Vyhláška o opatřeních k zabezpečení ochrany proti zavlékání a šíření původce bakteriální kroužkovitosti bramboru a původce bakteriální hnědé hniloby

§ 1

Předmět úpravy

Tato vyhláška zapracovává příslušné předpisy Evropských společenství^1) a upravuje opatření, která se uplatňují na území České republiky proti šíření Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. subsp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., původci bakteriální kroužkovitosti bramboru, a Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., původci bakteriální hnědé hniloby, aby se

• a) zabránilo výskytu a šíření,

• b) zjistilo místo výskytu a rozsah rozšíření a

• c) při zjištění výskytu se zabránilo jejich šíření a prováděla se ochranná opatření s cílem jejich eradikace.

§ 2

Pojmy

Pro účely této vyhlášky se rozumí:

• a) původcem kroužkovitosti – bakterie Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al.,

• b) původcem hnědé hniloby – bakterie Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.,

• c) hostitelskými rostlinami –

• 1. původce kroužkovitosti – brambor (Solanum tuberosum L.) s výjimkou semen bramboru, a ostatní rostliny z čeledi lilkovitých (Solanaceae), u nichž byla potvrzena možnost infekce původcem kroužkovitosti v přirozených podmínkách,

• 1. původce hnědé hniloby – brambor (Solanum tuberosum L.) s výjimkou semen bramboru, rajče jedlé (Lycopersicon lycopersicum L.) kromě semen a plodů, lilek potměchuť (Solanum dulcamara L.) a ostatní rostliny z čeledi lilkovitých (Solanaceae), u nichž byla potvrzena možnost infekce původcem hnědé hniloby v přirozených podmínkách,

• d) detekčním průzkumem – průzkum zaměřený na zjišťování výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby v určitém území nebo v určité partii,

• e) vymezovacím průzkumem – průzkum k určení rozsahu a původu zamoření původcem kroužkovitosti nebo původcem hnědé hniloby, k určení způsobu šíření infekce a k určení hranic území, na které se vztahují mimořádná rostlinolékařská opatření podle § 76 zákona,

• f) pravděpodobným zamořením původcem kroužkovitosti nebo původcem hnědé hniloby – podezření z výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby v rostlině, zásilce, partii, zařízení, stroji, dopravním prostředku, skladu nebo jejich části a veškerých jiných předmětech včetně obalového materiálu, podle § 11 odst. 1 zákona,

• g) možným rozšířením původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby – podezření z výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby na pozemku, v objektu anebo v území, podle § 11 odst. 1 zákona,

• h) zamořením původcem kroužkovitosti nebo původcem hnědé hniloby – výskyt původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby podle § 11 odst. 1 zákona,

• i) karanténním územím – území vymezené Státní rostlinolékařskou správou (dále jen „rostlinolékařská správa“), na které se vztahují mimořádná rostlinolékařská opatření podle § 76 odst. 1 zákona z důvodu potvrzení výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby,

• j) bezpečnostní zónou – území vymezené rostlinolékařskou správou, na které se vztahují mimořádná rostlinolékařská opatření podle § 76 zákona z důvodu podezření z výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby,

• k) klonově příbuznou partií – partie hostitelské rostliny, která vznikla vegetativním množením z jedné původní partie; přitom se za:

• 1. sesterské klonově příbuzné partie považují klonově příbuzné partie, které vznikly v témže roce vegetativním množením z jediné rodičovské partie, v případě rajčete rostliny, které vyrostly ze stejné partie osiva,

• 1. rodičovskou klonově příbuznou partii považuje partie klonově příbuzná sesterským klonově příbuzným partiím, které z ní bezprostředně vznikly.

§ 3

Průzkum výskytu původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby

(1) Rostlinolékařská správa provádí každoročně v souladu s § 10 odst. 1 zákona systematický průzkum výskytu původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby v rozsahu podle odstavců 2 až 7.

(2) Detekčnímu průzkumu výskytu původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby podléhají

• a) rozmnožovací materiál bramboru^2) původem z České republiky v rozsahu podle § 8 odst. 2,

• b) namátkově vybrané partie rozmnožovacího materiálu bramboru^2) původem ze členských států Evropské unie (dále jen „členský stát“),

• c) namátkově vybrané partie nesadbových brambor původem z České republiky a z ostatních členských států,

• d) všechny partie bramboru vypěstované v bezpečnostní zóně vymezené podle § 5 odst. 1 písm. c).

(3) Vymezovacímu průzkumu na výskyt původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby podléhají všechny partie hostitelských rostlin označené jako podezřelé z výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby a všechny partie hostitelských rostlin vypěstované v karanténním území vymezeném podle § 5 odst. 1 písm. c).

(4) Zjišťování původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby při rostlinolékařské kontrole zásilek dovážených ze třetích zemí a vyvážených do třetích zemí podléhají

• a) všechny dovážené partie rozmnožovacího materiálu bramboru^2) a namátkově vybrané partie ostatních brambor,

• b) všechny partie bramboru určené k vývozu do třetích zemí.

(5) Detekčnímu průzkumu na výskyt původce hnědé hniloby navíc podléhají

• a) porosty rostlin rajčete určených k dalšímu pěstování,

• b) vodní zdroje používané k závlaze hostitelských rostlin původce hnědé hniloby včetně doprovodných hostitelských rostlin a odpadní vody ze zpracovatelských podniků, které průmyslově zpracovávají hlízy bramboru, popřípadě také pevné odpady z těchto podniků.

(6) Vymezovacímu průzkumu výskytu původce hnědé hniloby navíc podléhají v případě podezření z výskytu nebo potvrzení jeho výskytu vodní zdroje používané k závlaze partií podezřelých z výskytu a plevelné hostitelské rostliny, popřípadě také pěstební substrát v místech produkce, odkud tyto partie pocházejí.

(7) Výskyt původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby se zjišťuje

• a) laboratorním testováním vzorků hlíz bramboru odebraných v případech uvedených v odstavci 2 písm. a) a b), odstavci 3 a v odstavci 4 písm. b) z porostů nebo ze skládek, v případě uvedeném v odstavci 4 písm. a) z dovážených partií,

• b) prohlídkou celých rostlin bramboru a řezu dužninou hlíz, v porostech nebo ve skládkách, popřípadě také laboratorním testováním vzorků hlíz bramboru, v případech uvedených v odstavci 2 písm. c) a d),

• c) prohlídkou porostů rajčete ve vhodnou dobu s následným laboratorním testováním vzorků rostlin s příznaky napadení původcem hnědé hniloby v případech uvedených v odstavci 5 písm. a),

• d) laboratorním testováním vzorků vody, pěstebního substrátu, pevných odpadů nebo hostitelských rostlin pobřežní vegetace v případě uvedeném v odstavci 5 písm. b) a v odstavci 6.

(8) Způsob prohlídky partie a počet, původ, složení a dobu odběru vzorků při průzkumu, prováděném podle odstavců 2 až 7, rozsah tohoto průzkumu a způsob předávání informací o odebraných a testovaných vzorcích stanovuje v souladu s § 10 odst. 1 zákona rostlinolékařská správa na základě uznávaných vědeckých a statistických zásad a biologie původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby, s přihlédnutím k systémům produkce brambor a dalších hostitelských rostlin a v závislosti na aktuální situaci ve výskytu anebo na míře rizika zavlečení původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby a zveřejní ve Věstníku Státní rostlinolékařské správy (dále jen „Věstník“). Testování odebraných vzorků pro zjištění a určení původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby se provádí způsobem stanoveným v příloze č. 1 nebo stanoveným rostlinolékařskou správou v souladu s § 10 odst. 1 zákona a zveřejněným ve Věstníku.

(9) K průzkumu prováděnému podle odstavců 2 a 4 lze využít rovněž vzorky úředně odebrané anebo testované fyzickou nebo právnickou osobou, pověřenou k této činnosti Ministerstvem zemědělství podle § 71 odst. 1 písm. b) zákona nebo rostlinolékařskou správou podle § 72 odst. 5 písm. i) zákona, pokud bude zajištěno na základě pravidelného dohledu této správy, že vzorky budou odebírány a testovány způsobem stanoveným podle odstavce 8.

(10) Výsledky průzkumu prováděného podle odstavců 2 až 6 oznamuje písemně rostlinolékařská správa bez zbytečného odkladu právnické nebo fyzické osobě, která vlastní příslušnou partii bramboru nebo rajčete a nebo je oprávněna tuto partii uvádět na trh nebo ji pěstuje nebo pěstovala, v případě rozmnožovacího materiálu^2) bramboru a rajčete také Ústřednímu kontrolnímu a zkušebnímu ústavu zemědělskému.

(11) Podrobnosti o provádění průzkumu podle odstavců 2 až 8 předkládá rostlinolékařská správa v souladu s § 10 odst. 5 zákona jednou ročně v rozsahu stanoveném v příloze č. 2 části A ostatním členským státům a Komisi za účelem zajištění srovnatelné úrovně potvrzování nepřítomnosti původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby mezi členskými státy. Výsledky úředních průzkumů provedených podle odstavců 2 až 6 oznamuje rostlinolékařská správa jednou ročně ostatním členským státům a Komisi, a to v případě průzkumu v rozmnožovacím materiálu bramboru,^2) množeném pouze pro výsadbu na pozemcích množitele, do 1. září, v ostatních případech do 1. června. Údaje oznámení o podrobnostech a výsledcích průzkumu, týkající se porostů hostitelských rostlin, se vztahují vždy k produkci předchozího roku. Podrobnosti tohoto oznámení jsou důvěrné.

