantě k2 se k1 vypočte následujícím způsobem:

k1=Cfk2Cw x 1-e-k2t	(1)

Hodnota Cf se odečte ze středního bodu hladké křivky příjmu vytvořené vynesením logaritmu koncentrace proti času (v lineárním měřítku).

Metoda výpočtu rychlostních konstant příjmu a vylučování (úbytku) s využitím počítače

Upřednostňovanou metodou pro získání hodnoty bioakumulačního faktoru a rychlostních konstant k1 a k2 je metoda nelineárního odhadu parametrů s využitím počítače. Těmito programy se naleznou hodnoty k1 a k2 založené na sadě po sobě jdoucích dat koncentrací a na modelu:

Cf=Cw·k1k2 x 1-e-k2t	0<t<tc	(2)
Cf=Cw·k1k2 x e-k2t-tc - e-k2t	t<tc	(3)
---	---	---

kde tc = čas konce fáze příjmu.

Tento přístup poskytuje odhady směrodatné odchylky k1 a k2.

Vzhledem k tomu, že ve většině případů lze odhadnout k2 z křivky vylučování s relativně vysokou přesností a vzhledem k tomu, že mezi těmito dvěma parametry k1 a k2 existuje silná korelace, jsou-li odhadovány současně, může být účelné nejdříve vypočítat k2 pouze z dat vylučování a následně vypočítat k1 z dat příjmu pomocí nelineární regrese.

XIV. METODA PRO STANOVENÍ RŮSTU NA NEDOSPĚLÝCH RYBÁCH – metoda C.14 podle přílohy směrnice Komise 2001/59/ES ze dne 6. srpna 2001, kterou se po dvacáté osmé přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování správních a právních púředpúsů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (dále jen „směrnice 2001/59/ES“)

XIV.1 METODA

Metoda růstové zkoušky pro stanovení toxicity je replikou metody OECD TG 215 (2000).

XIV.1.1 ÚVOD

Zkouška je určena k posouzení účinků dlouhodobé expozice chemickým látkám na růst nedospělých ryb. Je založena na metodě pro posouzení účinků chemických látek na růst nedospělého pstruha duhového (Oncorynchus mykiss) při průtokových podmínkách, která byla vyvinuta v Evropské unii a testována v okružních testech (1, 3). Mohou být použity také jiné dobře popsané druhy. Byly například získány zkušenosti z růstových zkoušek s daniem pruhovaným (Danio rerio) (2, 4, 5) a halančíkem japonským (Oryzias latipes) (6, 7, 8).

Viz také obecný úvod, část C.

XIV.1.2 DEFINICE

Nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (Lowest observed effect concentration, LOEC): je nejnižší zkoušená koncentrace zkoušené látky, při níž jsou u látky pozorovány významné účinky ve srovnání s kontrolou (na úrovni pravděpodobnosti falešně pozitivního hodnocení p < 0,05). Všechny zkoušené koncentrace vyšší než LOEC musí mít stejné nebo vážnější škodlivé účinky, než účinky pozorované při koncentraci LOEC.

NOEC (no observed effect concentration, koncentrace bez pozorovaných účinků): je zkušební koncentrace bezprostředně nižší než LOEC.

ECx: je pro tuto metodu koncentrace zkoušené látky, která vyvolává x% změnu rychlosti růstu ryb ve srovnání s kontrolami.

Velikost násady: je živá hmotnost ryb v jednotce objemu vody.

Hustota obsádky: je počet ryb v jednotce objemu vody.

Individuální specifická rychlost růstu ryby: vyjadřuje rychlost růstu jedince vycházející z jeho výchozí hmotnosti.

Průměrná specifická rychlost růstu pro nádrž: vyjadřuje střední rychlost růstu populace v nádrži při určité koncentraci.

Pseudospecifická rychlost růstu: vyjadřuje rychlost růstu jednotlivce vycházející ze střední počáteční hmotnosti populace v nádrži.

