Vyhláška o opatřeních k zabezpečení ochrany proti zavlékání a šíření původce bakteriální kroužkovitosti bramboru a původce bakteriální hnědé hniloby

Očekává-li se inhibice obohacení R. solanacearum z důvodu vysoké koncentrace konkurenčních saprofytických bakterií, lze docílit lepších výsledků obohacením extraktů ze vzorků před jakýmkoli odstřeďováním nebo jinými postupy zvyšování koncentrace.

• 6.1.5. Test IF

Postup

Použití testu IF jako hlavního screeningového testu se doporučuje kvůli dokázané spolehlivosti v dosažení požadovaných prahů.

Použije-li se test IF jako hlavní a výsledek IF testu je pozitivní, musí být jako druhý screeningový test použit test izolace, PCR nebo FISH. Jestliže je test IF použit jako druhý screeningový test a je pozitivní, je nutné provést další testování podle postupového diagramu, aby byla analýza úplná.

Poznámka:

Použije se validovaný zdroj protilátek R. solanacearum. Doporučuje se určit titr pro každou novou šarži protilátek. Titr je definován jako nejvyšší ředění, při kterém dojde k optimální reakci při testování suspenze obsahující 10^5 až 10^6 buněk/ml homologického kmene R. solanacearum a použitím vhodného konjugátu fluorescenčního isothiokyanatanu (FITC) podle doporučení výrobce. Validovaná polyklonální antiséra mají všechna titr IF nejméně 1:2 000. Během testování by měly být použity protilátky v pracovních ředěních blízkých nebo stejných jako titr.

Test by měl být proveden na čerstvě připravených extraktech ze vzorků. Jestliže je to nutné, může být úspěšně proveden na vzorcích uchovaných při teplotě - 68 až - 86 °C v glycerolu. Glycerol může být ze vzorku odstraněn přidáním 1 ml pufru (dodatek 4), 15minutovým odstřeďováním při 7000 g a resuspenzí ve stejném množství peletového pufru. Často to není potřeba, zvláště pokud jsou vzorky fixovány na sklíčka plamenem.

Připraví se oddělená pozitivní kontrolní sklíčka s homologickým kmenem nebo jiným referenčním kmenem R. solanacearum suspendovaným v bramborovém extraktu, jak je uvedeno v dodatku 3 B, a nepovinně v pufru.

Pletivo infikované přirozenou cestou (uchovávané lyofilizací nebo zmrazením při teplotě -16 až 24 °C) by se mělo podle možností použít jako paralelní kontrola na stejném podložním sklíčku.

Jako negativní kontroly se použijí alikvotní díly extraktů ze vzorků, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.

Standardizované materiály k pozitivní a negativní kontrole, které lze použít pro tento test, jsou uvedeny v dodatku 3.

Použijí se mikroskopická sklíčka s více okénky, pokud možno s 10 okénky s průměrem nejméně 6 mm.

Test kontrolního materiálu se provede týmž způsobem jako test vzorků.

• 6.1.5.1. Připraví se sklíčka k testování jedním z následujících postupů:

Napipetuje se odměřené standardní množství (15 µl je vhodné pro průměr okénka 6 mm - u většího okénka je množství větší v příslušném poměru) resuspendované bramborové pelety v ředění 1/100 do prvního okénka. Následně se napipetuje stejné množství nezředěné pelety (1/1) do zbývajících okének v řadě. Druhá řada může být použita jako duplikát nebo pro druhý vzorek, jak ukazuje obr. 1.

ii) Pro jiné pelety:

Připraví se desetinná ředění (1/10, 1/100) resuspendované pelety v peletovém pufru. Napipetuje se odměřené standardní množství (15 µl je vhodné pro průměr okénka 6 mm - u většího okénka je množství větší v příslušném poměru) resuspendované pelety pro každé ředění do řady okének. Druhá řada může být použita jako rezervní nebo pro druhý vzorek, jak ukazuje obr.2.

• 6.1.5.2. Vysuší se kapičky při okolní teplotě nebo zahřátím na teplotu 40 až 45 °C. Bakteriální buňky se fixují na sklíčko buď zahřátím (15 minut při teplotě 60 °C), plamenem, 95 % etanolem nebo podle konkrétních instrukcí od dodavatele protilátek.

Pokud je potřeba, fixovaná sklíčka je možné skladovat ve zmrazeném stavu v suchém boxu po nezbytně krátkou dobu (maximálně 3 měsíce) před dalším testováním.

• 6.1.5.3. Postup IF

Připraví se sada dvojnásobných zředění. První jamka by měla mít ^1/2 titru (T/2), ostatní ^1/4 titru (T/4), ^1/2 titru (T/2), titr (T) a dvojnásobek titru (2T).

ii) Podle přípravy sklíčka na test v odst. 5.1.ii):

Připraví se pracovní ředění (PŘ) protilátek v pufru IF. Pracovní ředění ovlivňuje přesnost.

Ředění resuspendované pelety

[image omitted]

Obrázek 1. Příprava sklíčka na test podle odst. 6.1.5.1.i) a 6.1.5.3.i)

Pracovní ředění antitiséra/protilátky

[image omitted]

Obrázek 2. Příprava sklíčka na test podle odst. 6.1.5.1.ii) a 6.1.5.3.ii)

• 1. Podložní sklíčka se uspořádají na navlhčený savý papír. Každé testovací okénko se pokryje kompletně ředěním protilátek. Množství protilátky na každém okénku musí být nejméně stejné jako množství použitého extraktu.

Pokud nejsou k dispozici konkrétní pokyny od dodavatele protilátek, postupuje se následovně:

• 1. Podložní sklíčka se inkubují na vlhkém papíře přikrytá po dobu 30 minut při pokojové teplotě (18-25°C).

• 1. Setřesou se kapky ze všech podložních sklíček a tato se pečlivě opláchnou pufrem IF. Umyjí se ponořením po dobu 5 minut v pufru IF Tween (dodatek 4) a následně v pufru IF. Je třeba zabránit vzniku aerosolu nebo přenosu kapiček, které by mohly způsobit vzájemnou kontaminaci. Pečlivě se odstraní přebytečná vlhkost jemným osušením.

• 1. Sklíčka se umístí na vlhký papír. Testovací okénka se pokryjí ředěním konjugátu FITC, kterým se stanovuje titr. Množství konjugátu naneseného do okének musí být stejné jako množství použité protilátky.

• 1. Sklíčka se inkubují zakrytá na vlhkém papíru po dobu 30 minut při pokojové teplotě (18-25°C).

• 1. Setřesou se kapky konjugátu ze sklíčka. Sklíčko se opláchne a umyje jako předtím (3.).

Opatrně se odstraní přebytečná vlhkost.

• 1. Napipetuje se 5-10 ul 0,1M fosfátového pufru s glycerolem (dodatek 4) nebo komerční krycí tekutiny do každého okénka a přiloží se krycí sklíčko.

• 6.1.5.4. Vyhodnocení IF testu

• 1. Prohlížejí se testovací sklíčka epifluorescenčním mikroskopem s filtry vhodnými pro excitaci FITC pod olejovou nebo vodní imersí při zvětšení 500x až 1 000x. Zkoumají se okénka ve dvou navzájem kolmých průměrech a kolem obvodu. U vzorků s žádnými nebo malým počtem buněk se zkoumá nejméně 40 polí mikroskopu.

Nejdřív se zkontroluje pozitivní kontrolní vzorek. Buňky musí být jasně fluoreskující a zcela obarvené v určeném titru protilátky nebo pracovním ředění. Pokud je barevnost odchylná, musí být test IF opakován (odst. 6.1.5).

• 1. Pozorují se jasně fluoreskující buňky s charakteristickou morfologií R. solanacearum v testovacích okéncích sklíčka. Intenzita fluorescence musí být při porovnání s pozitivním kontrolním kmenem ve stejném ředění protilátky stejná nebo lepší. Buňky s neúplným zbarvením nebo slabou fluorescencí nelze brát v úvahu.

Při podezření z jakékoli kontaminace musí být test zopakován. To se může stát, když všechna sklíčka ve skupině vykazují pozitivní buňky díky kontaminaci pufru nebo při zjištění pozitivních buněk (mimo okénka sklíček) na povrchu sklíček.

• 1. Existuje několik problémů podstatných pro přesnost imunofluorescenčního testu. V peletách z pupkové části bramboru a částí stonku se mohou vyskytnout doprovodné populace fluoreskujících buněk s atypickou morfologií a křížově reagující saprofytické bakterie s velikostí a morfologií podobnou R. solanacearum.

• 1. Berou se v úvahu pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí a morfologií v titru nebo pracovním ředění protilátek podle oddílu 6.1.5.3.

• 1. Interpretace výsledků testu IF:

Výsledek IF je pozitivní u vzorků, kde je počet typických buněk na 1 ml resuspendované pelety nejméně 5 × 10^3. Vzorek je považován za potenciálně infikovaný a je povinné další testování.

ii) Výsledek IF testu je negativní pro vzorky, které obsahují méně než 5 × 10^3 buněk na 1 ml resuspendované pelety a vzorek se považuje za negativní. Další testování není nutné.

• 6.1.6. Testy PCR

Principy

Použije-li se test PCR jako hlavní screeningový test a výsledek je pozitivní, musí být povinně proveden druhý screeningový test, a sice izolace nebo IF. Jestliže je PCR použita jako druhý screeningový test a je pozitivní, je nutné provést další testování podle postupového diagramu, aby byla analýza úplná.

Využití této metody v celém rozsahu jako hlavního screeningového testu se doporučuje jen tehdy, je-li požadována specializovaná expertíza.