§ 4

Opatření při zjištění podezření z výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby

(1) Za podezření z výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby se v souladu s § 11 odst. 1 zákona považuje

• a) rostlinolékařskou správou ověřené zjištění vizuálních příznaků napadení těmito škodlivými organismy a v případě původce hnědé hniloby pozitivní výsledek rychlého screeningového testu podle přílohy č. 1 oddílu I číslo 1 a oddílu II, nebo

• b) pozitivní výsledek screeningového testu provedeného rostlinolékařskou správou nebo pod jejím dohledem způsobem stanoveným v příloze č. 1.

(2) V případě podezření z výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby rostlinolékařská správa v rámci odborného šetření podle § 76 odst. 7 zákona a zvláštního právního předpisu^3) zajistí provedení úředního laboratorního testování, a to způsobem stanoveným podle § 3 odst. 8 a při dodržení podmínek stanovených v příloze č. 2 části B, s cílem toto podezření potvrdit nebo vyvrátit.

(3) Rostlinolékařská správa zahájí neodkladně po zjištění podezření z výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby odborné šetření podle § 76 odst. 2 zákona za účelem zjištění původu podezřelého výskytu a v souladu s § 11 odst. 1 zákona

• a) zakáže přesun všech partií nebo zásilek, ze kterých byly odebrány vzorky, s výjimkou těch, které jsou podrobeny opatření pod dohledem rostlinolékařské správy, které vylučuje zjistitelné riziko rozšíření původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby, a

• b) nařídí vhodná opatření založená na stupni odhadovaného rizika dalšího možného šíření původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby s cílem tomuto šíření předejít včetně zákazu přesunu nebo zajištění úředního dohledu nad přesunem všech ostatních partií hostitelských rostlin na pozemcích a v objektech spojených s podezřením z výskytu, popřípadě i mimo tyto pozemky a objekty.

(4) Při podezření na nebezpečí zamoření partií hostitelských rostlin nebo, v případě původce hnědé hniloby, povrchových vod původem z jiného členského státu nebo v některém jiném členském státě, sdělí rostlinolékařská správa neprodleně úřední rostlinolékařské službě příslušného členského státu podrobnosti týkající se tohoto podezření a bude s tímto státem vhodným způsobem spolupracovat.

(5) Pokud bude o podezření z výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby, které může mít původ v České republice nebo které může Českou republiku ohrozit, informována Česká republika, nařídí rostlinolékařská správa vhodná opatření podle odstavců 2 a 3.

§ 5

Opatření při potvrzení výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby

(1) Pokud úřední laboratorní testování odebraných vzorků způsobem stanoveným podle § 3 odst. 8 potvrdí výskyt původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby, rostlinolékařská správa v souladu s § 76 odst. 2 zákona a s přihlédnutím k aktuálním vědeckým výsledkům, biologii původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby a ke způsobu pěstování, uvádění na trh a průmyslového zpracování hostitelských rostlin

• a) označí za zamořené rostliny, zásilku, anebo partii, a zařízení, stroje, dopravní prostředky, sklady nebo jejich části a veškeré jiné objekty včetně obalového materiálu, z něhož byl vzorek odebrán, a které přišly do styku s uvedeným rostlinným materiálem, ze kterého byl vzorek odebrán, a místo nebo místa produkce včetně těch, kde je možná úplná výměna pěstebního substrátu, a pozemek, na nichž byly zamořené rostliny vypěstovány a odkud byl vzorek odebrán,

• b) provede odborné šetření zaměřené na zjištění rozsahu pravděpodobného zamoření a prvotního zdroje nákazy v souladu s ustanovením bodu 1 přílohy č. 3 včetně testování klonově příbuzných partií hostitelských rostlin podle § 6 a stanoví v souladu s ustanovením bodu 2 přílohy č. 3 rozsah pravděpodobného zamoření prostřednictvím předsklizňového nebo posklizňového kontaktu, a na základě klonové příbuznosti, pěstování, zavlažování a zalévání nebo jiné pěstitelské vazby se zamořeným předmětem nebo objektem, označeným podle písmene a),

• c) vymezí karanténní území na základě označení zamořených předmětů nebo objektů podle písmene a) a bezpečnostní zónu na základě stanovení rozsahu pravděpodobného zamoření podle písmene b) a možného rozšíření původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby v souladu s ustanovením bodu 3 přílohy č. 3.

(2) V případě potvrzení výskytu původce hnědé hniloby s ohledem na povrchovou vodu, odpadní vodu ze zařízení na zpracování a balení brambor a s ohledem na hostitelské rostliny z čeledi lilkovitých z doprovodné vegetace, jejichž prostřednictvím by při zavlažování, zalévání nebo zaplavení povrchovou vodou mohlo být ohroženo pěstování brambor, rostlinolékařská správa

• a) zajistí úřední laboratorní testování odebraných vzorků povrchových vod a popřípadě hostitelských rostlin z čeledi lilkovitých způsobem stanoveným v příloze č. 1 ve vhodných termínech s cílem určit rozsah zamoření,

• b) označí v souladu s pozitivními výsledky úředního laboratorního testování podle písmene a) povrchovou vodu, z níž byly odebírány vzorky, za zamořenou,

• c) vymezí karanténní území na základě označení povrchové vody za zamořenou podle písmene b) a bezpečnostní zónu na základě stanovení rozsahu pravděpodobného zamoření původcem hnědé hniloby a jeho možného rozšíření podle bodu 3 přílohy č. 3.

(3) Rostlinolékařská správa neprodleně oznámí ostatním členským státům a Komisi v souladu s ustanovením bodu 4 přílohy č. 3 potvrzený výskyt původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby podle odstavce 1 písm. a), popřípadě odstavce 2 písm. b), a sdělí podrobnosti o vymezení karanténního území a bezpečnostní zóny podle odstavce 1 písm. c), popřípadě odstavce 2 písm. c). Podrobnosti o tomto oznámení jsou důvěrné.

(4) Pokud jiný členský stát potvrdí výskyt původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby v rostlině, zásilce anebo partii původem z České republiky v oznámení učiněném obdobně podle odstavce 3, rostlinolékařská správa odpovídajícím způsobem a v souladu s ustanovením odstavců 1 a 2 označí zamořené předměty a objekty, stanoví rozsah pravděpodobného zamoření a vymezí karanténní území, popřípadě bezpečnostní zónu.

(5) Rostlinolékařská správa stanoví úředním sdělením ve Věstníku zásady pro vedení odborného šetření podle odstavce 1 písm. b) a pro stanovení rozsahu karanténního území a bezpečnostní zóny, vymezovaných podle odstavce 1 písm. c), odstavce 2 písm. c) a odstavce 4.

§ 6

Testování klonově příbuzných partií hostitelských rostlin

(1) Rostlinolékařská správa zajistí laboratorní testování podle § 4 odst. 2 všech dohledaných partií hostitelských rostlin klonově příbuzných k partiím, které byly označeny za zamořené podle § 5 odst. 1 písm. a), v každém případě však všechny klonově příbuzné partie rozmnožovacího materiálu^2), a to v rozsahu potřebném ke stanovení prvotního zdroje nákazy a rozsahu možného zamoření s cílem stanovit míru rizika dalšího šíření původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby.

(2) Podle výsledku testování podle odstavce 1 rostlinolékařská správa v případě potřeby označí další předměty a objekty za zamořené, rozšíří rozsah možného zamoření a nově vymezí karanténní území a bezpečnostní zónu podle § 5 odst. 1 písm. a), b) a c).

§ 7

Opatření proti šíření původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby

(1) Rostlinolékařská správa v souladu s § 11 odst. 1 zákona nařídí tato mimořádná rostlinolékařská opatření podle § 76 odst. 2 zákona:

• a) partie hostitelských rostlin označená za zamořenou podle § 5 odst. 1 písm. a) nesmí být sázena a pod dohledem rostlinolékařské správy se s ní naloží způsobem uvedeným v bodě 1 přílohy č. 4, pokud rostlinolékařská správa předem ověří, že neexistuje rozpoznatelné riziko rozšíření původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby a že jsou splněny požadavky na zneškodňování odpadů, stanovené v příloze č. 5, v případě průmyslového zpracování této partie,

• b) partie hostitelských rostlin označená jako pravděpodobně zamořená podle § 5 odst. 1 písm. b) smí být použita pod dohledem rostlinolékařské správy způsobem uvedeným v bodě 2, popřípadě 3 přílohy č. 4, pokud rostlinolékařská správa předem ověří, že neexistuje rozpoznatelné riziko rozšíření původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby a že jsou splněny požadavky na zneškodňování odpadů, stanovené v příloze č. 5, v případě průmyslového zpracování této partie, a pokud není tato partie na základě výsledku testování klonově příbuzných partií hostitelských rostlin podle § 6 označena jako zamořená podle § 5 odst. 1 písm. a),

• c) zařízení, stroje, dopravní prostředky, sklady nebo jejich části a veškeré jiné objekty včetně obalového materiálu, označené za zamořené podle § 5 odst. 1 písm. a) nebo označené jako pravděpodobně zamořené podle § 5 odst. 1 písm. b), se buď zničí nebo podrobí očistě a dezinfekci pomocí vhodných metod uvedených v příloze č. 6 s tím, že po provedení očisty a dezinfekce se tyto objekty a předměty za zamořené ani za pravděpodobně zamořené nepovažují,

• d) v karanténním území a bezpečnostní zóně, vymezených podle § 5 odst. 1 písm. c), popřípadě podle § 5 odst. 2 písm. c), musí být provedena opatření stanovená v případě výskytu původce kroužkovitosti v bodě 4 přílohy č. 4 a v případě výskytu původce hnědé hniloby v bodě 5 přílohy č. 4.

