Vyhláška, kterou se stanoví analytické metody kontroly složení kosmetických prostředků

• 5.3.2 Změří se absorbance slepého pokusu (5.3.1) a takto získaná hodnota se použije jako nulová koncentrace barya pro kalibrační křivku. Změří se absorbance každého standardního roztoku barya (5.3.1). Sestrojí se kalibrační křivka vynesením závislosti hodnot absorbance na koncentraci barya.

• 5.4 Stanovení

Změří se absorbance roztoku vzorku (5.1.5). Z kalibrační křivky se odečte koncentrace barya odpovídající hodnotě absorbance naměřené pro roztok vzorku.

• 1. Výpočet

Obsah rozpustného barya (% m/m) v pigmentu se vypočítá podle vzorce

% (m/m) rozpustného barya = c×V10WBa×m

kde

m =	hmotnost analyzovaného vzorku (5.1.1) v g,
c =	koncentrace barya v roztoku vzorku (5.1.5) odečtená z kalibrační křivky v μg/ml,
V =	celkový objem extraktu (5.1.2) v ml,
WBa =	objem extraktu odebraného podle bodu 5.1.5 v ml.

• 1. Opakovatelnost

Pro výrobky obsahující asi 2 % (m/m) rozpustného barya je pro tuto metodu nejlepším odhadem opakovatelnosti 0,3 %.

• 1. Poznámky

• 8.1 Za určitých podmínek může být absorbance barya zvýšena přítomností vápníku. Tomu lze zabránit přidáním iontů hořčíku v koncentraci 5 g/l (viz. „Magnesium as modifier for the determination of barium by flame atomic emission spectrometry“. Jerrow, M. et al., Analytical Proceedings, 1991, 28, 40.).

• 8.2 Použití metody spektrometrie s indukčně vázanou plazmou - optická emisní spektrometrie je povoleno jako alternativa plamenové atomové absorpční spektrometrie.

B. Kvantitativní stanovení rozpustného stroncia

• 1. Rozsah a oblast použití

V této metodě je popsán postup extrakce a kvantitativního stanovení rozpustného stroncia z pigmentů ve formě solí nebo komplexů.

• 1. Princip

Pigment se extrahuje 0,07M roztokem kyseliny chlorovodíkové za definovaných podmínek a množství stroncia v extraktu se stanoví atomovou absorpční spektrometrií.

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 3.1 Etanol, absolutní

• 3.2 Kyselina chlorovodíková, 0,07 mol/l roztok

• 3.3 Chlorid draselný, 8% (m/V) roztok: 16 g chloridu draselného se rozpustí ve 200 ml 0,07 mol/l roztoku kyseliny chlorovodíkové (3.2).

• 3.4 Standardní roztoky stroncia

• 3.4.1 Zásobní standardní roztok stroncia, 1 000 μg/ml v 0,5 mol/l roztoku kyseliny dusičné („SpectrosoL“ nebo ekvivalentní)

• 3.4.2 Standardní roztok stroncia, 100 μg/ml: 10,0 ml zásobního standardního roztoku barya (3.4.1) se odpipetuje do odměrné baňky na 100 ml. Doplní se po rysku 0,07 mol/l roztokem kyseliny chlorovodíkové (3.2) a promíchá.

• 1. Přístroje a pomůcky

• 4.1 Obvyklé laboratorní vybavení

• 4.2 Membránový filtr s velikostí pórů 0,45 μm

• 4.3 Atomový absorpční spektrofotometr vybavený stronciovou výbojkou s dutou katodou

• 1. Postup

• 5.1 Příprava vzorku

Pro kvantitativní stanovení rozpustného stroncia se použije roztok připravený v oddíle A 5.1.4.

• 5.1.1 Do odměrné baňky na 100 ml se odpipetuje 5,0 ml roztoku chloridu draselného (3.3) a alikvotní podíl („WSr ml“) zředěného filtrátu (A 5.1.4), aby byla předpokládaná koncentrace stroncia 2 až 5 μg/ml. (Alikvotní podíl 10 ml by měl být vhodným výchozím množstvím.) Doplní se po rysku 0,07 mol/l roztokem kyseliny chlorovodíkové (3.2) a promíchá.

• 5.1.2 Koncentrace stroncia v roztoku (5.1.1) se stanoví atomovou absorpční spektrometrií tentýž den.

• 5.2 Podmínky pro atomovou absorpční spektrometrii

Plamen: oxid dusný-acetylen

Vlnová délka: 460,7 nm

Korekce pozadí: ne

Podmínka paliva: chudé; pro maximální absorbanci je nutná optimalizace výšky hořáku a palivových podmínek.

• 5.3 Kalibrace

• 5.3.1 Do série odměrných baněk na 100 ml se odpipetuje 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 a 5,0 ml standardního roztoku stroncia (3.4.2). Do každé baňky se odpipetuje 5,0 ml roztoku chloridu draselného (3.3). Doplní se po rysku 0,07 mol/l roztokem kyseliny chlorovodíkové (3.2) a obsah se promíchá. Tyto roztoky obsahují 1,0; 2,0; 4,0 a 5,0 μg stroncia na mililitr.