Poznámka:

Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění 10^3 až 10^4 buněk R. solanacearum na 1 ml přidaný do vzorků extraktů, které byly předtím testovány jako negativní. Dosažení maximální citlivosti a přesnosti ve všech laboratořích může vyžadovat optimalizační pokusy.

Použijí se schválená činidla a protokoly PCR (viz dodatek 6). Pokud možno, zvolí se metoda s interní kontrolou.

Je třeba použít vhodná bezpečnostní opatření k zabránění kontaminace vzorku cílovou DNA. Test PCR by měl být prováděn zkušenými laboranty v laboratořích specializovaných na molekulární biologii, aby se minimalizovala možnost kontaminace cílovou DNA.

S negativními kontrolami (v průběhu extrakce DNA a PCR) by se mělo vždy zacházet jako s konečnými vzorky, aby bylo jasné, jestli došlo k přenosu DNA.

PCR test by měl zahrnovat následující negativní kontroly:

• extraktu ze vzorku, který byl předtím testován na R. solanacearum s negativním výsledkem,

• kontroly pufru používaného pro extrakci bakterií a DNA ze vzorku,

• reakční směs PCR.

Měly by být zahrnuty následující pozitivní kontroly:

• alikvotní části resuspendovaných pelet, do kterých byla přidána R. solanacearum (přípravu viz dodatek 3 B);

• suspenze 10^6 buněk na 1 ml R. solanacearum ve vodě z virulentního izolátu (např. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; viz dodatek 3 B);

• pokud možno, při PCR použít také DNA extrahovanou z pozitivních kontrolních vzorků.

Aby se zabránilo případné kontaminaci, připravují se pozitivní kontroly v prostředí odděleném od vzorků, které budou testovány.

Extrakty ze vzorků by měly být pokud možno bez zeminy. V případě použití PCR testu je potřeba připravit extrakty z umytých brambor.

Standardizované materiály k pozitivní a negativní kontrole, které lze použít pro tento test, jsou uvedeny v dodatku 3.

• 6.1.6.1. Metody purifikace DNA

Používají se výše popsané pozitivní a negativní kontrolní vzorky (viz. dodatek 3).

Test kontrolního materiálu se provede týmž způsobem jako test vzorků.

K purifikaci cílové DNA z komplexních substrátů vzorků jsou k dispozici různé metody odstraňující inhibitory PCR a jiných enzymových reakcí a koncentrující cílovou DNA ve vzorku. Následující metoda byla optimalizována pro použití se schválenými metodami PCR uvedenými v dodatku 6.

• a) Metoda podle Patrika (2000)

• 1. Napipetuje se 220 µl lyzátového pufru (100mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)) do 1,5 ml Eppendorfovy mikrozkumavky.

• 1. Přidá se 100 µl extraktu ze vzorku a mikrozkumavka se umístí do termobloku nebo vodní lázně s teplotou 95 °C na 10 min.

• 1. Mikrozkumavka se vloží na 5 min. do ledu.

• 1. Přidá se 80 µl zásobního roztoku lysozymu (50 mg lysozymu/na 1 ml 10 mM TrisHCl, pH 8,0) a inkubuje při teplotě 37 °C po dobu 30 minut.

• 1. Přidá se 220 µl roztoku Easy DNA® A (Invitrogen), dobře promíchá třepáním a inkubuje se při teplotě 65 °C po dobu 30 minut.

• 1. Přidá se 100 µl roztoku Easy DNA® B (Invitrogen), důkladně promíchá třepáním, pokud vzorek nezačne být stejnoměrně viskózní.

• 1. Přidá se 500 µl chloroformu a promíchá, až se viskozita sníží a směs se stane homogenní.

• 1. Pro oddělení fází a vytvoření mezifáze se směs odstřeďuje při 15 000 g po dobu 20 min. při teplotě 4 °C.

• 1. Horní fáze se převede do nové Eppendorfovy mikrozkumavky.

• 1. Přidá se 1 ml 100 % etanolu (- 20 °C), krátce promíchá třepáním a inkubuje se na ledu po dobu 10 min.

• 1. Odstřeďuje se při 15 000 g po dobu 20 minut při teplotě 4 °C a odstraní se etanol z pelety.

• 1. Přidá se 500 µl 80 % etanolu (- 20 °C) a promíchá se překlápěním mikrozkumavky.

• 1. Odstřeďuje se při 15 000 g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C, zachová se peleta a odstraní etanol.

• 1. Peleta se nechá uschnout na vzduchu nebo v DNA odparce.

• 1. Peleta se resuspenduje v 100 µl sterilní UPW a nechá se stát při pokojové teplotě nejméně 20 minut.

• 1. Skladuje se při teplotě - 20 °C až do použití při PCR.

• 1. Jakákoliv bílá sraženina se odstraní odstředěním. 5 µl supernatantu obsahujícího DNA se použije pro test PCR.

• b) Jiné metody

Jiné metody extrakce DNA, např. Qiagen DNeasy Plant Kit, by se mohly použít, pokud by se prokázalo, že jsou při purifikaci DNA z kontrolních vzorků obsahujících 10^3 až 10^4 patogenních buněk na 1 ml stejně efektivní.

• 6.1.6.2. PCR

• 1. Připraví se testované vzorky a kontroly pro PCR podle schválených protokolů (6.1.6). Připraví se desetinásobné ředění vzorku extraktu DNA (1:10 ve sterilní vodě).

• 1. Připraví se příslušná reakční směs pro PCR v prostředí, ve kterém nehrozí kontaminace podle zveřejněných protokolů (dodatek 6). Pokud možno, doporučuje se použít multiplexní protokol PCR, který rovněž zahrnuje interní protokol PCR.

• 1. Do sterilních PCR mikrozkumavek se přidá 5 µl extraktu DNA na 25 µl PCR reakce podle protokolů PCR (viz dodatek 6).

• 1. Přidají se negativní kontrolní vzorky obsahující pouze reakční směs PCR a přidá se týž zdroj UPW jako byl ten, který byl použit ve směsi PCR místo vzorku.

• 1. PCR mikrozkumavky se umístí do téhož termocykleru, který byl použit při počátečním testování, a spustí se vhodně optimalizovaný program PCR (dodatek 6).

• 6.1.6.3. Analýza produktu PCR

• 1. Amplikony se rozdělí elektroforézou v agarózovém gelu. Nanese se nejméně 12 µl směsi amplifikované DNA z každého vzorku s 3 µl nanášecího pufru (dodatek 6) do 2,0 % (w/v) agarózového gelu v Tris-acetát-EDTA (TAE) pufru (dodatek 6) při 5-8 V/cm. Použije se vhodný DNA marker, např. (ladder) 100 bp.

• 1. Detekují se proužky DNA obarvením v ethidiumbromidu (0,5 mg/l) po dobu 30-60 minut za použití vhodných bezpečnostních opatření pro zacházení s tímto mutagenem.

• 1. V obarveném a UV (krátké vlnové délky např. 302 nm) prosvíceném gelu se hledají amplifikované produkty PCR o očekávané velikosti a výsledek se zdokumentuje.

• 1. U všech nových nálezů/případů se zkontroluje pravost amplikonu PCR provedením restrikční enzymové analýzy ve zbývajícím vzorku amplifikované DNA inkubací při optimální teplotě a čase shodným restrikčním enzymem a pufrem (viz dodatek 6). Naštěpené fragmenty se rozdělí elektroforézou v agarózovém gelu a pozoruje se charakteristický vzor restrikčních fragmentů pod UV světlem po obarvení ethidiumbromidem a porovnává se s neštěpenou a štěpenou pozitivní kontrolou.

Interpretace výsledků testu PCR

Test PCR je negativní, jestliže amplikon PCR specifický pro R. solanacearum očekávané velikosti není u zkoumaného vzorku zjištěn, ale je zjištěn u všech pozitivních kontrolních vzorků (v případě vícenásobné PCR s interními kontrolními primery specifickými pro rostlinu: druhý produkt PCR očekávané velikosti musí být amplifikován se zkoumaným vzorkem).

Test PCR je pozitivní, jestliže je zjištěn amplikon PCR specifický pro R. solanacearum očekávané velikosti a (případně) vzoru, za předpokladu, že není amplifikován u žádného vzorku negativní kontroly. Spolehlivé potvrzení pozitivního výsledku lze také získat opakováním testu s druhou sadou primerů PCR dodatek 6).

Poznámka:

Lze mít podezření na inhibici PCR, jestliže je získán očekávaný amplikon ze vzorku pozitivní kontroly obsahujícího R. solanacearum ve vodě, zatímco ze vzorku pozitivní kontroly R. solanacearum v bramborovém extraktu byly získány negativní výsledky. V multiplexních protokolech PCR s interními kontrolami PCR nasvědčuje inhibici reakce, jestliže není získán žádný ze dvou amplikonů.

V případě, že očekávaný amplikon je získán z jednoho nebo více vzorků negativních kontrol, je podezření na kontaminaci.

• 6.1.7. Test FISH

Princip

Když se jako první screeningový test použije FISH test a je pozitivní, musí být jako druhý povinný screeningový test provedena izolace nebo IF test. Když se FISH test provede jako druhý vyšetřovací test a je pozitivní, je k dokončení diagnózy nutné další testování podle postupového diagramu.

Poznámka:

Používají se schválené oligosondy specifické pro R. solanacearum (dodatek 7). Úvodní testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění alespoň 10^3-10^4 buněk R. solanacearum na ml přidané do extraktů ze vzorku, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.

Následující postup by měl být pokud možno proveden s čerstvě připravenými extrakty, ale je možné jej úspěšně provést s extraktem, který byl uchován v glycerolu při teplotě - 16 až - 24 °C nebo - 68 až - 86 °C.