(2) Rostlinolékařská správa může nařídit podle § 11 odst. 1 zákona přísnější mimořádná rostlinolékařská opatření proti šíření původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby než opatření uvedená v odstavci 1, pokud budou tato opatření odborně odůvodněná, splnitelná a účinná. Podrobnosti o těchto opatřeních a o opatřeních nařízených podle odstavce 1 písm. d) uvnitř karanténního území a v bezpečnostní zóně sděluje rostlinolékařská správa ostatním členským státům a Komisi spolu s registračním číslem dotčených povinných osob, registrovaných podle § 12 odst. 1 zákona.

(3) Rostlinolékařská správa zruší podle § 76 odst. 4 písm. b) zákona mimořádná rostlinolékařská opatření nařízená podle odstavce 1 a odstavce 2 po jejich splnění a po uplynutí doby stanovené k jejich splnění.

(4) Přechovávání původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby je v souladu s § 7 odst. 1 zákona zakázáno s výjimkou jejich přechovávání k vědeckým, šlechtitelským nebo diagnostickým účelům, které povoluje rostlinolékařská správa podle § 8 odst. 1 zákona, pokud tím nebudou narušena ochranná opatření při jejich výskytu ani nevznikne riziko jejich šíření.

§ 8

Testování rozmnožovacího materiálu^2) bramboru

(1) Rozmnožovací materiál^2) bramboru, vypěstovaný na území České republiky a uváděný na trh, musí být podroben laboratornímu testování, prováděnému v rámci detekčního průzkumu podle § 3 odst. 2, v rozsahu podle odstavce 2 a v souladu s § 3 odst. 8 a 9, a shledán prostým původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby.

(2) Testování podle odstavce 1 se v příslušném sklizňovém roce podrobí

• a) rostliny šlechtitelského rozmnožovacího materiálu^4) bramboru určené k výrobě předstupňů a reprezentativní vzorky všech partií rozmnožovacího materiálu bramboru, pokud byl v posledním uplynulém sklizňovém roce v partii rozmnožovacího materiálu^2) bramboru původem z České republiky potvrzen výskyt původce kroužkovitosti, a nebo

• b) pokud byl v posledním uplynulém sklizňovém roce v partii rozmnožovacího materiálu^2) bramboru původem z České republiky potvrzen výskyt původce hnědé hniloby, buď

• 1. rostliny šlechtitelského rozmnožovacího materiálu^4) bramboru a předstupňů a reprezentativní vzorky všech partií základního rozmnožovacího materiálu bramboru v případech potvrzené klonové souvislosti se zaměřením na tuto souvislost, nebo

• 1. reprezentativní vzorky všech partií základního rozmnožovacího materiálu bramboru nebo předstupňů a šlechtitelského rozmnožovacího materiálu bramboru^4) v případech, u nichž prokazatelně neexistuje žádná klonová souvislost, nebo

• c) rostliny šlechtitelského rozmnožovacího materiálu bramboru^4) nebo reprezentativní vzorky všech partií základního rozmnožovacího materiálu bramboru nebo předstupňů, nebo všech partií rozmnožovacího materiálu bramboru určených k množení v následujícím roce, pokud výskyt původce kroužkovitosti ani původce hnědé hniloby nebyl v posledním uplynulém sklizňovém roce potvrzen v partii rozmnožovacího materiálu^2) bramboru původem z České republiky.

§ 9

Účinnost

Tato vyhláška nabývá účinnosti dnem jejího vyhlášení.

Ministr:

Ing. Palas v. r.

Příloha č. 1 k vyhlášce č. 331/2004 Sb.

A. METODY DIAGNÓZY, DETEKCE A IDENTIFIKACE PŮVODCE KROUŽKOVITOSTI

Předložené postupové diagramy popisují různé postupy, které jsou součástí:

ii) detekce Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus ve vzorcích hlíz bramboru a rostlin bramboru,

iii) identifikace Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

OBECNÉ ZÁSADY

Optimalizované protokoly pro různé metody, validovaná činidla a podrobnosti pro přípravu testovaných a kontrolních materiálů jsou uvedeny v dodatcích. Seznam laboratoří, které se podílely na optimalizaci a validaci protokolů, je v dodatku č. 1.

Protože protokoly obsahují zjištění karanténního organismu a zahrnují použití životaschopných kultur Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus jako kontrolních materiálů, je nutné pracovat za vhodných karanténních podmínek s odpovídajícím zařízením na odstraňování odpadů a za podmínek příslušných povolení vydaných rostlinolékařskou správou.

Testovací parametry musí zajistit stálé a reprodukovatelné zjištění úrovní Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus jako stanovené prahy vybraných metod.

Zcela nezbytná je příprava pozitivních kontrol.

Testování podle požadovaných prahů také zahrnuje správné nastavení, údržbu a kalibraci zařízení, pečlivé zacházení s činidly a jejich uchovávání a všechna opatření pro zamezení kontaminace mezi vzorky, např. oddělení pozitivních kontrol od testovaných vzorků. Musí být uplatněno standardní řízení kvality, aby se zabránilo administrativním a jiným chybám, zvláště při označování a v dokumentaci.

Podezření z výskytu, jak je uvedeno v § 4 odst. 1, naznačuje pozitivní výsledek z diagnostických nebo screeningových testů provedených na vzorku, jak je znázorněno v níže uvedených postupových diagramech.

Pokud je první screeningový test (IF nebo PCR/FISH) pozitivní, existuje podezření na infekci původcem kroužkovitosti a musí být proveden druhý screeningový test. Pokud je i druhý screeningový test pozitivní, pak je podezření z výskytu potvrzeno a musí se pokračovat v testování podle daného schématu. Pokud je druhý screeningový test negativní, pak vzorek není považován za infikovaný původcem kroužkovitosti.

Z toho důvodu je pozitivní IF test podle § 4 odst. 1 definován jako pozitivní výsledek IF testu potvrzený druhým screeningovým testem (PCR/FISH).

Potvrzená přítomnost vyžaduje izolaci a identifikaci čisté kultury Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus s potvrzením patogenity.

• 1. Použití postupových diagramů

• 1.1. Postupový diagram pro diagnózu bakteriální kroužkovitosti v hlízách bramboru a v rostlinách bramboru vykazujících příznaky bakteriální kroužkovitosti

Postup testování je určen pro hlízy a rostliny bramboru s podezřením z výskytu nebo typickými příznaky kroužkovitosti. Zahrnuje rychlý screeningový test, izolaci patogenu z infikovaného vodivého pletiva na diagnostickém médiu a v případě pozitivního výsledku identifikaci kultury Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

[image omitted]

(1) Popis příznaků je v oddíle 2.

(2) Vhodné testy jsou: - IF test (oddíl 4), - PCR test (oddíl 6), - FISH test (oddíl 5).

(3) Ačkoli izolace patogena z rostlinného materiálu s typickými příznaky roztíráním suspenzí na média není komplikovaná, kultivace v pokročilých stádiích infekce se nemusí podařit. Saprofytické bakterie, které rostou na infikovaném pletivu, mohou přerůst nebo potlačovat patogena na izolačním médiu. Proto se doporučuje používat neselektivní i selektivní média, nejlépe MTNA (oddíl 8) nebo biotest (oddíl 7).

(4) Popis typické morfologie kolonie je v oddíle 8.

(5) Pokud je izolační zkouška negativní, ale příznaky choroby jsou typické, musí být izolace provedena znovu.

(6) Spolehlivé identifikace čisté kultury Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se dosáhne za použití testů uvedených v oddílu 9.

(7) Zkouška patogenity je popsána v oddíle 10.

• 1.2. Postupový diagram pro diagnózu bakteriální kroužkovitosti ve vzorcích bezpříznakových hlíz bramboru

Postup testování je určen ke zjištění latentních infekcí v hlízách bramboru. Pozitivní výsledek z nejméně dvou screeningových testů, z nichž každý je založen na jiném biologickém principu, musí být doplněn izolací patogena, a následně, v případě izolace typických kolonií, potvrzením, že čistá kultura je Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Pozitivní výsledek pouze jednoho screeningového testu není dostačující k tomu, aby byl vzorek považován za podezřelý.

Screeningové a izolační testy musí umožnit detekční práh 10^3 až 10^4 buněk/ml resuspendované pelety zahrnutý jako pozitivní kontroly v každé sérii testů.

[image omitted]

(1) Standardní velikost vzorku je 200 hlíz, ačkoli postup lze použít i na menší počet, jestliže 200 hlíz není k dispozici.

(2) Metody extrakce a koncentrace patogena jsou popsány v oddílu 3.1.

(3) Pokud jsou alespoň dva testy založené na různých biologických principech pozitivní, musí být provedena izolace a potvrzení. Provede se nejméně jeden screeningový test. Pokud je tento test negativní, je vzorek považován za negativní. V případě, že je tento test pozitivní, je pro ověření prvního pozitivního výsledku nezbytný ještě jeden nebo více screeningových testů založených na různých biologických principech. Pokud je druhý nebo další test negativní, je vzorek považován na negativní. Další testy nejsou nutné.

(4) Test imunofluorescence (IF). Pro vyšetření IF se vždy použije polyklonální protilátka, další monoklonální protilátky umožní větší přesnost (viz oddíl 4).

(5) PCR test. Použijí se vhodná validovaná PCR činidla a protokoly (viz oddíl 6).

(6) FISH test. Použijí se validovaná činidla a protokoly (viz oddíl 5).