XIV.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Nedospělé ryby v exponenciální fázi růstu se po zvážení umístí do zkušebních nádrží a vystaví se řadě subletálních koncentrací zkoušené látky nejlépe za průtokových podmínek, nebo, pokud možno za vhodných semistatických podmínek (statické podmínky s obnovením média). Zkouška trvá 28 dnů. Ryby se krmí denně. Přísun potravy se řídí počáteční hmotností ryb a může být po 14 dnech nově vypočten. Na konci zkoušky se ryby opět zváží. Účinky na rychlost růstu se analyzují pomocí regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která vyvolává x% změnu rychlosti růstu, tj. ECx (např. EC10, EC20 nebo EC30). Data mohou být popřípadě porovnána s hodnotami pro kontrolní skupiny s cílem stanovit nejnižší koncentraci s pozorovanými účinky (LOEC) a tím i koncentraci bez pozorovaných účinků (NOEC).

XIV.1.4 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE

Výsledky zkoušky akutní toxicity (viz zkušební metoda C.1) provedené nejlépe na druhu zvolenému pro tuto zkoušku již musí být předloženy. To znamená, že jsou známy rozpustnost zkoušené látky ve vodě a tlak jejích par a je k dispozici vhodná analytická metoda pro kvantitativní stanovení látky ve zkušebních roztocích, a to se známou a doloženou správností a známou mezí stanovitelnosti.

Užitečnými informacemi jsou strukturní vzorec, čistota látky, její stálost ve vodě a na světle, pKa, Po/v a výsledky zkoušky snadné biologické rozložitelnosti (viz zkušební metoda C.4).

XIV.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY

Má-li být zkouška platná, musí být splněny následující podmínky:

— mortalita v kontrolních zkouškách nesmí být na konci zkoušky větší než 10 %,

— nárůst střední hodnoty hmotnosti ryb v kontrolní skupině (skupinách) musí být dostatečný na to, aby umožnil rozeznat minimální významnou změnu rychlosti růstu. Okružní test (3) ukázal, že u pstruha duhového musí střední hmotnost ryb v kontrolních skupinách vzrůst alespoň o polovinu (tj. o 50 %) jejich počáteční hmotnosti za 28 dnů; např. počáteční hmotnost: 1 g/rybu (= 100 %), konečná hmotnost po 28 dnech: ≥ 1,5 g/rybu (≥ 150 %),

— koncentrace rozpuštěného kyslíku musí dosahovat alespoň 60 % hodnoty nasycení vzduchem (ASV) po celou dobu zkoušky,

— teplota vody se po celou dobu zkoušky nesmí mezi zkušebními nádržemi lišit o více než ± 1 °C a měla by být udržována v rozpětí 2 °C v rozsahu teplot stanovených pro zkušební druh (dodatek 1).

XIV.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

XIV.1.6.1 Přístroje a pomůcky

Normální laboratorní vybavení a zejména:

• a) oxymetr a pH metr;

• b) vybavení pro stanovení tvrdosti vody a alkality;

• c) vhodné zařízení pro regulaci teploty a pro její pokud možno nepřetržité sledování;

• d) nádrže z chemicky inertního materiálu o vhodném objemu vzhledem k doporučenému nasazování a obsádce (viz bod 1.8.5 a dodatek 1);

• e) vhodné přesné váhy (tj. vážící s přesností na ± 0,5 %).

XIV.1.6.2 Voda

Jako zkušební voda může být použita jakákoli voda, v níž zkušební druh dlouhodobě přežívá a roste. Měla by mít po celou dobu zkoušky stejnou kvalitu. Hodnota pH vody by měla být v rozmezí 6,5 až 8,5, avšak během zkoušky by se pH nemělo lišit o více než ± 0,5. Doporučuje se tvrdost nad 140 mg/l (jako CaCO3). S cílem zajistit, aby ředicí voda neměla nadměrný vliv na výsledek zkoušky (například v důsledku tvorby komplexů zkušební látky), by měly být v určitých intervalech odebírány vzorky k analýze. Je-li kvalita ředicí vody relativně konstantní, mělo by být stanovení těžkých kovů (např. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd a Ni), hlavních aniontů a kationtů (např. Ca, Mg, Na, K, Cl a SO4), pesticidů (např. celkový obsah organických fosforových a chlorových pesticidů), celkový obsah organického uhlíku a suspendovaných látek provedeno např. každé tři měsíce. Je-li prokázáno, že kvalita vody je konstantní po dobu alespoň jednoho roku, mohou být stanovení méně častá a intervaly lze prodloužit (např. každých šest měsíců). Některé chemické charakteristiky přijatelné ředicí vody jsou uvedeny v dodatku 2.