Jako negativní kontrola se použije alikvotní část extraktu ze vzorku, který byl předtím testován na R. solanacearum s negativním výsledkem.

Jako pozitivní kontrola se připraví suspenze obsahující 10^5 až 10^6 buněk na 1 ml R. solanacearum biovar 2 (např. kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, viz dodatek 3) v 0,01M fosfátovém pufru (PB) ze 3-5 denní kultury. Připraví se samostatná sklíčka s pozitivními kontrolními vzorky homologického kmenu nebo jiného referenčního kmene R. solanacearum, suspendovaného v bramborovém extraktu, jak je uvedeno v dodatku 3 B.

Použití eubakteriálních oligosond značených FITC poskytuje kontrolu procesu hybridizace, protože zbarví všechny eubakterie přítomné ve vzorku.

Standardizovaný pozitivní a negativní kontrolní materiál, který se používá v tomto testu, je uveden v dodatku 3 bodu A.

Test kontrolního materiálu se provede stejným způsobem jako u vzorku(ů).

• 6.1.7.1. Fixace bramborového extraktu

Následující protokol vychází z Wullingse et al. (1998).

• 1 Připraví se fixační roztok (viz dodatek 7).

• 1. Napipetuje se 100 µl každého vzorkového extraktu do Eppendorfovy mikrozkumavky a odstřeďuje se po dobu 7 minut na 7 000 g.

• 1. Odstraní se supernatant a rozpustí se peleta ve 200 µl fixačního roztoku připraveného max. 24 hodin předem. Protřepe se a inkubuje 1 hodinu v chladícím zařízení.

• 1. Odstřeďuje se 7 minut při 7 000 g, odstraní se supernatant a resuspenduje se peleta v 75 µl 0,01M PB (viz dodatek 7).

• 1. Kápne se 16 µl fixované suspenze na čisté 10 okénkové sklíčko, jak ukazuje obrázek 7.1, přičemž se použijí 2 různé vzorky na jedno sklíčko, a to neředěný a zředěný 1:100 s použitím 10 µl (v 0,01 M PB). Zbývající roztok vzorku (49 µl) může být uložen při teplotě - 20 °C po přidání 1 objemového množství 96 % etanolu. V případě, že je třeba FISH metodu opakovat, odstraní se etanol odstředěním a přidá se stejné množství 0,01 PB (zamíchá se protřepáním).

Obrázek 7.1 Rozmístění na sklíčku FISH

[image omitted]

• 1. Sklíčka se nechají uschnout na vzduchu (nebo v sušičce sklíček při teplotě 37 °C) a fixují se nad plamenem.

V této fázi je možné postup přerušit a pokračovat v hybridizaci další den. Sklíčka by měla být skladována chráněna před prachem a v suchu při pokojové teplotě.

• 6.1.7.2. Hybridizace

• 1. Dehydratují se buňky v postupné etanolové řadě 50 %, 80 % a 96 %, pokaždé po dobu 1 minuty. Osuší se vzduchem v držáku sklíček.

• 1. Připraví se vlhká inkubační komora přikrytím dna vzduchotěsného boxu tkaninou nebo filtračním papírem nasáklým hybridizační směsí (1x hybmix, dodatek 7). Před inkubací se ohřeje box v hybridizační peci při teplotě 45 °C po dobu nejméně 10 minut.

• 1. Použije se 10 µl hybridizačního roztoku (dodatek 7) na 8 okének (okénka 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 a 10; viz obr.7.1) na každém sklíčku, přičemž dvě středová okénka (3 a 8)se nechají prázdná.

• 1. Přiloží se krycí sklíčka (24 x 24 mm) na první a poslední 4 okénka, a to tak, aby pod ně nevnikl vzduch. Sklíčka se umístí do předem zahřáté vlhké komory a nechá se proběhnout proces hybridizace po dobu 5 hodin v troubě při teplotě 45 °C v temnu.

• 1. Připraví se 3 kádinky obsahující 1 l vody s molekulární kvalitou (Milli Q), 1 l 1x hybmix (334 ml 3x hybmix a 666 ml vody s molekulární kvalitou) a 1 l 1/8x hybmixu (42 ml 3x hybmix a 958 ml vody s molekulární kvalitou). Nechají se inkubovat ve vodní lázni o teplotě 45 °C.

• 1. Sejmou se krycí sklíčka a podložní sklíčka se umístí do držáku sklíček.

• 1. Spláchne se nadbytek vzorku inkubací po dobu 15 minut v kádince s 1 x hybmixem při teplotě 45°C.

• 1. Držák sklíček se přemístí do promývacího roztoku 1/8 hybmix a nechá se inkubovat dalších 15 minut.

• 1. Sklíčka se krátce ponoří do UPW (např. Milli Q water) a položí na filtrační papír. Odstraní se nadbytečná vlhkost lehkým zakrytím povrchu filtračním papírem. Napipetuje se 5-10 µl krycího roztoku (např. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA nebo podobný) do každého okénka a celé sklíčko se zakryje velkým krycím sklíčkem (24 x 60 mm).

• 6.1.7.3. Hodnocení FISH testu

• 1. Sklíčka se ihned prohlížejí pod mikroskopem vhodným pro epifluorescenční mikroskopii se zvětšením 630 x nebo 1 000 x pod olejovou imerzí. S filtrem vhodným pro fluorescein isothiokyanat (FITC) jsou eubakteriální buňky(včetně většiny gramnegativních buněk) ve vzorku zbarveny fluorescenčně zeleně. Použitím filtru pro tetramethylrhodamin-5-isothiokyanat se buňky R. solanacearum obarvené Cy3 jeví fluorescenčně červené. Porovnává se buněčná morfologie s morfologií pozitivních kontrolních vzorků. Buňky musí být jasně fluoreskující a zcela zbarveny. Test FISH (odst. 6.1.7) musí být zopakován, pokud je zbarvení odchylné. Prohlížejí se okénka napříč dvěma průměry v pravých úhlech a kolem obvodu. U vzorků, kde nejsou pozorovány žádné nebo málo buněk, se pozoruje nejméně 40 polí mikroskopu.

• 1. Hledají se jasně fluoreskující buňky s morfologií charakteristickou pro R. solanacearum v okénkách testovacích sklíček. Intenzita fluorescence musí odpovídat nebo být lepší než u pozitivního kontrolního kmene. Buňky, které nejsou zcela zbarveny nebo vykazují slabou fluorescenci, se neberou v úvahu.

• 1. Při podezření na jakoukoli kontaminaci musí být test opakován. To může nastat v případě, kdy všechna sklíčka ve várce ukazují pozitivní buňky z důvodu kontaminace pufru nebo jestliže jsou pozitivní buňky zjištěny (vně okénka sklíčka) na krytu sklíčka.

• 1. Specifičnost testu FISH s sebou nese několik problémů. Je pravděpodobné, že u pletiv z bramborových hlíz a pelet ze stonkových partií bramboru dojde k výskytu populací fluorescenčních buněk na pozadí s atypickou morfologií a ke křížové reakci se saprofytickými bakteriemi velikostí a morfologií podobnými R. solanacearum, i když mnohem méně častěji než u testu IF.

• 1. V úvahu se berou pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí a morfologií.

• 1. Interpretace výsledků testu FISH

ii) Výsledek FISH testu je negativní, pokud při použití rhodaminového filtru nejsou pozorovány jasně červeně fluoreskující buňky s velikostí a morfologií typickou pro R. solanacearum, jestliže jsou tyto typické jasně červeně fluoreskující buňky při použití rhodaminového filtru pozorovány v pozitivních kontrolách.

• 6.1.8. Testy ELISA

Princip

Testy ELISA lze použít pouze jako volitelný test kromě testů IF, PCR nebo FISH pro jeho relativně nízkou citlivost. Při použití DAS ELISA je obohacení a použití monoklonálních protilátek povinné. Obohacení vzorků před použitím testu ELISA může zvýšit citlivost testu, ale může se rovněž setkat s nezdarem kvůli konkurenci jiných organismů ve vzorku.

Poznámka:

Použije se validovaný zdroj protilátek R. solanacearum. Doporučuje se určení titru pro každou novou šarži protilátek. Titr je definován jako nejvyšší ředění, při kterém dojde k optimální reakci při testování suspense obsahující 10^5 až 10^6 buněk na 1 ml homologického kmene R. solanacearum a použití vhodných druhotných konjugátů protilátek podle doporučení výrobce. Při testování by měly být použity protilátky v pracovním ředění, které je blízké nebo stejné jako u titru komerční formulace.

Určí se titr protilátek pro suspenzi 10^5 až 10^6 buněk na 1 ml homologického kmene R. solanacearum.

Vzorek, který byl předtím otestován jako R. solanacearum negativní a suspenze bakterií bez vzájemného působení v solném roztoku fosfátového pufru (PBS) se použijí jako vzorky negativní kontroly.

Jako pozitivní kontrolní vzorky se použijí alikvótní podíly vzorkových extraktů, které byly předtím otestovány jako negativní, s příměsí 10^3 až 10^4 buněk na 1 ml biovaru 2 R. solanacearum (např. kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, viz dodatek 2 A a B). Pro srovnání výsledků na každé destičce se použije standardní suspenze 10^5 až 10^6 buněk na 1 ml v PBS R. solanacearum. Pozitivní kontrolní vzorky musí být na mikrotitrové destičce dobře odděleny od vzorků k testování.

Standardizované pozitivní a negativní materiály, které se používají pro tento test, jsou uvedeny v dodatku 3 bodu A.

Test kontrolního materiálu se provede týmž způsobem jako test vzorku(ů).

Validované jsou dva protokoly ELISA.