(7) Selektivní izolace. Toto může být v mnoha případech vhodná metoda pro přímou izolaci Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus za použití MTNA média nebo NCP-88 média a ředění resuspendované pelety 1/100. Typické kolonie lze získat během 3-10 dní po rozetření na médium. Kulturu patogena lze následně vyčistit a identifikovat. Pro úplné využití potenciálu test vyžaduje opatrnou přípravu pletiva z pupkové části, aby se omezily sekundární bakterie, které jsou konkurencí Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na médiu a které mohou patogena přerůst. Pokud se kultivační metoda takto nepodaří, musí být izolace provedena z rostlin použitých pro biotest (viz oddíl 8).

(8) Biotest se používá k izolaci Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus z pelet bramborových extraktů pomocí selektivního obohacení v rostlinách lilku vejcoplodého (Solanum melongena). Test vyžaduje optimální inkubační podmínky stanovené pro tuto metodu. Bakteriální inhibitory Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na MTNA nebo NCP-88 médiu pravděpodobně tento test narušovat nebudou (viz oddíl 7).

(9) Typická morfologie kolonie je popsána v oddílu 8.

(10) Kultivace nebo biotesty mohou selhat z důvodů konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Pokud jsou výsledky screeningových testů pozitivní, ale izolační testy negativní, opakují se izolační testy ze stejné pelety nebo dodatečným odebráním vodivého pletiva z blízkosti pupkového konce hlíz stejného vzorku a v případě potřeby se provede test dalších vzorků.

(11) Spolehlivá identifikace čistých kultur podezřelých na Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se dosáhne použitím testů popsaných v oddílu 9.

(12) Test patogenity je popsán v oddílu 10.

• 1.3. Postupový diagram pro diagnózu bakteriální kroužkovitosti ve vzorcích bezpříznakových rostlin bramboru

[image omitted]

(1) Doporučené velikosti vzorků – viz oddíl 3.2.

(2) Metody extrakce a koncentrace patogena jsou popsány v oddílu 3.2.

(3) Pokud jsou alespoň dva testy založené na různých biologických principech pozitivní, musí být provedena izolace a potvrzení. Provede se nejméně jeden screeningový test. Pokud je tento test negativní, je vzorek považován za negativní. V případě, že je tento test pozitivní, je pro ověření prvního pozitivního výsledku nezbytné provedení druhého nebo více screeningových testů založených na různých biologických principech. Pokud je druhý nebo další test negativní, je vzorek považován za negativní. Další testy nejsou nutné.

(4) Selektivní izolační test a typická morfologie kolonie jsou popsány v oddílu 8.

(5) IF test je popsán v oddílu 4.

(6) PCR test je popsán v oddílu 6.

(7) FISH test je popsán v oddílu 5.

(8) Biotest je popsán v oddílu 7.

(9) Kultivace nebo biotest mohou selhat z důvodů konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Pokud jsou výsledky screeningových testů pozitivní, ale izolační testy jsou negativní, opakují se izolační testy a v případě potřeby se provede test dalších vzorků.

(10) Spolehlivé identifikace čistých kultur, u kterých je podezření, že se jedná o Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, se dosáhne pomocí testů popsaných v oddílu 9.

(11) Test patogenity je popsán v oddílu 10.

• 1. Vizuální vyšetření na přítomnost příznaků kroužkovitosti

• 2.1. Rostliny bramboru

V evropských klimatických podmínkách se příznaky na poli zjistí jen zřídkakdy a často pak až na konci sezóny. Kromě toho jsou příznaky skryté nebo se zamění s příznaky jiných chorob, stáří nebo mechanických poškození. Proto mohou být příznaky při kontrole na poli snadno přehlédnuty. Příznaky vadnutí jsou velmi odlišné od příznaků hnědé hniloby; vadnutí je obvykle pomalé a zpočátku omezené na okraje listů. Mladé infikované listy často i přes infekci nadále rostou, i když růst v infikovaných místech je omezený. Tím vznikají neobvykle tvarované listy. Listy postižené ucpáním vodivých pletiv na spodní části stonku často mají chlorotické, žluté až oranžové mezižeberní partie. Infikované děložní lístky, listy a dokonce stonky mohou eventuálně odumřít. Často jsou listy a hlízy pouze menší. Příležitostně jsou rostliny zakrnělé. Barevné snímky řady příznaků jsou na internetové stránce http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

• 2.2. Hlízy bramboru

Nejranějšími příznaky jsou slabá sklovitost nebo průsvitnost pletiva bez měknutí v okolí cévního systému, zejména blízko pupku. Prstenec svazků cévních na pupkovém konci hlízy může mít nepatrně tmavší zbarvení než obvykle. Prvním dobře identifikovaným příznakem je žlutavé zabarvení prstence cévních svazků a stav, kdy při jemném zmáčknutí hlízy vystupují z cév sloupky sýrovité hmoty. Tento exsudát obsahuje miliony bakterií. Vodivá pletiva mohou zhnědnout a příznaky na hlízách jsou v tomto stádiu podobné příznakům hnědé hniloby způsobené Ralstonia solanacearum. Zpočátku mohou být tyto příznaky omezeny na jednu část prstence, nemusí se vyskytovat jen blízko pupkové části a mohou se postupně šířit na celý prstenec. S postupem infekce dochází k destrukci vodivých pletiv: vnější korová část se může oddělit od vnitřní korové části. V pokročilých stadiích infekce se objevují na povrchu hlízy praskliny, často s červenohnědými okraji. V poslední době se v Evropě objevilo několik případů, kdy střední kůra hnije s prstencem svazků cévních, čímž dochází k druhotnému poškození se vznikem vnitřních dutin a nekrózy. Druhotná houbová nebo bakteriální infekce může příznaky maskovat a může být obtížné, ne-li nemožné, rozlišit pokročilé příznaky kroužkovitosti od jiných hnilob bramboru. Možné jsou i atypické příznaky. Barevné snímky řady příznaků jsou na internetové stránce http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

• 1. Příprava vzorků

• 3.1. Hlízy bramboru

Poznámka:

• Standardní velikost vzorku je 200 hlíz na 1 test. Intenzivnější vzorkování vyžaduje více testů na vzorcích této velikosti. Větší množství hlíz ve vzorku vede k zpomalení nebo složitějšímu výkladu výsledků. Postup však lze vhodně použít i pro vzorky s méně než 200 hlízami, pokud je k dispozici menší množství hlíz.

• Validace všech níže uvedených zjišťovacích metod je založená na testování vzorků o velikosti 200 hlíz.

• Níže popsaný bramborový extrakt lze použít také pro zjištění původce hnědé hniloby, Ralstonia solanacearum.

Nepovinné ošetření před přípravou vzorku:

Hlízy se omyjí. Použijí se vhodné dezinfekční prostředky (s obsahem chlóru, jestliže má být proveden PCR test, pro odstranění možné patogenní DNA) a mycí prostředky mezi každým vzorkem. Hlízy se nechají oschnout na vzduchu. Tento postup mytí je obzvlášť užitečný v případě, že je ve vzorku příliš zeminy a jestliže se má provádět PCR test nebo přímá izolace.

• 3.1.1. Pomocí čistého a dezinfikovaného skalpelu nebo nožem či škrabkou na brambory se odstraní slupka na pupkovém konci každé hlízy. Opatrně se vyříznou konické výkrojky vodivého pletiva z pupkových konců brambor. Na minimum se omezí nadbytečná část pletiva nezahrnující cévní svazky. Po odebrání musí být výkrojky z pupkových konců zpracovány do 24 hodin nebo konzervovány při -20 °C po dobu nejdéle dvou týdnů.

Všechny hlízy s podezřelými příznaky bakteriální kroužkovitosti se dají stranou a testují se odděleně.

Pokud jsou při vyříznutí výkrojku z pupkového konce zjištěny příznaky kroužkovitosti, provede se vizuální vyšetření této hlízy po naříznutí hlízy na pupkovém konci. Všechny naříznuté hlízy s podezřelými příznaky se nechají korkovatět po dobu 2 dnů při pokojové teplotě a uchovávají se v karanténě při teplotě 4 – 10 °C až do ukončení všech testů. Všechny hlízy ve vzorku se uchovávají podle přílohy č.2.

• 3.1.2. Výkrojky z pupkové části se shromáždí v nepoužitých nádobách na jedno použití, které jsou uzavíratelné a/nebo utěsnitelné (v případě, že jsou nádoby znovu používány, musí být důkladně vyčištěny a dezinfikovány prostředky s obsahem chlóru). Nejlépe je zpracovat výkrojky z pupkového konce okamžitě, pokud to není možné, uchovávají se v nádobě bez přidání pufru, v chladu po dobu maximálně 72 hodin nebo při pokojové teplotě maximálně 24 hodin. Schnutí a suberizace výkrojků a růst saprofytů v průběhu skladování může bránit zjištění přítomnosti bakterie způsobující kroužkovitost.

• 3.1.3. Výkrojky z pupkového konce se zpracují jedním z následujících postupů:

• a) výkrojky se zalijí dostatečným množstvím (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 3) a třepají se v rotační třepačce (50-100 ot/min) po dobu 4 hodin při teplotě nižší než 24 °C nebo po dobu 16-24 hodin chlazené;

nebo

• b) výkrojky se homogenizují s dostatečným množstvím (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 3), buď v mixéru nebo rozdrcením v utěsněném jednorázovém maceračním sáčku za použití gumového tloučku nebo vhodného mlecího zařízení.

Poznámka:

Při homogenizaci vzorků za použití mixéru existuje vysoké nebezpečí křížové kontaminace vzorků. Je nutno učinit bezpečnostní opatření pro zamezení vzniku aerosolu nebo rozlití během extrakce. Pro každý vzorek musí být použita čerstvě sterilizovaná ostří (nože) a nádoby. Pokud má být použit PCR test, je nutno zamezit přenosu DNA na nádoby nebo mlecí zařízení, doporučuje se drcení v sáčcích na jedno použití a použití zkumavky na jedno použití.