XIV.1.6.3 Zkušební roztoky

Zkušební roztoky o zvolených koncentracích se připraví ředěním zásobního roztoku.

Zásobní roztok by měl být připraven nejlépe jednoduchým mechanickým mícháním nebo protřepáváním zkoušené látky v ředicí vodě (např. mechanickým mícháním nebo sonifikací). Pro dosažení vhodné koncentrace zásobního roztoku mohou být použity saturační kolony.

V některých případech může být pro vytvoření zásobního roztoku o vhodné koncentraci nezbytné použití rozpouštědel nebo dispergátorů (solubilizačních činidel). Ke vhodným rozpouštědlům patří aceton, ethanol, methanol, dimethylsulfoxid, dimethylformamid a triethylenglykol. Ke vhodným dispergátorům patří Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% methylcelulosa a HCO-40. Snadno biologicky rozložitelná činidla (např. aceton) nebo vysoce těkavé sloučeniny je třeba používat rozvážně, neboť mohou způsobit problémy s růstem bakterií v průtokových zkouškách. Je-li použito solubilizační činidlo, nesmí mít významné účinky na růst ryb ani viditelné nepříznivé účinky na nedospělé ryby, což musí být prokázáno na kontrolní skupině vystavené pouze rozpouštědlu.

Při průtokových zkouškách je pro zajištění řady koncentrací nezbytný systém, který nepřetržitě dávkuje a ředí zásobní roztok zkoušené látky (např. dávkovací čerpadlo, zařízení pro proporcionální ředění, saturační systém). Průtok zásobních roztoků a ředicí vody by měl být v průběhu zkoušky kontrolován v určitých intervalech, nejlépe denně, a neměl by se v průběhu zkoušky měnit o více než 10 %. Okružní test (3) ukázal, že u pstruha duhového je přijatelná výměna vody 6 litrů na gram ryb za den (viz bod 1.8.2.2).

U semistatických zkoušek (s obnovením média) bude častost obnovování média záviset na stálosti zkoušené látky, avšak doporučuje se obnovovat vodu denně. Není-li podle předběžných zkoušek stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkoušené látky mezi obnoveními média stálá, (tj. nepohybuje se v intervalu 80 – 120 % nominální koncentrace nebo klesá pod 80 % naměřené počáteční koncentrace), měla by být zvážena průtoková zkouška.

XIV.1.6.4 Výběr druhů

Pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss) je doporučeným druhem pro tuto zkoušku, neboť u něj bylo v okružních testech získáno nejvíce zkušeností (1, 3). Mohou však být použity jiné dobře popsané druhy, může však být nutné zkušební postup upravit, aby byly vytvořeny vhodné zkušební podmínky. Jsou například zkušenosti s daniem pruhovaným (Danio rerio) (4, 5) a halančíkem japonským (Oryzias latipes) (6, 7, 8). V takovém případě by měly být uvedeny v závěrečné zprávě důvody pro výběr druhu a experimentální podmínky.

XIV.1.6.5 Chov ryb

Testovací ryby by měly pocházet z jednoho chovu (nejlépe ze stejného tření), který se alespoň dva týdny před zkouškou udržuje v podmínkách kvality vody a osvětlení, které jsou podobné podmínkám použitým ve zkoušce. V průběhu chovu a v průběhu zkoušky by měly být krmeny množstvím potravy odpovídajícím minimálně 2 % tělesné hmotnosti za den a nejlépe 4 % tělesné hmotnosti za den.