• a) Nepřímý test ELISA (Robinson Smith et al., 1995)

1) Použije se 100-200 µl vzorkového extraktu. (Zahřátí na 100 °C na 4 minuty ve vodní lázni nebo topném boxu může v některých případech redukovat vznik nespecifických výsledků).

2) Přidá se stejné množství dvojnásobně silného uhličitanového krycího pufru (dodatek 4) a směs se promíchá.

3) Nakape se 100 µl do každé jamky mikrotitrační destičky (např. Nunc-Polysorp nebo rovnocenné) a nechá se inkubovat 1 hodinu při teplotě 37 °C nebo 14 – 18 h při teplotě 4 °C.

4) Extrakty se vylijí z jamek. Jamky se třikrát vymyji pomocí PBS-Tween (dodatek 4) a poslední vymývací roztok se nechá v jamce nejméně 5 minut.

5) Připraví se vhodné ředění protilátek proti R. solanacearum v blokačním pufru (dodatek 4). U validovaných komerčních protilátek se použijí doporučená ředění (obvykle dvojnásobné koncentrace, než je titr).

6) Přidá se 100 µl do každé jamky a nechá se inkubovat 1 hodinu při teplotě 37 °C.

7) Roztok protilátek se vylije z jamek a jamky se vymyjí jako předtím (bod 4.).

8) Připraví se vhodné ředění konjugátu alkalické fosfatázy v blokačním pufru. Přidá se 100 µl do každé jamky a nechá se inkubovat 1 hodinu při teplotě 37 °C.

9) Konjugát se vylije z jamek a jamky se vymyjí jako předtím (bod 4).

10) Přidá se 100 µl substrátového alkalického roztoku fosfatázy (dodatek 4) do každé jamky. Nechá se inkubovat v temnu při pokojové teplotě a odečítá se absorbance při 405 nm v pravidelných 90minutových intervalech.

• b) DAS-ELISA

1) Připraví se vhodné ředění polyklonálního imunoglobulinu v uhličitanovém pufru pH 9.6 (dodatek 4). Přidá se 200 µl do každé jamky. Nechá se inkubovat při teplotě 37 °C 4 až 5 hodin nebo 4 ° C po dobu 16 hodin.

2) Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).Přidá se 190 µl extraktu ze vzorku do nejméně dvou jamek. Přidají se rovněž pozitivní a negativní kontrolní vzorky do dvou jamek na každé destičce. Nechá se inkubovat 16 hodin při teplotě 4 °C.

3) Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).

4) Připraví se vhodné ředění specifických monoklonálních protilátek R. solanacearum v PBS (dodatek 4) s obsahem 0,5 % hovězího sérového albuminu (BSA), přidá se 190 µl do každé jamky a nechá stát 2 hodiny při teplotě 37 °C.

5) Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).

6) Připraví se ředění protimyšího imunoglobulinu konjugovaného alkalickou fosfatázou v PBS. Přidá se 190 µl do každé jamky a nechá se inkubovat 2 hodiny při teplotě 37 °C.

7) Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).

8) Připraví se roztok 1 mg p-NPP/ml alkalické fosfatázy v substrátovém pufru (dodatek 4). Přidá se 200 µl do každé jamky a inkubuje se v temnu při pokojové teplotě. Absorbance při 405 nm se odečítá v pravidelných intervalech 90 minut.

Interpretace výsledků testu ELISA

Test ELISA je negativní, jestliže průměrná hodnota optické hustoty (OH) z jamek se stejnými vzorky je menší než dvojnásobek OH u negativního kontrolního vzorku, pokud všechny hodnoty OH pozitivních kontrolních vzorků jsou větší než 1,0 (po 90 minutách inkubace se substrátem) a jsou větší než dvojnásobek OH získané z negativních vzorkových extraktů.

Test ELISA je pozitivní, jestliže průměrné hodnoty OH z jamek se stejným vzorkem jsou větší než dvojnásobek OH v negativním extraktu testovaného vzorku, pokud hodnoty OH ve všech negativních kontrolních vzorcích jsou menší než dvojnásobek hodnot v pozitivních kontrolních vzorcích.

Negativní hodnoty ELISA v pozitivních kontrolních vzorcích ukazují, že test nebyl proveden správně nebo že byl inhibován. Pozitivní hodnoty ELISA v negativních kontrolních vzorcích ukazují, že došlo k vzájemné kontaminaci nebo nespecifickému vázání protilátek.

• 6.1.9. Biotest

Poznámka.:

Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelnou detekci 10^3 až 10^4 jednotek tvořících kolonie R. solanacearum na 1 ml přidaný do extraktu ze vzorku, který byl předtím testován s negativním výsledkem (přípravu viz v dodatku 3).

Nejvyšší citlivost zjištění lze očekávat při použití čerstvě připraveného extraktu ze vzorku a v optimálních růstových podmínkách. Metodu lze však také úspěšně použít na extrakty, které byly uchovány v glycerolu v teplotě - 68 až - 86 °C.

Následující protokol vychází z Janseho (1988):

• 6.1.9.1. Použije se 10 testovacích rostlin citlivé odrůdy rajčete (např. kultivaru Moneymaker nebo kultivaru s rovnocennou citlivostí podle testovací laboratoře) ve fázi třech pravých listů u každého vzorku. Podrobnosti pěstování viz. v dodatku 8. Nebo se použije lilek (např. kultivar Black Beauty nebo kultivary s rovnocennou citlivostí), ale jen rostliny ve fázi 2. až 3. listů až do plného rozvinu třetího pravého listu. Příznaky u lilku jsou méně výrazné a vyvíjejí se pomaleji. Pokud možno, doporučujeme proto použít sazenice rajčat.

• 6.1.9.2. Rozdělí se 100 µl extraktu ze vzorku mezi testovací rostliny.

• 1. Inokulace injekční stříkačkou

Inokulují se stonky rostlin hned nad děložními listy pomocí stříkačky s podkožní jehlou (ne méně než 23G). Vzorek se rozdělí mezi testovací rostliny.

• 1. Inokulace zářezem

Rostlina se přidrží mezi dvěma prsty a pipetou se kápne přibližně 5-10 µl suspendované pelety na stonek mezi děložními listy a prvním listem.

Sterilním skalpelem se udělá příčný řez asi 1 cm dlouhý a hluboký přibližně 2/3 tloušťky stonku, přičemž řez se začne v místě kapky resuspendované pelety.

Řez se utěsní sterilní vazelínou z injekční stříkačky.

• 6.1.9.3. Stejnou technikou se nainokulujte 5 sazenic vodní suspenzí 10^5 až 10^6 buněk na 1 ml, připravenou ze 48 hodinové kultury virulentního kmene biovaru 2 R. solanacearum jako pozitivní kontrolní vzorek, a peletovým pufrem (dodatek 4) jako negativní kontrolní vzorek. Oddělí se pozitivní a negativní kontrolní rostliny od ostatních rostlin, aby se zabránilo vzájemné kontaminaci.

• 6.1.9.4. Testovací rostliny se nechají růst v karanténním zařízení 4 týdny při teplotě 25 -30 °C a vysoké relativní vlhkosti s přiměřeným zavlažováním, aby se zabránilo jak přemokření, tak vadnutí z důvodu nedostatku vody. Aby se zabránilo kontaminaci, musí být drženy pozitivní a negativní kontrolní rostliny ve zcela oddělených místech skleníku nebo vegetační komory nebo jinak přísně izolovány. Musejí-li být rostliny z různých vzorků po dobu inkubace drženy blízko sebe, oddělí se vhodnými zástěnami. Při hnojení, zalévání, prohlížení a všech ostatních činnostech se věnuje zvláštní pozornost tomu, aby nedošlo k vzájemné kontaminaci. Nutné je udržovat skleník nebo vegetační prostor bez hmyzích škůdců, protože by mohli přenést bakterie mezi vzorky.

Hledají se příznaky vadnutí, epinastie, chloróz anebo krnění rostlin.

• 6.1.9.5. Z infikovaných rostlin se provede izolace (odst. 2.3) a identifikují se podezřelé čisté kultury (bod 6.2.).

• 6.1.9.6. Jestliže během 3 týdnů nejsou pozorovány žádné příznaky, provede se test IF/PCR/izolace na složeném vzorku ze segmentů stonků dlouhých 1 cm z každé testovací rostliny, odebraných nad místem inokulace. Je-li test pozitivní, provedou se zřeďovací roztěry (bod 4.1).

• 6.1.9.7. Identifikují se všechny čisté kultury s podezřením na R. solanacearum (bod 6.2.).

Interpretace výsledků biotestu

Platné výsledky biotestu jsou získány, jestliže pozitivní kontrolní testovací rostliny vykazují typické příznaky, bakterie mohou být z těchto rostlin znovu izolovány a negativní kontrolní rostliny nevykazují žádné příznaky.

Biotest je negativní, jestliže rostliny nejsou infikovány bakteriemi R. solanacearum, pokud byl organismus zjištěn u pozitivních kontrolních testovacích rostlin.

Biotest je pozitivní, jestliže testovací rostliny jsou infikovány bakteriemi R. solanacearum.

• 6.2. Identifikační testy

Identifikují se čisté kultury izolovaného podezřelého organismu R. solanacearum použitím nejméně dvou následujících testů založených na různých biologických principech.

Zahrnou se případně známé referenční kmeny pro každý provedený test (viz dodatek 3).

• 6.2.1. Výživové a enzymatické identifikační testy

Určují se následující fenotypové vlastnosti, které jsou vesměs přítomny nebo naopak chybí u R. solanacearum, metodami Lelliott a Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001).