• 3.1.4. Dekantuje se supernatant. Pokud je nadměrně zakalený, pročistí se buď pomalým odstředěním (při maximálně 180 g po dobu 10 minut při teplotě 4-10°C) nebo vakuovou filtrací (40-100µm), filtr se omyje přídavkem (10 ml) extrakčního pufru (dodatek 3).

• 3.1.5. Bakteriální frakce se zahustí odstřeďováním při 7000 g po dobu 15 minut (nebo 10 000 g po dobu 10 minut) při teplotě 4-10°C a odstraní se supernatant, aniž by se rozvířila peleta.

• 3.1.6. Resuspenduje se peleta v 1,5 ml peletového pufru (dodatek 3). Použije se 500 µl pro test na Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, 500 µl pro Ralstonia solanacearum a 500 µl pro referenční účely. Přidá se sterilní glycerol na konečnou koncentraci 10-25 % (v/v) k 500 µl referenční poměrné části a ke zbývající části vzorku, promíchá se vířením a uloží při teplotě -16 až -24°C (týdny) nebo při teplotě -68 až -86°C (měsíce). Extrakty se během testování uchovávají při teplotě 4-10°C.

Opakované zmrazení a rozmrazení se nedoporučuje.

Pokud je nutný transport extraktu, zajistí se přeprava v chladícím boxu do 24 až 48 hodin.

• 3.1.7. Je nezbytně nutné, aby se se všemi pozitivními kontrolami a vzorky Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus zacházelo odděleně, aby se předešlo kontaminaci. To platí i pro sklíčka na IF testy a všechny testy.

• 3.2. Rostliny bramboru

Poznámka:

Pro zjištění latentních populací Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se doporučuje kontrola kombinovaných vzorků. Postup je vhodný pro kombinované vzorky až 200 částí stonků. (Pokud se provádí podrobné průzkumy, měly by být založeny na statisticky reprezentativním vzorku rostlinné populace, která je předmětem vyšetřování.)

• 3.2.1 Pomocí čistého dezinfikovaného nože nebo zahradnických nůžek se odstraní část o velikosti 1-2 cm ze spodní strany každého stonku přímo nad povrchem země.

Části stonků se krátce dezinfikují etanolem 70 %, okamžitě osuší savým papírem a shromažďují v uzavřené sterilní nádobě.

• 3.2.2. Části stonků se zpracují jedním z následujících postupů:

• a) části se zalijí dostatečným množstvím (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 3) a třepají v rotační třepačce (50-100 ot/min) po dobu 4 hodin při teplotě nižší než 24 °C nebo po dobu 16-24 hodin chlazené,

nebo

• b) části se okamžitě rozdrtí v pevném maceračním sáčku s přiměřeným množstvím extrakčního pufru (dodatek 3) za použití gumového tloučku nebo vhodného mlecího zařízení. Pokud to není možné, skladují se části stonků v chladu maximálně 72 hodin nebo maximálně 24 hodin při pokojové teplotě.

• 3.2.3. Po usazení, které má trvat 15 minut, se dekantuje supernatant.

• 3.2.4 Další purifikace extraktu nebo koncentrace bakteriální frakce obvykle není nutná, ale lze ji dosáhnout filtrací a/nebo odstředěním podle popisu v oddílu 3.1.3.-3.1.6.

• 3.2.5 Čistý nebo koncentrovaný vzorkový extrakt se rozdělí na 2 stejné části, Jedna polovina se udržuje během testování při teplotě 4-10 °C a druhá polovina se skladuje s 10-25 % (v/v) sterilního glycerolu při teplotě -16 až -24 °C (týdny) nebo při teplotě -68 až -86 °C (měsíce), pokud je nutné další testování.

• 1. IF test

PRINCIP

Doporučuje se použít IF test jako hlavní screeningový test, protože byla prokázána jeho schopnost dosáhnout požadovaných prahů.

Použije-li se jako hlavní screeningový test a jeho výsledek je pozitivní, musí být jako druhý screeningový test proveden test PCR nebo FISH. Jestliže se test IF použije jako druhý screeningový test a jeho výsledek je pozitivní, je pro dokončení analýzy nutné další testování podle postupového diagramu.

Poznámka:

Pokud je IF test používán jako hlavní vyšetřovací test, používá se vždy polyklonální protilátka. V případě pozitivního výsledku IF testu s polyklonální protilátkou může být další vyšetření vzorku s monoklonální protilátkou přesnější, ale méně citlivé.

Používají se protilátky proti známému kmenu původce kroužkovitosti - ATCC33113 (NCPPB 2137) nebo NCPPB 2140. Doporučuje se určovat titr pro každou novou řadu protilátek. Titr je stanoven jako nejvyšší ředění, při kterém dochází k optimální reakci při testování suspenze obsahující 105 až 106 buněk na 1 ml homologického kmene původce kroužkovitosti a při použití vhodného konjugátu fluorescenčního isothiokyanatanu (FITC) podle doporučení výrobce. Nezpracované polyklonální nebo monoklonální protilátky by měly mít IF titr alespoň 1:2000. Během testu by se měly protilátky používat v pracovním ředění (WD) v blízkosti titru nebo na titru. Používají se validované protilátky (viz internetovou stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Test se provádí na čerstvě připravených vzorkových extraktech. V případě potřeby může být úspěšně proveden na extraktech skladovaných při - 68 až - 86 °C v glycerolu. Glycerol lze ze vzorku odstranit přidáním 1 ml peletového pufru (dodatek 4), opětovným odstředěním po dobu 15 minut při 7 000 g a resuspenzí ve stejném množství peletového pufru. To často není nutné, zejména pokud jsou sklíčka se vzorky fixována plamenem (viz 4.2).

Připraví se oddělená pozitivní kontrolní sklíčka s homologickým kmenem nebo s jiným srovnávacím kmenem původce kroužkovitosti, suspendovaným ve výluhu z brambor podle dodatku 2 a nepovinně v pufru.

Pletivo infikované přirozenou cestou (uchovávané lyofilizací nebo zmrazením při teplotě -16 až -24 °C) by se mělo podle možnosti použít jako paralelní kontrola na stejném podložním sklíčku.

Jako negativní kontroly se použijí alikvotní části vzorkových extraktů, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.

Použijí se mikroskopická sklíčka s více okénky, nejlépe s 10 okénky o průměru nejméně 6 mm.

Test kontrolního materiálu se provede stejným způsobem jako test vzorků.

• 4.1. Sklíčka na test se připraví jedním z následujících postupů:

• a) Pro pelety s relativně nízkým množstvím škrobového sedimentu:

Napipetuje se měřené standardní množství (pro okénka o průměru 6 mm je vhodné 15 µl – pro větší okénka objem vyšší) roztoku resuspendované bramborové pelety 1/100 do prvního okénka. Následně se napipetuje stejné množství nezředěné pelety (1/1) do zbývajících okének v řadě. Druhou řadu lze použít jako duplikát nebo pro druhý vzorek podle obrázku 1.

• b) Pro jiné pelety:

Připraví se desetinná ředění (1/10 a 1/100) resuspendované pelety v peletovém pufru. Napipetuje se měřené standardní množství (pro okénka o průměru 6 mm je vhodné 15 µl – pro větší okénka objem vyšší) resuspendované pelety 1/100 a každého roztoku do řady okének. Druhou řadu lze použít jako duplikát nebo pro druhý vzorek podle obrázku 2.

• 4.2. Vysuší se kapky při pokojové teplotě nebo zahřátím na teplotu 40 až 45 °C. Bakteriální buňky se fixují na sklíčko buď zahřátím (15 minut při teplotě 60 °C), nad plamenem nebo pomocí 95 % etanolu nebo podle zvláštních pokynů dodavatelů protilátek.

V případě potřeby lze potom fixovaná sklíčka před dalším použitím skladovat zmrazená v suchém boxu po co možná nejkratší dobu (maximálně 3 měsíce).

• 4.3. Postup IF testu:

• a) Podle přípravy sklíčka na test v oddílu 4.1 písm. a):

Připraví se sada dvojnásobných roztoků protilátky v IF pufru. V první jamce by měl být titr ^1/2 (T/2), v ostatních titr ^1/4 (T/4), titr ^1/2 (T/2), titr (T) a dvojnásobný titr (2T).

• b) Podle přípravy sklíčka na test v oddílu 4.1 písm. b):

Připraví se pracovní ředění (WD) protilátky v IF pufru. Pracovní ředění ovlivňuje přesnost.

Obrázek 1: Příprava sklíčka na test podle oddílu 4.1 písm. a) a oddílu 4.3. písm. a)

[image omitted]

Obrázek 2: Příprava sklíčka na test podle oddílu 4.1 písm. b) a oddílu 4.3 b)

[image omitted]

• 4.3.1. Podložní sklíčka se uspořádají na navlhčený papír. Každé testovací okénko se pokryje kompletně ředěním protilátek. Množství protilátky na každém okénku musí být nejméně stejné jako množství použitého extraktu.

Pokud nejsou k dispozici konkrétní pokyny od dodavatele protilátek, postupuje se následovně:

• 4.3.2. Podložní sklíčka se inkubují na vlhkém papíře přikrytá po dobu 30 minut při pokojové teplotě (18-25 °C).

• 4.3.3. Setřesou se kapky ze všech podložních sklíček a tato se pečlivě opláchnou pufrem IF. Umyjí se ponořením po dobu 5 minut v pufru IF Tween (dodatek 3) a následně v pufru IF. Je třeba zabránit vzniku aerosolu nebo přenosu kapiček, které by mohly způsobit vzájemnou kontaminaci, a pečlivě odstranit přebytečnou vlhkost jemným osušením.