Po 48hodinové aklimatizaci se zaznamená mortalita a použijí se následující kritéria:

— mortality vyšší než 10 % populace za sedm dnů: vyměnit celou obsádku;

— mortality od 5 % do 10 % populace: aklimatizace dalších sedm dnů; je-li mortalita během následujících sedmi dnů vyšší než 5 %, vymění se celá obsádka,

— mortalita nižší než 5 % populace za sedm dnů: obsádka se přijme.

Dva týdny před zkouškou nebo v průběhu zkoušky nesmí být léčeny u ryb žádné nemoci.

XIV.1.7 USPOŘÁDÁNÍ ZKOUŠKY

„Uspořádáním zkoušky“ se rozumí výběr počtu zkušebních koncentrací a jejich odstupňování, počet nádrží pro každou koncentraci a počet ryb v nádrži. Uspořádání by mělo být v ideálním případě zvoleno s ohledem na:

• a) cíl studie;

• b) metodu statistické analýzy, která bude použita;

• c) dostupnost a cenu prostředků pro experiment.

Požadováno je stanovení statistické významnosti, s jakou má být daná velikost změny (např. změny rychlosti růstu) rozeznána, nebo přesnost, s jakou má být odhadnuta hodnota ECx (např. x = 10, 20 nebo 30, pokud možno ne méně než 10). Bez toho nelze stanovit přesný rozsah studie.

Je důležité vzít na vědomí, že uspořádání, které je optimální při použití jedné metody statistické analýzy (nejlépe využívá prostředky), není nezbytně optimální pro jinou metodu. Doporučené uspořádání pro odhad LOEC/NOEC tedy nebývá stejné jako uspořádání pro analýzu regresí.

V mnoha případech se regresní analýze dává přednost před analýzou variance, a to z důvodů diskutovaných Stephanem a Rogersem (9). Není-li však nalezen vhodný regresní model (r^2 < 0,9), měl by být stanoven poměr NOEC/LOEC.

XIV.1.7.1 Uspořádání pro analýzu regresí

Pro uspořádání zkoušky, která má být analyzována regresí, jsou důležité tyto zřetele:

• a) koncentrace použité ve zkoušce musí v každém případě pokrývat koncentraci vyvolávající účinek (např. EC10,20,30) a rozsah koncentrací, při nichž dochází ke sledovanému účinku. Přesnost, s jakou mohou být odhadnuty koncentrace vyvolávajících účinek, bude nejlepší, bude-li koncentrace vyvolávající účinek ležet uprostřed rozsahu zkušebních koncentrací. Při výběru vhodných zkušebních koncentrací mohou být užitečné předběžné orientační zkoušky.

• b) aby mohl být vytvořen uspokojivý statistický model, měla by zkouška zahrnovat alespoň jednu kontrolní nádrž a pět dalších nádrží o různých koncentracích. Podle vhodnosti by při použití solubilizačního činidla měla být vedle zkušebních skupin nasazena jedna kontrolní skupina vystavená koncentraci solubilizačního činidla použité při nejvyšší zkušební koncentraci (viz body 1.8.3 a 1.8.4);

• c) může být použita vhodná geometrická nebo logaritmická řada koncentrací (10) (viz dodatek 3). Upřednostňuje se logaritmické stupňování koncentrací;

• d) je-li k dispozici více než šest nádrží, měly by být další nádrže použity buď pro duplicitní stanovení, nebo by měly být použity pro koncentrace rozložené v rozsahu koncentrací tak, aby se zmenšily rozestupy mezi koncentracemi. Obě použití lze doporučit stejnou měrou.