Text	Očekávaný výsledek
Produkce fluorescenčního pigmentu	-
Inkluze PHB	+
Oxidačně fermentační test	O+/F-
Katalázová aktivita	+
Oxidázový test podle Kovacse	+
Redukce dusičnanů	+
Využití citrátů	+
Růst při 40°C	-
Růst v 1% NaCl	+
Růst v 2% NaCl	-
Arginin-dihydrolázová aktivita	-
Ztekucení želatiny	-
Hydrolýza škrobu	-
Hydrolýza eskulinu	-
Produkce levanu	-

Média a metody viz. Lelliot &Stead (1987).

• 6.2.2. Test IF

• 6.2.2.1. Připraví se suspenze přibližně 10^6 buněk na 1 ml v pufru IF (dodatek 4).

• 6.2.2.2. Připraví se řada dvojnásobných zředění vhodného antiséra.

• 6.2.2.3. Použije se IF metoda (6.1.5.).

• 6.2.2.4. Test IF je pozitivní, jestliže titr IF kultury odpovídá titru pozitivní kontroly.

• 6.2.3. Test ELISA

Poznámka:

Při provádění pouze 2 identifikačních testů se nepoužívá kromě této metody jiný sérologický test.

• 6.2.3.1. Připraví se suspenze přibližně 10^8 buněk na 1 ml v 1X PBS (dodatek 4).

• 6.2.3.2. Provede se test ELISA se specifickou monoklonální protilátkou k R. solanacearum.

• 6.2.3.3. Test ELISA je pozitivní, jestliže hodnota jeho výsledku získaná z této kultury je nejméně poloviční v porovnání s hodnotou z pozitivní kontroly.

• 6.2.4. Testy PCR

• 6.2.4.1. Připraví se suspenze přibližně 10^6 buněk na 1 ml sterilní vody (UPW = ultra pure water).

• 6.2.4.2. Ohřeje se 100 µl buněčné suspense v uzavřených zkumavkách v ohřívacím bloku nebo vařící vodní lázni při 100 °C 4 minuty. Vzorky mohou být uchovány při teplotě - 16 až - 24 °C do dalšího použití.

• 6.2.4.3. Použijí se příslušné postupy PCR k amplifikaci amplikonů specifických pro R. solanacearum (např. Seal et al. (1993); Pastrik a Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997), Weller et al. (1999).

• 6.2.4.4. Identifikace organismu R. solanacearum je pozitivní, jestliže amplikony PCR mají stejnou velikost a mají stejnou mnohotvárnost délky fragmentů jako pozitivní kontrolní kmen.

• 6.2.5. Test FISH

• 6.2.5.1. Připraví se suspenze přibližně 10^6 buněk na 1 ml v UPW.

• 6.2.5.2. Použije se metoda FISH (6.1.7) s nejméně 2 oligosondami specifickými pro R. solanacearum (dodatek 7).

• 6.2.5.3. Test FISH je pozitivní, jestliže se u kultury a pozitivní kontroly dosáhne stejných reakcí.

• 6.2.6. Analýza mastných kyselin (FAP)

• 6.2.6.1. Pěstuje se kultura na tryptikázo-sójovém agaru (Oxoid) 48 hodin při teplotě 28 °C.

• 6.2.6.2. Použijte se metoda FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).

• 6.2.6.3. Test FAP je pozitivní, jestliže je profil podezřelé kultury stejný jako profil pozitivní kontroly. Výskyt charakteristických mastných kyselin: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH a 18:1 2OH a absence 16:0 3 OH poukazuje na Ralstonia sp.

• 6.2.7. Metody charakteristiky kmenů

Pro každý nový případ izolace R. solanacearum se doporučuje charakteristika kmenu použitím jedné z následujících metod.

U každého provedeného testu se zahrnou případně známé referenční kmeny (viz. dodatek 3).

• 6.2.7.1. Stanovení biovaru

R. solanacearum tvoří biovary lišící se schopností využití a/nebo oxidace tří disacharidů a tří hexosových alkoholů (Hayward, 1964 a Hayward et al., 1990). Živná půda pro test biovaru je popsána v dodatku 2. Test lze úspěšně provést očkováním do živné půdy s čistou kulturou R. solanacearum a inkubací při teplotě 28 °C. Je-li živná půda rozdělena na sterilní destičky s 96 jamkami (200 µl na 1 jamku), zbarvení se mění během 72 hodin od olivově zelené po žlutou a znamená pozitivní výsledek testu.

[image omitted]

Dodatečné testy pro rozlišení dílčích fenotypů biovaru 2

[image omitted]

• 6.2.7.2. Genomická variabilita

Molekulární identifikace kmenů komplexu R. solanacearum lze dosáhnout několikerými technikami, mezi něž patří:

• 1. Analýza délkového polymorfismu restrikčních fragmentů RFLP (Cook et al., 1989).

• 1. Repetitivní sekvenční PCR s využitím primerů REP, BOX a ERIC (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

• 1. Analýza délkového polymorfismu amplifikovaných fragmentů AFLP (Van der Wolf et al., 1998).

• 6.2.7.3. Metody PCR

Specifické primery PCR (Pastrik et al, 2002; viz dodatek 6) lze použít k diferenciaci kmenů patřících do skupiny 1 (biovary 3, 4 a 5) a skupiny 2 (biovary 1, 2A a 2T) R. solanacearum, jak bylo původně definováno analýzou RFLP (Cook et al., 1989) a sekvenováním 16S rDNA (Taghavi et al., 1996).

• 6.3. Konfirmační test (test patogenity)

Jako závěrečné potvrzení diagnózy R. solanacearum a k potvrzení virulence kultur identifikovaných jako R. solanacearum musí být proveden test patogenity.

1) Připraví se inokulum o hustotě přibližně 10^6 buněk na 1 ml ze 24 až 48 hodinových kultur k testování a příslušný kmen pozitivní kontroly R. solanacearum (např. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; viz dodatek 3).

2) Inokuluje se 5 až 10 náchylných sazenic rajčete nebo lilku ve fázi 3 pravých listů (viz odst. 6.1.9).

3) Sazenice se nechají inkubovat až 2 týdny při teplotě 25-28 °C a vysoké relativní vzdušné vlhkosti s přiměřeným zaléváním, bez vystavení zamokření nebo vyprahlosti půdy. U čistých kultur by typické vadnutí mělo nastat během 14 dnů. Neobjeví-li se po této době příznaky, kultura nemůže být považována jako patogenní forma R. solanacearum.

4) Hledají se příznaky vadnutí a/nebo epinastie, chlorózy nebo krnění.

5) Provede se izolace z rostlin vykazujících příznaky odebráním segmentu ze stonku asi 2 cm nad místem inokulace. Segment se rozmělní a suspenduje v malém množství sterilní destilované vody nebo 50 mM fosfátového pufru (dodatek 4). Izolace ze suspense se provede zřeďovacím roztěrem pokud možno na selektivní živné půdě (dodatek 2). Po inkubaci 48 až 72 hodin při teplotě 28 °C se vyhodnotí výskyt typických kolonií pro R. solanacearum.

Dodatek 1

Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů

Laboratoř (1)	Místo	Země
Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit	Vídeň a Linec	Rakousko
Departement Gewasbescherming	Merelbeke	Belgie
Plantedirektoratet	Lyngby	Dánsko
Central Science Laboratory	York	Anglie
Scottish Agricultural Science Agency	Edinburgh	Skotsko
Laboratoire National de la Protection Végétaux, Unité de Bactériologie	Angers	Francie
Laboratoire National de la Protection Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre	Le Rheu	Francie
Biologische Bundesanstalt	Kleinmachnow	Německo
Pflanzenschutzamt Hannover	Hannover	Německo
State Laboratory	Dublin	Irsko
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali	Boloň	Itálie
Regione Veneto Unita Periferica per i Servizi Fitosanitari	Verona	Itálie
Nederlandse Algemene Keuringsdienst	Emmeloord	Nizozemsko
Plantenziektenkundige Dienst	Wageningen	Nizozemsko
Direcção-General de Protecção das Culturas	Lisabon	Portugalsko
Centro de Diagnóstico de Aldearrubia	Salamanca	Španělsko
Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias	Valencie	Španělsko
Swedish University of Agricultural Sciences	Uppsala	Švédsko
(1) Kontakty: viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

Dodatek 2

Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum

• a) Živné půdy pro izolaci a kultivaci

Živný agar (NA)
Živný agar (Difco)	23,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

Rozpustí se složky a sterilují tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

Kvasnično-pepton-glukózový agar (YPGA)
Kvasnicový extrakt (Difco)	5,0 g
Bacto-Pepton (Difco)	5,0 g
D(+) Glukóza (monohydrát)	10,0 g
Bacto-Agar (Difco)	15,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

Rozpustí se složky a sterilují tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

Sacharózopeptonový agar (SPA)
Sacharóza	20,0 g
Bacto-Peptone (Difco)	5,0 g
K2 HPO4	0,5 g
MgSO4 . 7H2O	0,25 g
Bacto-Agar (Difco)	15,0 g
Destilovaná voda	1,00 l
pH 7,2–7,4

Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

Kelmanovo tetrazoliové médium
kasein hydrolyzát (Difco)	1,0 g
Bacto-Pepton (Difco)	10,0 g
Dextróza	5,0 g
Bacto-Agar (Difco)	15,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

Ochladí se na 50 °C a přidá se filtrem sterilizovaný roztok 2,3,5-trifenyl-tetrazoliumchloridu (Sigma), až do dosažení konečné koncentrace 50 mg na litr.