• 4.3.4. Sklíčka se umístí na vlhký papír. Testovací okénka se pokryjí ředěním konjugátu FITC, kterým se stanovuje titr. Množství konjugátu naneseného do okének musí být stejné jako množství použité protilátky.

• 4.3.5. Zakrytá sklíčka se inkubují na vlhkém papíru po dobu 30 minut při pokojové teplotě (18-25 °C).

• 4.3.6. Kapky konjugátu se setřesou ze sklíček a tato se opláchnou a umyjí jako předtím (4.3.3.).

Opatrně se odstraní přebytečná vlhkost.

• 4.3.7. Napipetuje se 5-10 µl 0,1M fosfátového pufru s glycerolem (dodatek 3) nebo komerční krycí tekutiny do každého okénka a přiloží krycí sklíčko.

• 4.4. Vyhodnocení IF testu

• 4.4.1. Testovací sklíčka se prohlížejí epifluorescenčním mikroskopem s filtry vhodnými pro excitaci FITC pod olejovou nebo vodní imersí při zvětšení 500× až 1000×. Zkoumají se okénka ve dvou navzájem kolmých průměrech a kolem obvodu. U vzorků s žádnými nebo malým počtem buněk se zkoumá nejméně 40 polí mikroskopu.

Nejdřív se zkontroluje pozitivní kontrolní vzorek. Buňky musí být jasně fluoreskující a zcela obarvené v určeném titru protilátky nebo pracovním ředění. Pokud je barevnost odchylná, musí být test IF opakován (oddíl 4).

• 4.4.2. Pozorují se jasně fluoreskující buňky s charakteristickou morfologií Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus v testovacích okénkách sklíčka (viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intenzita fluorescence musí být při porovnání s pozitivním kontrolním kmenem ve stejném ředění protilátky stejná nebo lepší. Buňky s neúplným zbarvením nebo slabou fluorescencí nelze brát v úvahu.

Při podezření z jakékoli kontaminace musí být test zopakován. To se může stát, když všechna sklíčka ve skupině vykazují pozitivní buňky díky kontaminaci pufru nebo při zjištění pozitivních buněk (mimo okénka sklíček) na povrchu sklíček.

• 4.4.3. Existuje několik problémů podstatných pro přesnost imunofluorescenčního testu. V peletách z pupkové části bramboru a částí stonku se mohou vyskytnout doprovodné populace fluoreskujících buněk s atypickou morfologií a křížově reagující saprofytické bakterie s velikostí a morfologií podobnou Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

• 4.4.4. Berou se v úvahu pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí a morfologií v titru nebo pracovním ředění protilátek podle oddílu 4.3.

• 4.4.5. Interpretace výsledku IF testu:

• a) Při zjištění jasně fluoreskujících buněk s typickou morfologií se odhadne průměrný počet typických buněk v 1 mikroskopickém poli a vypočítá počet typických buněk na 1 ml resuspendované pelety (dodatek 4).

Výsledek IF je pozitivní u vzorků, kde je počet typických buněk na 1 ml resuspendované pelety nejméně 5×10^3. Vzorek je považován na potenciálně infikovaný a je povinné další testování.

• b) Výsledek IF testu je negativní pro vzorky, které obsahují méně než 5×10^3 buněk na 1 ml resuspendované pelety a vzorek se považuje za negativní. Další testování není nutné.

• 1. Test FISH

PRINCIP

Když se jako první screeningový test použije FISH test a je pozitivní, musí být jako druhý povinný screeningový test proveden IF test. Když se FISH test provede jako druhý screeningový test a je pozitivní, je k dokončení diagnózy nutné další testování podle postupového diagramu.

Poznámka:

Používají se validované oligosondy specifické pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (dodatek 7). Úvodní testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění alespoň 10^3-10^4 buněk Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na ml přidané do extraktů ze vzorku, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.

Následující postup by měl být pokud možno proveden s čerstvě připravenými extrakty, ale je možné jej úspěšně provést s extraktem, který byl uchován v glycerolu při teplotě -16 až-24 nebo -68 až -86 °C.

Jako negativní kontrola se použije alikvotní část extraktu ze vzorku, který byl předtím testován na Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus s negativním výsledkem.

Jako pozitivní kontrola se připraví suspenze obsahující 10^5 až 10^6 buněk Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na ml (např. kmen NCPPB 4053 nebo PD 406) v 0,01 M fosfátového pufru (PB) z 3-5 denní kultury (příprava viz dodatek 2). Připraví se samostatná sklíčka s pozitivními kontrolními vzorky homologického kmene nebo jiného referenčního kmene Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus suspendovaného v bramborovém extraktu podle dodatku 2.

Použití eubakteriálních oligosond značených FITC poskytuje kontrolu procesu hybridizace, protože zbarví všechny eubakterie přítomné ve vzorku.

Test kontrolního materiálu se provádí stejným způsobem jako u vzorků.

• 5.1. Fixace bramborového extraktu

• 5.1.1. Připraví se fixační roztok (viz dodatek 7)

• 5.1.2. Napipetuje se 100 µl každého vzorkového extraktu do Eppendorfovy mikrozkumavky a odstřeďujte po dobu 8 minut na 7 000 g.

• 5.1.3. Odstraní se supernatant a rozpustí se peleta v 500 µl fixačního roztoku připraveného max. 24 hodin předem. Protřepe se a inkubuje se přes noc při teplotě 4 °C.

Alternativním fixačním činidlem je 96 % etanol. Pro jeho použití se rozpustí peleta z kroku 5.1.2. v 50 µl 0,01 M PB a 50 µl 96 % etanolu. Promíchá se protřepáním a inkubuje se při teplotě 4 °C po dobu 30-60 minut.

• 5.1.4. Odstřeďuje se po dobu 8 minut na 7 000 g, odstraní se supernatant a resuspenduje se peleta v 75 µl 0,01 M PB (viz dodatek 3).

• 5.1.5. Kápne se 16 µl fixované suspenze na čisté 10 okénkové sklíčko, jak ukazuje obrázek 3, přičemž se použijí 2 různé vzorky na jedno sklíčko, a to neředěný a zředěný 1:100 s použitím 10 µl (v 0,01 M PB). Zbývající roztok vzorku (49µl) může být uložen při teplotě -20 °C po přidání 1 objemového množství 96 % etanolu. V případě, že je třeba FISH metodu opakovat, odstraní se etanol odstředěním, přidá se stejné množství 0,01 M PB a zamíchá se protřepáním.

Obrázek 3. Rozmístění na sklíčku FISH

[image omitted]

• 5.1.6. Sklíčka se nechají uschnout na vzduchu (nebo sušičkou sklíček při teplotě 37 °C) a fixují se nad plamenem.

V této fázi je možnost postup přerušit a pokračovat v hybridizaci další den. Sklíčka by měla být skladována chráněna před prachem a v suchu při pokojové teplotě.

• 5.2. Předhybridizace a hybridizace

• 5.2.1. Připraví se roztok lyzozymu obsahující 10 mg lyzozymu (Sigma L-6876) v 10 ml pufru (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Tento roztok lze skladovat, ale měl by se pouze jednou zmrazit a nechat roztát. Každý vzorek se dobře pokryje přibližně 50 µl roztoku lyzozymu a inkubuje po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Potom se ponoří sklíčka do demineralizované vody, pouze jednou, a osuší filtračním papírem.

Alternativně se přidá místo lyzozymu 50 µl proteinázy K 40-400 µg.ml^-1 v pufru (20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7,4) do každé jamky a inkubuje se při teplotě 37 °C po dobu 30 minut.

• 5.2.2. Buňky se suší ve stupňovaných sériích 50 %, 80 % a 96 % etanolu pokaždé po dobu 1 minuty. Sklíčka se nechají uschnout na vzduchu v držáku sklíček.

• 5.2.3. Připraví se vlhká inkubační komora zakrytím dna vzduchotěsné krabice tkaninou nebo filtračním papírem namočeným v 1x hybmixu (dodatek 7). Krabice se přeinkubuje v hybridizační peci při teplotě 55 °C po dobu alespoň 10 minut.

• 5.2.4. Připraví se hybridizační roztok (dodatek 7) s 45 µl na 1 sklíčko a předinkubuje se po dobu 5 minut při teplotě 55 °C.

• 5.2.5. Sklíčka se umístí na horkou plotnu při teplotě 45 °C a do každého ze 4 okének na sklíčku / sklíčcích se přidá 10 µl hybridizačního roztoku.

• 5.2.6. Každé sklíčko se přikryje 2 krycími sklíčky (24 × 24 mm) tak, aby pod ně nevnikl vzduch. Sklíčka se umístí do předehřáté vlhké komory a hybridizuje se 14 - 18 h v peci při teplotě 55 °C v temnu.

• 5.2.7. Připraví se 3 kádinky obsahující 1 l sterilní vody (Ultra pure water = UPW), 1 l 1x hybmixu (334 ml 3× hybmix a 666 ml UPW) a 1 l ^1/2 x hybmixu (167 ml 3× hybmix a 833 ml UPW). Každá z nich se přeinkubuje ve vodní lázni při teplotě 55 °C.

• 5.2.8. Sejmou se krycí sklíčka a podložní sklíčka se umístí do držáku sklíček.

• 5.2.9. Spláchne se nadbytek vzorku inkubací po dobu 15 minut v kádince s 1× hybmixem při teplotě 55 °C.

• 5.2.10. Držák sklíček se přemístí do promývacího roztoku ^1/2 hybmix a nechá se inkubovat dalších 15 minut.