XIV.1.7.2 Uspořádání pro odhad NOEC/LOEC analýzou variance (ANOVA)

Pro každou koncentraci by měly být nejlépe k dispozici nádrže pro duplicitní stanovení, statistická analýza by měla být provedena pro každou jednotlivou nádrž (11). Bez duplicitních nádrží není možné zohlednit jinou variabilitu mezi nádržemi, než jaká je důsledkem rozdílů mezi jednotlivými rybami. Zkušenosti ale ukazují (12), že variabilita mezi nádržemi byla velmi malá ve srovnání s variabilitou v rámci nádrže (tj. mezi rybami). Relativně přijatelnou alternativou je tedy provedení statistické analýzy pro jednotlivé ryby.

Zpravidla se použije alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 3,2.

Provádí-li se zkouška s duplicitními nádržemi, měl by být počet duplicitních kontrolních nádrží, a tedy i počet ryb, dvojnásobkem počtu ryb pro každou zkoušenou koncentraci, který by měl být pro všechny koncentrace stejný (13, 14, 15). Nejsou-li naproti tomu duplicitní nádrže použity, měl by být v kontrolní skupině stejný počet ryb jako ve skupině pro každou zkušební koncentraci.

Je-li ANOVA založena na nádržích namísto jednotlivých rybách (což by znamenalo buď ryby jednotlivě označit nebo použít „pseudospecifickou“ rychlost růstu (viz bod 2.1.2)), je nezbytné počet nádrží dostatečně znásobit, aby bylo možné stanovit odchylku pro nádrže v rámci jednotlivé koncentrace. To znamená, že by měl být počet stupňů volnosti pro chybu v analýze variance alespoň 5 (11). Jsou-li duplicitně použity pouze kontroly, existuje nebezpečí, že bude variabilita chyby vychýlena, neboť může narůstat se střední hodnotou dotyčné rychlosti růstu. Vzhledem k tomu, že rychlost růstu s největší pravděpodobností klesá s rostoucí koncentrací, povede to k nadhodnocení variability.

XIV.1.8 POSTUP

XIV.1.8.1 Výběr a vážení testovacích ryb

Je důležité minimalizovat rozdíly v hmotnostech ryb na začátku zkoušky. Vhodná rozpětí velikostí ryb různých druhů doporučených pro tuto zkoušku jsou uvedena v dodatku 1. Rozpětí individuálních hmotností na začátku zkoušky by mělo být pro celou násadu ryb použitých ve zkoušce nejlépe ± 10 % aritmetického průměru hmotností a v žádném případě by nemělo překročit 25 %. Doporučuje se zvážit před zkouškou menší vzorek ryb s cílem odhadnout střední hodnotu hmotnosti.

24 hodin před zahájením zkoušky se obsádka ryb přestane krmit. Poté se provede náhodný výběr ryb. Za použití běžného anestetika (např. vodný roztok trikainmethansulfonátu (MS 222) o koncentraci 100 mg/l neutralizovaný přídavkem dvou dílů hydrogenuhličitanu sodného na jeden díl MS 222) se ryby jednotlivě s přesností uvedenou v dodatku 1 zváží za účelem stanovení živé hmotnosti (po osušení do sucha). Ryby s hmotností v požadovaném rozsahu se náhodně rozdělí do nádrží. Zaznamená se celková živá hmotnost ryb v každé zkušební nádrži. Při manipulaci s rybami za použití anestetik (včetně osušení a zvážení) může u nedospělých ryb, a zejména u druhů o malé velikosti, dojít ke stresu a poranění. S nedospělými rybami se tedy musí manipulovat s nejvyšší opatrností, aby nedošlo u zkušebních ryb ke stresu a poranění.

Ryby se opět zváží po 28 dnech zkoušky (viz bod 1.8.6). Považuje-li se však za nezbytné nově vypočítat přísun potravy, mohou být ryby opět zváženy po 14 dnech zkoušky (viz bod 1.8.2.3). Ke stanovení změn velikosti ryb, na jejichž základě se upravuje přísun potravy, může být použita jiná metoda, např. fotografická metoda.

XIV.1.8.2 Podmínky expozice

XIV.1.8.2.1 Délka expozice

Zkouška trvá více než 28 dnů.