• b) Validované selektivní živné půdy

Živná půda SMSA (Englebrecht, 1994 ve znění Elphinstone et al., 1996)

Základní živná půda
Casamino kyseliny (Difco)	1,0 g
Bacto-Pepton (Difco)	10,0 g
Glycerol	5,0 ml
Bacto-Agar (Difco) (viz pozn. 2)	15,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

Ochladí se na 50 °C a přidá filtrem sterilizovaný vodný roztok následujících složek, aby se získala stanovená konečná koncentrace:

Krystalová violeť (Sigma)	5 mg/l
Polymixin-B-sulfát (Sigma P1004)	600 000 U (přibližně 100 mg)/l
Bacitracin (Sigma B-0125)	1 250 U (přibližně 25 mg)/l
Chloramfenikol (Sigma C-3175)	5 mg/l
Penicilín-G (Sigma P-3032)	825 U (přibližně 0,5 mg)/l
2,3,5-trifenyltetrazolium chlorid (Sigma)	50 mg/l

Poznámky:

• 1. Použití jiných než výše uvedených reagencí může ovlivnit růst R. solanacearum.

• 1. Místo Bacto-Agar (Difco) může být použit Oxoid Agar #1. V takovém případě bude růst R. solanacearum pomalejší, ale může to také omezit růst konkurenčních saprofytů. Typické kolonie R. solanacearum se mohou tvořit o 1-2 dny déle a červené zbarvení může být světlejší a rozptýlenější než při použití Bacto-Agaru.

• 1. Zvýšení koncentrace bacitracinu na 2 500 U/l může omezit populace konkurenčních bakterií bez ovlivnění růstu Ralstonia solanacearum.

Roztoky antibiotik se uchovávají a skladují při teplotě 4 °C v temnu a musí se spotřebovat do 1 měsíce.

Misky s médiem by měly být před použitím zbaveny povrchové kondenzace.

Nutno zabránit přílišnému vysušení média.

Každá nově připravená šarže živné půdy by měla být podrobena kontrole kvality živné půdy roztěrem suspense referenční kultury R. solanacearum na médium (viz dodatek 3) a pozorováním, zda se po 2 až 5 dnech při teplotě 28 °C objeví typické kolonie.

• c) Validované obohacené živné půdy

Živná půda SMSA (Elphinstone et al., 1996)

Provede se příprava jako pro selektivní agarovou živnou půdu SMSA, ale vynechá se Bacto-Agar a 2,3,5- trifenyltetrazolium chlorid.

Upravená živná půda Wilbrink (Caruso et al., 2002)

Sacharóza	10 g
Proteázový pepton	5g
K2 HPO4	0,5 g
MgSO4	0,25 g
NaNO3	0,25 g
Destilovaná voda	1,00 l

Steriluje se tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut a ochladí se na 50 °C.

Přidá se antibiotický zásobní roztok jako pro živnou půdu SMSA.

Dodatek 3

A. Komerční standardizovaný kontrolní materiál

• a) Izolované bakteriální kultury

Následující izolované bakteriální kultury se doporučují jako standardní referenční materiál buď k pozitivní kontrole (tabulka 1) nebo během optimalizace testů, aby se zabránilo vzájemnému působení (tabulka 2). Všechny kmeny jsou komerčně dostupné a lze je získat z těchto sbírek:

• 1. Národní sbírka patogenních bakterií rostlin (NCPPB), Ústřední vědecká laboratoř York, UK.

• 1. Sbírka kultur sekce ochrany rostlin (PD), Wageningen, Nizozemsko.

• 1. Francouzská sbírka patogenních bakterií rostlin (CFBP), Ústav fytobakteriologie INRA, Angers, Francie.

Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum

Kód NCPPB	SMT #	Jiné kódy	Země původu	Biovar
NCPPB 4153	6	CFBP 4582, Pr 3020, EURS11	Egypt	2
NCPPB 4154	10	CFBP 4585, 550, EURS21	Turecko	2
NCPPB 3857	12	CFBP 4587, Pr 1140, EURS26	Anglie	2
NCPPB 1584	23	CFBP 4598, EURS49	Kypr	2
NCPPB 2505	24	CFBP 4599, EURS50	Švédsko	2
NCPPB 4155	26	CFBP 4601, 502, EURS55	Belgie	2
NCPPB 4156 (*)	71(*)	PD 2762, CFBP 3857	Nizozemsko	2
NCPPB 4157	66	LNPV 15.59	Francie	2
NCPPB 4158	39	CFBP 4608, Port 448, EURS80	Portugalsko	2
NCPPB 4160	69	IVIA-1632-2	Španělsko	2
NCPPB 4161	76	B3B	Německo	2
NCPPB 325	41	CFBP 2047, KEL60-1, R842	USA	1
NCPPB 3967	42	CFBP 4610, R285, GONg7	Kostarika	1
NCPPB 4028	43	CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205	Kolumbie	2
NCPPB 3985	44	CFBP 4612, R578, CIP312	Peru	2T
NCPPB 3989	45	CFBP 4613, R568, CIP226	Brazílie	2T
NCPPB 3996	46	CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225	Peru	3
NCPPB 3997	47	CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131	Austrálie	3
NCPPB 4029	48	CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861	Srí Lanka	4
NCPPB 4005	49	CFBP 4616, R470	Filipíny	4
NCPPB 4011	50	CFBP 4617, R288, HEmps2	Čína	5
(*) Jako standardní referenční kmen se použije R. solanacearum biovar 2 (rod 3).

Poznámka:

Spolehlivost výše uvedených kmenů může být zaručena pouze v případě, že pocházejí z původních sbírek kultur.

Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů

Kód NCPPB	SMT #	Jiné kódy	Identifikace
NCPPB 4162	51	CFBP 1954	Bacillus polymyxa(1)
NCPPB 4163	52	CFBP 1538	Pseudomonas marginalis pv. marginalis(1)
NCPPB 4164	-	CFBP 2227	Burkholderia cepacia (2)
NCPPB 4165	-	CFBP 2459	Ralstonia pickettii(2)
NCPPB 4166	58	CFBP 3567, CSL Pr1150	Ralstonia pickettii(1)
NCPPB 4167	60	CFBP 4618, PD 2778	Ralstonia sp. (1)
NCPPB 1127	53	CFBP 3575	Burkholderia andropogonis (1)
NCPPB 353	54	CFBP 3572	Burkholderia caryophylli(1)
NCPPB 945	55	CFBP 3569	Burkholderia cepacia (1)
NCPPB 3708	56	CFBP 3574	Burkholderia glumae (1)
NCPPB 3590	57	CFBP 3573	Burkholderia plantarii (1)
NCPPB 3726	59	CFBP 3568	Banana Blood Disease Bacterium (1)(2)(3)
NCPPB 4168	61	CFBP 4619, IPO S339	Enterobacter sp. (1)
NCPPB 4169	62	IPO 1695	Enterobacter sp. (1)
NCPPB 4170	63	CFBP 4621, IPO S306	Ochrobactrum anthropi(1)(2)
NCPPB 4171	64	CFBP 4622, IPO 1693	Curtobacterium sp.(1)(2)
NCPPB 4172	65	IPO 1696a	Pseudomonas sp.(1)
NCPPB 4173	-	PD 2318	Aureobacterium sp. (2)
NCPPB 4174	81	IVIA 1844.06	Flavobacterium sp. (1)(2)
(1) Potencionální křížově reagující kmen v sérologických testech (IF a/nebo ELISA) s polyklonálním antisérem. (2) Kmen, ze kterého lze v některých laboratořích amplifikovat produkt PCR na podobnou velikost, jako je očekávaná velikost při použití specifických primerů OLI-1 a Y-2 (viz dodatek 6). (3) Pravděpodobnost křížové reakce ve většině testů, ale výskyt znám pouze u banánů v Indonésii.

• b) Komerční standardizovaný kontrolní materiál

Následující standardní kontrolní materiál je možné získat ze sbírky kultur NCPPB.

Mražené sušené pelety bramborového extraktu ze 200 zdravých hlíz bramboru k negativní kontrole všech testů.

Mražené sušené pelety bramborového extraktu ze 200 zdravých hlíz bramboru obsahující 10^3 až 10^4 a 10^4 až 10^6 buněk biovaru 2 R. solanacearum (kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) jako pozitivní kontroly serologických a PCR testů. Protože životaschopnost buňky je ovlivněna lyofilizací, nejsou tyto vhodné jako standardy v testech izolace a testech patogenity.

Ve formaldehydu fixované suspense biovaru 2 R. solanacearum (kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) s 10^6 buňkami na 1 ml k pozitivní kontrole sérologických testů.

B. Příprava pozitivních a negativních kontrol pro screeningové testy vodivých pletiv PCR/IF a FISH

Kultivuje se 48hodinová kultura virulentního kmene R. solanacearum rasy 3/biovaru 2 (např. kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) na SMSA živné půdě a suspenduje se v 10 mM fosfátovém pufru, aby se získala buněčná hustota přibližně 2 × 10^8 buněk tvořících kolonie na 1 ml. Obvykle se jí dosáhne jemně zakalenou suspenzí rovnající se optické hustotě 0,15 při 600 nm.

Odebere se dřeň z pupkových konců 200 hlíz z produkce odrůdy s bílou slupkou, o které se ví, že je prosta R. solanacearum.

Zpracují se pupkové konce výše uvedeným postupem a resuspenduje se peleta v 10 ml.

Připraví se 10 sterilních mikrozkumavek o objemu 1,5 ml s 900 µl resuspendované pelety.

Přenese se 100 µl suspenze R. solanacearum do první mikrozkumavky a protřepe se..

Provede se desetinásobné ředění v dalších pěti mikrozkumavkách.

Těchto šest kontaminovaných mikrozkumavek se použije jako kontrolní vzorky. Čtyři nekontaminované mikrozkumavky se použijí jako kontrolní negativní vzorky. Mikrozkumavky musí být řádně označeny.

Připraví se alikvotní části z 100 µl ve sterilních zkumavkách o objemu 1,5 ml, čímž se získá 9 kopií každého kontrolního vzorku. Uskladní se při teplotě - 16 až - 24 °C až do doby použití.