• 5.2.11. Sklíčka se ponoří krátce do UPW a položí na filtrační papír. Odstraní se nadbytečná vlhkost lehkým zakrytím povrchu filtračním papírem. Napipetuje se 5-10 µl krycího roztoku (např. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA nebo podobný) do každé jamky a celé sklíčko se zakryje velkým krycím sklíčkem (24 × 60 mm).

• 5.3. Hodnocení FISH testu

• 5.3.1. Sklíčka se prohlížejí ihned s mikroskopem vhodným pro epifluorescenční mikroskopii se zvětšením 630x nebo 1 000x pod olejovou imerzí. S filtrem vhodným pro fluorescein isothiokyanat (FITC) jsou eubakteriální buňky (včetně většiny gramnegativních buněk) ve vzorku zbarveny fluorescenčně zeleně. Použitím filtru pro tetramethylrhodamin-5-isothiokyanat se buňky Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus obarvené Cy3 jeví fluorescenčně červené. Porovnává se buněčná morfologie s morfologií pozitivních kontrolních vzorků. Buňky musí být jasně fluoreskující a zcela zbarveny. Test FISH (oddíl 9.4) musí být zopakován, pokud je zbarvení odchylné. Prohlíží se okénka napříč dvěma průměry v pravých úhlech a kolem obvodu. U vzorků, kde nejsou pozorovány žádné nebo málo buněk, se pozoruje nejméně 40 polí mikroskopu.

• 5.3.2. Hledají se jasně fluoreskující buňky s morfologií charakteristickou pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus v okénkách testovacích sklíček (viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intenzita fluorescence musí odpovídat nebo být lepší než u pozitivního kontrolního kmene. Buňky, které nejsou zcela zbarveny nebo vykazují slabou fluorescenci, se neberou v úvahu.

• 5.3.3. Při podezření z jakékoli kontaminace musí být test zopakován. Při podezření z jakékoli kontaminace musí být test zopakován. To se může stát, když všechna sklíčka ve skupině vykazují pozitivní buňky díky kontaminaci pufru nebo při zjištění pozitivních buněk (mimo okénka sklíček) na povrchu sklíček.

• 5.3.4. Existuje několik problémů podstatných pro přesnost FISH testu. V peletách z pupkové části bramboru a částí stonku se mohou vyskytnout doprovodné populace fluoreskujících buněk s atypickou morfologií a křížově reagující saprofytické bakterie s velikostí a morfologií podobnou Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, ačkoli mnohem méně často než u IF testu.

• 5.3.5. V úvahu se berou pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí a morfologií, viz 5.3.2.

• 5.3.6. Interpretace výsledku testu FISH:

• a) Výsledky FISH testu jsou platné, pokud jsou při použití FITC filtru jasně zeleně fluoreskující buňky s velikostí a morfologií typickou pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus a při použití rhodaminového filtru jasně červeně fluoreskující buňky pozorovány ve všech pozitivních kontrolách a nejsou pozorovány v žádných negativních kontrolách. Pokud jsou přítomné jasně fluoreskující buňky s typickou morfologií, odhadne se průměrný počet typických buněk v 1 mikroskopickém poli a vypočítá počet typických buněk v 1 ml resuspendované pelety (dodatek 4). Vzorky, které obsahují alespoň 5 × 10^3 typických buněk na 1 ml resuspendované pelety, se považují za pravděpodobně infikované Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Nutné je další testování. Vzorky, které obsahují méně než 5 × 10^3 typických buněk na 1 ml resuspendované pelety, se považují za negativní.

• b) Výsledek FISH testu je negativní, pokud při použití rhodaminového filtru nejsou pozorovány jasně červeně fluoreskující buňky s velikostí a morfologií typickou pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, jestliže jsou tyto typické jasně červeně fluoreskující buňky při použití rhodaminového filtru pozorovány v pozitivních kontrolách.

• 1. PCR test

PRINCIP

Použije-li se PCR test jako hlavní screeningový test a je pozitivní, musí být jako druhý povinný screeningový test proveden IF test. Pokud se PCR test používá jako druhý screeningový test a je pozitivní, je pro dokončení diagnózy nutné další testování podle postupového diagramu.

Využití této metody v celém rozsahu jako hlavního screeningového testu se doporučuje jen tehdy, je-li požadována specializovaná expertíza.

Poznámka:

Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění 10^3 až 10^4 buněk Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na 1 ml přidaných do vzorku extraktů, které byly předtím testovány s negativním výsledkem. Pro dosažení maximální citlivosti a přesnosti ve všech laboratořích mohou být vyžadovány optimalizační pokusy.

Používají se validovaná PCR činidla a protokoly. Přednostně se používá metoda s interní kontrolou.

Je třeba použít vhodná bezpečnostní opatření, aby se zabránilo kontaminaci vzorku cílovou DNA. PCR test by měli provádět zkušení laboranti v laboratořích specializovaných na molekulární biologii, aby se minimalizovala možnost kontaminace cílovou DNA.

S negativními kontrolami (u průběhu extrakce DNA a PCR) by se mělo vždy zacházet jako s konečnými vzorky, aby bylo jasné, jestli došlo k přenosu DNA.

PCR test by měl zahrnovat následující negativní kontroly:

• extraktu ze vzorku, který byl předtím testován na Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus s negativním výsledkem,

• kontroly pufru používaného pro extrakci bakterie a DNA ze vzorku,

• reakční směs PCR.

Měly by být zahrnuty následující pozitivní kontroly:

• alikvotní části resuspendovaných pelet, k nimž byl přidán Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (příprava viz dodatek 2),

• suspenze 10^6 buněk na 1 ml Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus ve vodě z virulentního izolátu (např. NCPPB 2140 nebo NCPPB 4053),

• pokud možno použít při provádění PCR testu také DNA extrahovanou z pozitivních kontrolních vzorků.

Aby se zabránilo možné kontaminaci, připraví se pozitivní kontroly v odděleném prostředí od vzorků, které budou testovány.

Extrakty ze vzorků by měly být pokud možno bez zeminy. V případě použití PCR testu je potřeba připravit extrakty z umytých brambor.

• 6.1 Metody purifikace DNA

Použijí se výše popsané pozitivní a negativní kontrolní vzorky.

Připraví se kontrolní materiál stejným způsobem jako vzorky.

K purifikaci cílové DNA z komplexních substrátů vzorků jsou k dispozici různé metody odstraňující inhibitory PCR a jiných enzymatických reakcí a koncentrující cílovou DNA v extraktu vzorku.

Následující metoda byla optimalizována pro použití s validovanou metodou PCR, uvedenou v dodatku 6.

• 6.1.a) Metoda podle Pastrika (2000)

• 1. Napipetuje se 220 µl lýzového pufru (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) do mikrozkumavky o objemu 1,5 ml.

• 1. Přidá se 100 µl extraktu ze vzorku a umístí se do termobloku nebo vodní lázně o teplotě 95 °C na dobu 10 minut.

• 1. Mikrozkumavka se vloží na 5 minut do ledu.

• 1. Přidá se 80 µl zásobního roztoku lyzozymu (50 mg lyzozymu na 1 ml v 10 mM Tris HCl, pH 8,0) a inkubuje se při teplotě 37 °C po dobu 30 minut.

• 1. Přidá se 220 µl Easy DNA ^® roztok A (Invitrogen), dobře se promíchá třepáním a inkubuje se při teplotě 65 °C po dobu 30 minut.

• 1. Přidá se 100 µl Easy DNA ^® roztok B (Invitrogen)a silně se promíchá třepáním, až usazenina sama poteče do mikrozkumavky a vzorek začne být stejnoměrně viskózní.

• 1. Přidá se 500 µl chloroformu a míchá se třepáním, až se viskozita sníží a směs se stane homogenní.

• 1. Odstřeďuje se na 15 000 g po dobu 20 minut při 4 °C pro oddělení fází a vytvoření mezifáze.

• 1. Přenese se horní fáze do čisté mikrozkumavky.

• 1. Přidá se 1 ml 100 % etanolu (-20 °C), krátce se promíchá třepáním a inkubuje se na ledu po dobu 10 minut.

• 1. Odstředí se na 15 000 g po dobu 20 minut při 4 °C a odstraní se z pelety etanol.

• 1. Přidá se 500 µl 80 % etanolu (-20 °C) a promíchá převracením mikrozkumavky.

• 1. Odstřeďuje se na 15 000 g po dobu 10 minut při 4°C, peleta se zachová a odstraní etanol.

• 1. Peleta se nechá uschnout na vzduchu nebo v DNA speed vac.

• 1. Peleta se resuspendujte v 100 µl sterilní vody (UPW) a nechá stát nejméně 20 minut při pokojové teplotě.

• 1. Skladuje se při teplotě -20 °C až do upotřebení při PCR.

• 1. Jakákoliv bílá usazenina se odstraní odstředěním a pro PCR se použije 5 µl supernatantu obsahujícího DNA.

• 6.1.b) Jiné metody

Jiné metody extrakce DNA by se mohly použít, pokud by se prokázalo, že jsou při purifikaci DNA z kontrolních vzorků obsahujících 10^3 až 10^4 patogenních buněk na 1 ml stejně efektivní.

• 6.2 PCR

• 6.2.1. Připraví se testované vzorky a kontroly pro PCR podle validovaného protokolu (dodatek 6). Připraví se jeden desetinný roztok vzorku DNA (1:10 ve sterilní vodě).

• 6.2.2. Připraví se příslušná reakční směs pro PCR v prostředí, kde nehrozí kontaminace, podle zveřejněného protokolu (dodatek 6). Validovaný protokol PCR je multiplexová reakce, která zahrnuje také interní kontrolu PCR.

• 6.2.3. Do sterilních PCR mikrozkumavek se přidá 5 µl extraktu DNA na 25 µl PCR reakce.