XIV.1.8.2.2 Velikost násady a hustota obsádky

Je důležité, aby velikost násady a hustota obsádky vyhovovaly použitému zkušebnímu druhu (viz dodatek 1). Je-li hustota obsádky příliš vysoká, dojde ke stísnění vedoucímu ke snížené rychlosti růstu a popřípadě k nemocem. Je-li příliš nízká, může vyvolat teritoriální chování, což by mohlo rovněž ovlivnit růst. V každém případě by měla být velikost násady tak nízká, aby bylo možné udržet koncentraci rozpuštěného kyslíku na alespoň 60 % ASV bez provzdušňování. Okružní test (3) ukázal, že u pstruha duhového je velikost násady 16 ryb o hmotnosti 3 – 5 g do objemu 40 litrů přijatelná. Doporučené obnovování vody během zkoušky je 6 litrů na gram ryb za den.

XIV.1.8.2.3 Krmení

Ryby by měly být krmeny dostatečným množstvím vhodného krmiva (dodatek 1), aby byla umožněna přijatelná rychlost růstu. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k růstu mikroorganismů a k zakalení vody. U pstruha duhového by mělo těmto požadavkům vyhovovat množství odpovídající 4 % jejich tělesné hmotnosti za den (3, 16, 17, 18). Denní množství může být rozděleno na dva stejné podíly a podáno rybám dvakrát za den s odstupem alespoň pěti hodin.

Množství se řídí počáteční hmotností ryb v jednotlivé zkušební nádrži. Ryby se opět zváží 14. den a množství se nově vypočte. 24 hodin před vážením se ryby přestanou krmit. Nespotřebovaná potrava a výkaly se ze zkušebních nádrží každý den odstraní důkladným odsátím ze dna každé nádrže.

XIV.1.8.2.4 Světlo a teplota

Fotoperioda a teplota vody by měly vyhovovat zkušebním druhům (dodatek 1).

XIV.1.8.3 Zkušební koncentrace

Obvykle je nutných pět koncentrací zkoušené látky, a to bez ohledu na uspořádání zkoušky (viz bod 1.7.2). Při volbě vhodných zkušebních koncentrací by měla pomoci předcházející znalost toxicity zkoušené látky (např. ze zkoušek akutní toxicity nebo z orientačních studií). Použije-li se méně než pět koncentrací, mělo by být uvedeno odůvodnění. Nejvyšší zkušební koncentrace by neměla překročit rozpustnost látky ve vodě.

Použije-li se k usnadnění přípravy zásobního roztoku solubilizační činidlo, neměla by být jeho konečná koncentrace vyšší než 0,1 ml/l a měla by být ve všech zkušebních nádržích stejná (viz bod 1.6.3). Měla by však být vynaložena maximální snaha takové látky nepoužívat.

XIV.1.8.4 Kontrolní skupiny

Počet kontrolních skupin v ředicí vodě závisí na uspořádání zkoušky (viz body 1.7 až 1.7.2). Použije-li se solubilizační činidlo, měl by být nasazen stejný počet kontrolních skupin se solubilizačním činidlem jako s ředicí vodou.

XIV.1.8.5 Častost analytických stanovení a měření

Během zkoušky se v pravidelných intervalech (viz níže) stanovují koncentrace zkoušené látky

Při průtokových zkouškách se průtok zásobních roztoků toxické látky a ředicí vody kontroluje v určitých intervalech, nejlépe denně, a neměl by se v průběhu zkoušky měnit o více než 10 %. Očekávají-li se změny koncentrace zkoušené látky v rozmezí ± 20 % nominálních hodnot (tj. od 80 – 120 %, viz body 1.6.2 a 1.6.3), doporučuje se, aby byly nejnižší a nejvyšší zkoušené koncentrace analyzovány na začátku zkoušky a poté v týdenních intervalech. U zkoušek, u nichž se (na základě dat o stálosti látky) nepředpokládá, že se bude koncentrace zkoušené látky pohybovat v rozmezí ± 20 % nominální hodnoty, je nezbytné analyzovat všechny zkušební koncentrace, a to stejně často jako u stabilních látek.