Přítomnost a množství R. solanacearum v kontrolních vzorcích by měly být nejprve potvrzeny testem IF.

Pro PCR test se provede extrakce DNA z pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.

Pro IF a FISH testy se provede test patogenity pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.

Při kvantitativních rozborech IF, FISH a PCR musí být R. solanacearum zjištěna v nejméně v 10^6 a 10^4 buněk/ml pozitivních kontrol a nesmí být zjištěn v žádné z negativních kontrol.

Dodatek 4

Pufry pro testovací postupy

OBECNĚ: Neotevřené sterilizované pufry lze skladovat po dobu až jednoho roku.

• 1. Pufry pro extrakci

• 1.1 Extrakční pufr (50 mM fosfátový pufr, pH 7,0)

Tento pufr se používá k extrakci bakterie z rostlinných tkání homogenizací nebo protřepáním.

Na2 HPO4 (bezvodý)	4,26 g
KH2PO4	2,72 g
Destilovaná voda	1,00 l

Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

Užitečné mohou být následující složky:

	Účel	Množství (na litr)
Lubrolové vločky	Protisrážlivý prostředek (*)	0,5 g
DC silikonový odpěňovač	Odpěňovací činidlo (*)	1,0 ml
Tetrasodiumpyrofosfát	Antioxidační činidlo	1,0 g
Polyvinylpyrrolidon-40 000 (PVP – 40)	Vázání inhibitorů PCR	50 g
(*) pro použití při extrakci homogenizací

• 1.2. Peletový pufr (10 mM fosfátový pufr, pH 7,2)

Tento pufr se používá pro resuspenzi a ředění extraktů z výkrojků z pupkových částí bramborových hlíz poté, co byly odstřeďováním koncentrovány do pelety.

Na2HPO4.12H2O	2,7 g
NaH2PO4. 2H2O	0,4 g
Destilovaná voda	1,00 l

Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

• 1. Pufry pro IF test

Pufr pro IF (10 mM fosfátový pufr ve fyziologickém roztoku (PBS), pH 7,2)

Tento pufr se používá k ředění protilátek.

Na2HPO4.12H2O	2,7 g
NaH2PO4 . 2H2O	0,4 g
NaCl	8,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

IF-pufr-Tween

Tento pufr se používá k oplachování podložních sklíček.

Přidá se 0,1 % Tween 20 k pufru pro IF.

Fosfátový pufr v glycerolu, pH 7,6

Tento pufr se používá jako krycí roztok na okénka sklíček na IF testy k zvýšení fluorescence.

Na2HPO4 .12H2O	3,2 g
NaH2PO4 . 2H2O	0.15 g
Glycerol	50 ml
Destilovaná voda	100 ml

Krycí roztoky jsou komerčně dostupné, např. Vectashield^® (Vector Laboratories) nebo Citifluor^® (Leica).

• 1. Pufry pro účely nepřímého testu ELISA

• 3.1. Dvojnásobný uhličitanový potahovací pufr, pH 9,6.

Na2CO3	6,36 g
NaH CO3	11,72 g
Destilovaná voda	1,00 l

Rozpustí se složky, zkontroluje pH a steriluje autoklávováním při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

Pokud extrakt obsahuje vysoký podíl aromatických molekul, je možné jako antioxidant přidat siřičitan sodný (0,2 %).

• 3.2. Desetinásobný roztok chloridu sodného pufrovaný fosfátem (10 x PBS), pH 7,4

NaCl	80,0 g
KH2PO4	2,0 g
Na2HPO4 . 12H2O	29,0 g
KCl	2,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

• 3.3. PBS-Tween

10 x PBS	100 ml
10 % Tween 20	5 ml
Destilovaná voda	895 ml

• 3.4. Blokační pufr (musí být čerstvě připraven).

10 x PBS	10,0 ml
Polyvinylpyrrolidon-44000 (PVP-44)	2,0 g
10 % Tween 20	0,5 ml
Sušené mléko	0,5 g
Destilovaná voda	doplnit do 100 ml

• 3.5. Roztok pro substrát alkalické fosfatázy, pH 9,8

Diethanolamin	97 ml
Destilovaná voda	800 ml

Rozpustí se a koncentrovanou HCl se upraví pH na 9,8.

Doplní se do 1 l destilovanou vodou.

Přidá se 0,2 g MgCl2.

Rozpustí se dvě 5 mg tabletky fosfatázového substrátu (Sigma) v 15 ml roztoku.

• 1. Pufry pro účely testu DASI ELISA

• 4.1. Potahovací pufr, pH 9,6.

Na2CO3	1,59 g
NaH CO3	2,93 g
Destilovaná voda	1 000 ml

Rozpustí se složky a zkontroluje pH 9,6.

• 4.2. 10 x fosfátosolný pufr (PBS) pH 7,2‒ 7,4

NaCl	80,0 g
Na2HPO4.12H2O	27 g
NaH2PO4 . 2H2O	4g
Destilovaná voda	1 000 ml

• 4.3. PBS-Tween

10 x PBS	50 ml
10 % Tween 20	5 ml
Destilovaná voda	950 ml

• 4.4 Substrátový pufr, pH 9,8

Diethanolamin	100 ml
Destilovaná voda	900 ml

Smíchá se a nastaví se hodnota pH 9,8 koncentrovanou HCl.

Dodatek 5

Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk

• 1. Vypočítá se průměrný počet typických fluoreskujících buněk v jednom pozorovacím poli (c).

• 1. Vypočítá se počet typických fluoreskujících buněk v okénku mikroskopického sklíčka (C).

C=c×S/s,

kde S = plocha jednoho pole na sklíčku s více okénky a

s = plocha pole objektivu.

s=π2/4G2K2,

kde i = koeficient pole (v rozmezí 8 – 24 podle typu okuláru),

K = tubusový koeficient (1 nebo 1,25),

G = zvětšení objektivu (100 x, 40 x atd.).

• 1. Vypočítá se počet charakteristických fluoreskujících buněk na 1 ml resuspendované pelety (N).

N=C×1 000/y×F,

kde y = objem resuspendované pelety v každém okénku a

F = zřeďovací faktor resuspendované pelety

Dodatek 6

Validované protokoly a činidla pro PCR

Poznámka:

Úvodní testování by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění nejméně 10^3 až 10^4 buněk R. solanacearum na 1 ml vzorkového extraktu. Úvodní testování by také nemělo vykazovat žádné falešné pozitivní výsledky se skupinou vybraných kmenů bakterií (viz dodatek 3).

• 1. Protokol PCR Seal et al. (1993)

• 1.1. Oligonukleotidové primery

Přímý primer OLI-1: 5'-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3'

Reverzní primer Y-2: 5'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'

Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum = 288 bp

• 1.2. Reakční směs PCR

Reagencie	Množství v reakci	Konečná koncentrace
Sterilní UPW	17,65 µl
10× pufr PCR (1) (15 mM MgCl2)	2,5 µl	1x (1,5mM MgCl2)
Směs dNTP (20mM)	0,25 µl	0,2 mM
Primer OLI-1 (20 µM)	1,25 µl	1µM
Primer Y-2 (20 µM)	1,25 µl	1µM
Taq polymerasa (5U/µl) (1)	0,1 µl	0,5 U
Množství vzorku	2,0 µl
Celkové množství	25 µl
(1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.

• 1.3. Reakční podmínky PCR

Provede se následující cyklický proces:

1 cyklus:	i) 2 minuty při 96 °C (denaturace templátové DNA)
35 cyklů:	ii) 20 sekund při 94 °C (denaturace templátové DNA)
iii) 20 sekund při 68 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
iv) 30 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
1 cyklus:	v) 10 minut při 72 °C (závěrečná syntéza)
vi) ponechá se při teplotě 4 °C.

Poznámka:

Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru Perkin Elmer 9600. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).

• 1.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu.

Produkty PCR vzniklé amplifikací z R. solanacearum DNA vytvářejí polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Ava II po inkubaci při teplotě 37 °C.

• 1. Protokol PCR Pastrika a Maisse (2000)

• 2.1. Oligonukleotidové primery

Přímý primer Ps-1: 5'-agt cga acg gca gcg ggg g -3'

Reverzní primer Ps-2: 5'-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca -3

Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum DNA = 553 bp.

• 2.2. Reakční směs PCR

Reagencie	Množství v reakci	Konečná koncentrace
Sterilní UPW	16,025 µl
10x pufr PCR (1)	2,5 µl	1x (1,5 mM MgCl2)
BSA (frakce V) (10 %)	0,25 µl	0,1 %
Směs dNTP (20mM)	0,125 µl	0,1 mM
Primer Ps-1 (10 µM)	0,5 µl	0,2 µM
Primer Ps-2 (10 µM)	0,5 µl	0,2 µM
Taq polymerasa (5U/µl) (1)	0,1 µl	0,5 U
Množství vzorku	5,0 µl
Celkové množství	25,0 µl
(1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL. Poznámka: Původně optimalizovaná pro termocykler MJ Research PTC 200 s polymerasou Gibco Taq Polymerace. Perkin Elmer AmpliTaq a pufr mohou být rovněž použity ve stejných koncentracích.

• 2.3 Reakční podmínky PCR

Provede se následující cyklický proces:

1 cyklus	i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)
35 cyklů:	ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)
iii) 30 sekund při 68 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
1 cyklus:	v) 5 minut při 72 °C (syntéza extenze)
vi) ponechá se při teplotě 4 °C.

Poznámka:

Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů bude možná vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).

• 2.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu

Produkty PCR vzniklé amplifikací z R. solanacearum DNA vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Taq I po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C. Restrikční fragmenty specifické pro R. solanacearum mají velikost 457 bp a 96 bp.