• 6.2.4. Zahrne se negativní kontrolní vzorek obsahující pouze reakční směs PCR a přidá se stejná sterilní voda UPW, která byla použita do směsi PCR namísto vzorku.

• 6.2.5. PCR mikrozkumavky se umístí do stejného termocykleru, který byl použit při počátečním testování a provede se vhodně optimalizovaný program PCR (dodatek 6)

• 6.3. Analýza produktu PCR

• 6.3.1. Rozdělí se amplikony PCR elektroforézou v agarózovém gelu. Nanese se nejméně 12 µl amplifikované reakční směsi DNA z každého vzorku smíchané s 3 µl nanášecího pufru (dodatek 6) do 2,0 % (w/v) agarózového gelu v Trisacetát-EDTA (TAE) pufru (dodatek 6) při 5-8 V na cm. Použije se vhodný marker DNA, např. 100 bp ladder.

• 6.3.2. Detekují se proužky DNA barvením v ethidium bromidu (0,5 mg na l) po dobu 30-45 minut, za použití vhodných bezpečnostních opatření pro zacházení s tímto mutagenem.

• 6.3.3. V obarveném a UV (krátké vlnové délky, např. 302 nm) prosvíceném gelu se hledají amplifikované produkty PCR o očekávané velikosti a výsledek se zdokumentuje.

• 6.3.4. U všech nových nálezů se zkontroluje pravost amplikonu PCR provedením restrikční enzymové analýzy ve zbývajícím vzorku amplifikované DNA inkubací při optimální teplotě a době s vhodným restrikčním enzymem a pufrem (viz dodatek 6). Rozdělí se naštěpené fragmenty elektroforézou v agarózovém gelu a pozoruje se charakteristický vzor restrikčního fragmentu pod UV prosvícením po obarvení ethidiumbromidem a porovnává se s neštěpenou a štěpenou pozitivní kontrolou.

Interpretace výsledku PCR testu:

PCR test je negativní, pokud amplikon typický pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus očekávané velikosti nebyl zjištěn v daném vzorku, ale byl zjištěn ve všech pozitivních kontrolních vzorcích (v případě vícenásobné PCR s rostlinnými interními kontrolními primery: druhý produkt PCR očekávané velikosti musí být amplifikován s daným vzorkem).

PCR test je pozitivní, pokud byl zjištěn amplikon typický pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus očekávané velikosti a vzoru (pokud se požaduje), za předpokladu, že nebyl amplifikován žádným z negativních kontrolních vzorků. Spolehlivého potvrzení pozitivního výsledku lze dosáhnout také opakováním testu s druhou sadou PCR primerů (oddíl 9.3).

Poznámka:

Lze mít podezření na inhibici PCR, pokud byl očekávaný amplikon získán z pozitivního kontrolního vzorku obsahujícího Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus ve vodě, ale z pozitivní kontroly s Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus v bramborovém extraktu byly negativní. Ve vícenásobných protokolech PCR s interními kontrolami PCR i inhibici reakce došlo, pokud nebyl získán žádný z obou amplikonů.

Lze mít podezření na kontaminaci, pokud byl očekávaný amplikon získán z jedné nebo více negativních zkoušek.

• 1. Test na lilku vejcoplodém

Poznámka:

Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění 10^3 až 10^4 jednotek Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus tvořících kolonie na 1 ml přidaný k extraktům ze vzorku, které byly testovány s negativním (příprava viz. dodatek 2)

Nejvyšší citlivost zjištění lze očekávat při použití čerstvě připraveného extraktu ze vzorku a optimálních růstových podmínkách. Metodu však lze úspěšně použít i na extrakty, které byly uchovávány v glycerolu při teplotě -68 až -86 °C.

Některé odrůdy lilku vejcoplodého poskytují vynikající selektivní obohacující médium pro růst Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus dokonce v případě nepřítomnosti příznaků a poskytují také vynikající základní konfirmační test.

Pro omezení nebezpečí falešně negativních výsledků by měly být vytvořeny optimální růstové podmínky.

Podrobnosti o pěstování jsou uvedeny v Dodatku 8.

• 7.1. Peleta podle 3.1.5. se rozdělí mezi rostliny lilku jednou z níže uvedených metod (7.2, 7.3, 7.4). Používají se pouze rostliny ve fázi 2-3 listů do úplného rozvinutí třetího pravého listu. Aby se zajistilo úplné využití resuspendované pelety i efektivní inokulaci, bude pro níže uvedené postupy potřeba 15-25 lilků na vzorek.

• 7.2. Inokulace zářezem I

• 7.2.1. Každý květináč se horizontálně podepře (pro květináče o průměru 10 cm je vhodný blok pěnového polystyrénu s vyhloubenou částí o rozměrech 5 cm hloubky, 10 cm šířky a 15 cm délky). Pro každý testovaný vzorek se mezi stonek a blok umístí proužek sterilní hliníkové fólie. Rostlinu je možno fixovat na místě gumovým páskem kolem bloku.

• 7.2.2. Pomocí skalpelu se provede mezi děložními lístky a prvním pravým listem podélný nebo mírně úhlopříčný řez dlouhý 0,5 až 1,0 cm a hluboký přibližně jako tři čtvrtiny průměru stonku.

• 7.2.3. Zářez se přidrží otevřený pomocí špičky čepele skalpelu a nanese se do něj inokulum štětečkem na oční linky nebo jemným malířským štětečkem namočeným do pelety. Zbytek pelety se rozdělí mezi všechny testovací rostliny lilku.

• 7.2.4. Řez se překryje sterilní vazelínou aplikovanou injekční stříkačkou o objemu 2 ml.

• 7.3 Inokulace zářezem II

• 7.3.1. Na stonek rostliny držené dvěma prsty se napipetuje mezi děložní lístky a první pravý list kapka (přibližně 5 až 10 µl) suspendované pelety.

• 7.3.2. Pomocí sterilního skalpelu se udělá sešikmený zářez (v úhlu přibližně 5°), dlouhý 1,0 cm a hluboký přibližně jako 2/3 tloušťky stonku, přičemž s řezem se začne v místě kapky suspendované pelety.

• 7.3.3. Řez se zakryje sterilní vazelínou z injekční stříkačky.

• 7.4. Inokulace injekční stříkačkou

• 7.4.1 Pro snížení vnitřního napětí buněk (turgoru) se rostliny lilku den před inokulací nezalévají.

• 7.4.2 Stonky lilku vejcoplodého se inokulují těsně nad děložními lístky pomocí injekční stříkačky s podkožní jehlou (ne méně než 23 G). Peleta se rozdělí mezi testovací rostliny lilku vejcoplodého.

• 7.5. Jako pozitivní kontrola se inokuluje 5 rostlin stejnou inokulační metodou (7.2, 7.3 nebo 7.4) vodní suspenzí 10^5 až 10^6 buněk na 1 ml známé kultury původce kroužkovitosti a kde je to možné i pletivem z přirozeně infikovaných hlíz bramboru.

• 7.6. Jako negativní kontrola se inokuluje 5 rostlin sterilním 0,05 M PBS stejnou inokulační metodou (7.2, 7.3 nebo 7.4).

• 7.7. Po inokulaci se rostliny nechají inkubovat v karanténě ve vhodných podmínkách (dodatek 8) po dobu až 4 týdnů při teplotě 18-24°C. Rostliny se inkubují za dostatečného osvětlení a vysoké vlhkosti (70-80%) a zalévají se tak, aby nedošlo k nasávání vody nebo vadnutí kvůli nedostatku vody. Buňky Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus odumírají při teplotách nad 30°C a optimální teplota je 21°C. Aby se zamezilo kontaminaci, inkubují se rostliny pro pozitivní a negativní kontroly ve skleníku nebo růstové komoře na jasně oddělených policích, anebo při nedostatku místa se zajistí přísné oddělení mezi zacházení s nimi. Pokud musí být rostliny pro různé vzorky inkubovány blízko sebe, oddělí se vhodnými přepážkami. Při hnojení, zalévání, kontrole a jiné manipulaci se věnuje maximální pozornost tomu, aby nedošlo ke kontaminaci. Je nezbytné, aby skleníky i růstové komory byly chráněny před veškerým hmyzem, protože by mohl přenášet bakterie z jednoho vzorku na druhý.

• 7.8. Pravidelně po osmi dnech se spočítají rostliny vykazující příznaky. Původce kroužkovitosti působí u lilku vejcoplodého vadnutí listů, které může začít jako okrajová nebo mezižilková ochablost (ztráta turgoru). Zvadlé pletivo může zprvu být tmavozelené nebo strakaté, ale před znekrotizováním zesvětlí. Povadlá místa mezi žilnatinou mívají často mastně vodnatý vzhled. Nekrotická pletiva mívají často jasně žlutý okraj. Rostliny vždy neodumírají; čím déle trvá období do objevení se příznaků, tím je větší naděje na přežití. Rostliny mohou infekci odrůst. Mladé rostliny lilku vejcoplodého jsou mnohem citlivější vůči nízkým koncentracím původce kroužkovitosti než starší rostliny, proto je nezbytné používat rostliny ve fázi tří listů a nebo krátce před ní. Vadnutí mohou také způsobovat populace jiných bakterií nebo hub přítomných v peletě z pletiv hlízy. Patří k nim Erwinia carotovora subsp. carotovora a E. carotovora subsp. atroseptica, Phoma exigua var. foveata, jakož i velké koncentrace saprofytických bakterií. Tyto případy vadnutí lze odlišit od případů způsobených původcem kroužkovitosti, jelikož rychle vadnou celé listy nebo celé rostliny. Může se také připravit Gramovo barvení: tento test rozliší Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus od Erwinia spp