• 1. Protokol pro multiplexní PCR s interní kontrolou (Pastrik et al., 2002)

• 3.1. Oligonukleotidové primery

Přímý primer RS-1-F: 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'

Reverzní primer RS-1-R: 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'

Přímý primer NS-5-F: 5'-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3'

Reverzní primerNS-6-R: 5'-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3'

Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum = 718 bp (sada primerů RS).

Očekávaná velikost amplikonu interní kontroly PCR 18S rRNA = 310 bp (sada primerů NS).

• 3.2. Reakční směs PCR

Reagencie	Množství v reakci	Konečná koncentrace
Sterilní UPW	12,625 µl
10x pufr PCR (1) (15 mM MgCl2)	2,5 µl	1x (1,5 mM MgCl2)
BSA (frakce V) (10 %)	0,25 µl	0,1 %
Směs dNTP (20mM)	0,125 µl	0,1 mM
Primer RS-1-F (10 µM)	2,0 µl	0,8 µM
Primer RS-1-R (10 µM)	2,0 µl	0,8 µM
Primer NS-S-F (10 µM)(2)	0,15 µl	0,06 µM
Primer NS-6-R (10 µM)(2)	0,15 µl	0,06 µM
Taq polymeráza (5U/µl)(1)	0,2 µl	1,0 U
Množství vzorku	5,0 µl
Celkové množství	25,0 µl
(1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL. (2) Koncentrace primerů NS-5-F a NS-6-R byly optimalizovány pro výkrojky pletiva pupkových částí hlíz bramboru pomocí homogenizační metody a purifikace DNA podle Pastrika (2000) (viz 6.1.6.1.a)). Použití extrakční metody třepáním nebo jiných metod izolace DNA může vyžadovat nové provedení optimalizace koncentrací reagencií.

• 3.3. Reakční podmínky PCR

Provede se následující cyklický proces:

1 cyklus:	i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)
35 cyklů:	ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)
iii) 30 sekund při 58 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
1 cyklus:	v) 5 minut při 72 °C (konečná syntéza)
vi) nechá se při teplotě 4 °C.

Poznámka:

Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).

• 3.4. Restrikční enzymová analýzy amplikonu

Produkty PCR vzniklé amplifikací z DNA R. solanacearum vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Bsm I nebo Isoschizomere (např. Mva 1269 I) po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C.

• 1. Protokol PCR specifický pro biovar R. solanacearum (Pastrik et al, 2001)

• 4.1. Oligonukleotidové primery

Přímý primer Rs-1-F: 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'

Reverzní primer Rs-1-R: 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'

Reverzní primer Rs-3-R: 5'-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3'

Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum:

s Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp

s Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp

• 4.2. Reakční směs PCR

• a) Protokol PCR specifický pro biovar ^1/2

Reagencie	Množství v reakci	Konečná koncentrace
Sterilní UPW	12,925 µl
10x pufr PCR(1)	2,5 µl	1x (1,5 mM MgCl2)
BSA (frakce V) (10 %)	0,25 µl	0,1 %
Směs dNTP (20mM)	0,125 µl	0,1 mM
Primer Rs-1-F (10 µM)	2,0 µl	0,8 µM
Primer Rs-1-R (10 µM)	2,0 µl	0,8 µM
Taq polymeráza (5U/µl)(1)	0,2 µl	1,0 U
Množství vzorku	5,0 µl
Celkové množství	25,0 µl
(1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.

• b) Protokol PCR specifický pro Biovar 3/4/5

Reagencie	Množství v reakci	Konečná koncentrace
Sterilní UPW	14,925 µl
10x pufr PCR (1)	2,5 µl	1x (1,5 mM MgCl2)
BSA (frakce V) (10 %)	0,25 µl	0,1 %
Směs dNTP (20mM)	0,125 µl	0,1 mM
Primer Rs-1-F (10 µM)	1,0 µl	0,4 µM
Primer Rs-3-R (10 µM)	1,0 µl	0,4 µM
Taq polymeráza (5U/µl) (1)	0,2 µl	1,0 U
Množství vzorku	5,0 µl
Celkové množství	25,0 µl
(1)Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.

• 4.3. Reakční podmínky PCR

Provede se následující cyklický proces pro obě reakce specifické pro biovary 1/2- a biovary 3/4/5:

1 cyklus:	i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)
35 cyklů:	ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)
iii) 30 sekund při 58 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
1 cyklus:	v) 5 minut při 72 °C (konečná syntéza)
	vi) ponechá se při teplotě 4 °C.

Poznámka:

Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).

• 4.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu.

Produkty PCR vzniklé amplifikací DNA R. solanacearum pomocí primerů Rs-1-F a Rs-1-R vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Bsm I nebo Isoschizomere (např. Mva 1269 I) po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C. Produkty PCR vzniklé amplifikací z DNA R. solanacearum pomocí primerů Rs-1-F a Rs-3-R nemají žádná restrikční místa.

• 1. Příprava nanášecího pufru

• 5.1. Bromfenolová modř (10 % zásobní roztok)

Bromfenolová modř	5g
Destilovaná (redestilovaná) voda	50 ml

• 5.2. Nanášecí pufr

Glycerol (86 %)	3,5 ml
Bromfenolová modř (5,1)	300 µl
Destilovaná (redestilovaná) voda (bidestilát)	6,2 ml

• 1. Pufr 10x TRIS-acetát-EDTA (TAE), pH 8,0

TRIS	48,4 g
Ledová kyselina octová	11,42 ml
EDTA (sodná sůl)	3,72 g
Destilovaná voda	1,00 l

Před použitím se zředí na 1X.

Také komerčně dostupné (např. Invitrogen nebo rovnocenné).

Dodatek 7

Validovaná činidla pro FISH test

• 1. Oligosondy

Sonda specifická pro R. solanacearum OLI-1-CY3: 5'-ggc agg tag caa gct acc ccc-3'

Nespecifická eubakteriální sonda EUB-338-FITC: 5'-gct gcc tcc cgt agg agt-3'

• 1. Fixační roztok

[UPOZORNĚNÍ: FIXAČNÍ ROZTOK OBSAHUJE PARAFORMALDEHYD, KTERÝ JE TOXICKÝ. POUŽÍT RUKAVICE A NEVDECHNOUT. DOPORUČUJE SE PRACOVAT V DIGESTOŘI.]

ii) Upraví se pH na 7,0 přidáním 1ml fosfátového pufru 0,1 M (PB; pH 7,0) a 5 kapek HCl 1N. Zkontroluje se pH indikačním proužkem a v případě potřeby se upraví pomocí HCl nebo NaOH. [UPOZORNĚNÍ: V ROZTOCÍCH S PARAFORMALEDHYDEM NEPOUŽÍVAT MĚŘIČ PH!]

iii) Přefiltruje se roztok přes membránový filtr 0,22 µm a skladuje se chráněný před prachem při teplotě 4 °C do dalšího použití.

• 1. 3x Hybmix

NaCl	2,7 M
Tris-HCl	60 mM (pH 7,4)
EDTA (sterilizovaný přes filtr a autoklávovaný)	15 mM

Zředí se až 1x, podle potřeby.

• 1. Hybridizační roztok

1x Hybmix
Sodium dodecyl sulfát (SDS)	0,01 %
Formamid	30 %
Sonda EUB 338	5 ng/µl
Sonda OLI-1 nebo OLI2	5 ng/µl

Připraví se množství hybridizačního roztoku podle výpočtů v tabulce 1. Pro každé sklíčko (obsahující dvojmo 2 různé vzorky) je třeba 90 µl hybridizačního roztoku.UPOZORNĚNÍ: FORMAMID JE VELMI JEDOVATÝ, NUTNO POUŽÍVAT RUKAVICE A UČINIT POTŘEBNÁ BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ!

Tabulka1. Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi

Počet sklíček	1	4	6	8	10
Sterilní ultra čistá voda	23,1	92,4	138,6	184,8	231,0
3 x Hybmix	30,0	120,0	180,0	240,0	300,0
1 % SDS	0,9	3,6	5,4	7,2	9,0
Formamid	27,0	108,0	162,0	216,0	270,0
Sonda EUB 338 (100 ng/µl)	4,5	18,0	27,0	36,0	45,0
Sonda OLI-1 nebo OLI2 (100 ng/µl)	4,5	18,0	27,0	36,0	45,0
Celkové množství	90,0	360,0	540,0	720,0	900,0

Poznámka:

Všechny roztoky obsahující světlocitlivé oligosondy se uchovávají v temnu při teplotě - 20 °C. Během použití se chrání před přímým slunečním zářením nebo elektrickým světlem.

• 1. 0,1M fosfátový pufr, pH 7,0

Na2HPO4	8,52 g
KH2PO4	5,44 g
Destilovaná voda	1,00 l

Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje autoklávováním při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

Dodatek 8

Pěstování lilku a rajčete

Vysejí se semena rajčete (Lycopersicon esculentum) nebo lilku (Solanum melongena) do pasterizovaného výsevního substrátu. Sazeničky s plně rozvinutými děložními lístky (10 až 14 dní) se přesadí do pasterizovaného pěstebního substrátu.

Rostliny lilku a rajčete by se měly pěstovat ve skleníku za následujících podmínek:

Délka dne:		14 hodin nebo přirozená délka dne, pokud je delší;
Teplota:	den:	21 až 24 °C,
noc:	14 až 18 °C.
Vhodná odrůda lilku vejcoplodého:	„Black Beauty“
---	---
Vhodná odrůda rajčete:	„Moneymaker“

Dodavatelé: viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

LITERATURA

• 1. Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770.

• 1. Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.

• 1. Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105;373-380.

• 1. Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638.

• 1. Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121.

• 1. Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678.