Obdobně se provede slepý pokus s tím, že se vynechá standardní roztok stroncia.

• 5.3.2 Změří se absorbance slepého pokusu (5.3.1) a takto získaná hodnota se použije jako nulová koncentrace stroncia pro kalibrační křivku. Změří se absorbance každého kalibračního standardu stroncia (5.3.1). Sestrojí se kalibrační křivka vynesením závislosti hodnot absorbance na koncentraci stroncia.

• 5.4 Stanovení

Změří se absorbance roztoku vzorku (5.1.1). Z kalibrační křivky se odečte koncentrace stroncia odpovídající hodnotě absorbance naměřené pro roztok vzorku.

• 1. Výpočet

Obsah rozpustného stroncia (% m/m) v pigmentu se vypočítá podle vzorce

%(m/m)rozpustného barya=c×V100WBa×m

kde

m =	hmotnost analyzovaného vzorku (A 5.1.1) v g,
c =	koncentrace stroncia v roztoku vzorku (5.1.1) odečtená z kalibrační křivky v μg/ml,
V =	celkový objem extraktu (A 5.1.2) v ml,
WSr =	objem extraktu odebraného podle bodu 5.1.1 v ml.

• 1. Opakovatelnost

Pro výrobky obsahující asi 0,6 % (m/m) rozpustného barya je pro tuto metodu nejlepším odhadem opakovatelnosti 0,09 %.

• 1. Poznámka

Použití metody spektrometrie s indukčně vázanou plazmou - optická emisní spektrometrie je povoleno jako alternativa plamenové atomové absorpční spektrometrie.

• 1. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ BENZYLALKOHOLU

A. Kvalitativní stanovení

• 1. Rozsah a oblast použití

V této metodě je popsáno kvalitativní stanovení benzylalkoholu v kosmetických prostředcích.

• 1. Princip

Kvalitativní stanovení benzylalkoholu se provede chromatografií na tenké vrstvě na silikagelu.

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 3.1 Benzylalkohol

• 3.2 Chloroform

• 3.3 Ethanol, absolutní

• 3.4 n-Pentan

• 3.5 Mobilní fáze: diethylether

• 3.6 Standardní roztok benzylalkoholu: Do odměrné baňky na 100 ml se naváží 0,1 g benzylalkoholu (3.1), doplní po rysku ethanolem (3.3) a promíchá.

• 3.7 Desky pro chromatografii na tenké vrstvě, skleněné, 100 x 200 mm nebo 200 x 200 mm, s nanesenou vrstvou silikagelu 60 F254 o tloušťce 0,25 mm.

• 3.8 Detekční činidlo: kyselina 12-molybdofosforečná, 10% (m/V) roztok v ethanolu (3.3).

• 1. Přístroje a pomůcky

• 4.1 Obvyklé vybavení pro chromatografii na tenké vrstvě

• 4.2 Chromatografická komora se dvěma žlábky, vnější rozměry přibližně 80 mm x 230 mm x 240 mm

• 4.3 Chromatografický papír: Whatman nebo ekvivalentní

• 4.4 UV lampa, vlnová délka 254 nm.

• 1. Postup

• 5.1 Příprava vzorku

Do odměrné baňky na 10 ml se naváží 1,0 g prostředku, který má být analyzován. Přidají se 3 ml chloroformu (3.2) a důkladně se třepe, dokud se prostředek nerozptýlí. Doplní se po rysku ethanolem (3.3) a důkladně třepe až do vzniku čirého nebo téměř čirého roztoku.

• 5.2 Chromatografie na tenké vrstvě

• 5.2.1 Chromatografická komora se nasytí (4.2) n-pentanem takto: strana komory sousedící se zadním žlábkem se vyloží chromatografickým papírem (4.3) tak, aby byl dolní okraj papíru ve žlábku. Zadní žlábek se naplní 25 ml n-pentanu (3.4) přelitím tohoto roztoku po povrchu chromatografického papíru. Okamžitě se nasadí víko a ponechá se stát 15 minut.

• 5.2.2 Do vhodných bodů na startovací linii chromatografické desky pro chromatografii na tenké vrstvě se nanese 10 μl roztoku vzorku (5.1) a 10 μl standardního roztoku benzylalkoholu (3.6). Nechá se vyschnout.

• 5.2.3 Do předního žlábku komory se odpipetuje 10 ml diethyletheru (3.5) a poté se do stejného žlábku ihned umístí deska (5.2.2). Opět se rychle nasadí víko komory a deska se vyvíjí do výšky 150 mm. Deska se vyjme z chromatografické komory a nechá se schnout při pokojové teplotě.

• 5.2.4 Deska (5.2.3) se pozoruje pod ultrafialovým světlem a označí se poloha fialových skvrn. Deska se postříká detekčním činidlem (3.8) a poté se zahřeje 15 minut při 120 °C. Benzylalkohol se jeví jako tmavě modrá skvrna.

• 5.2.5 Vypočte se hodnota Rf získaná pomocí standardního roztoku benzylalkoholu. Tmavě modrá skvrna se stejnou hodnotou Rf získaná z roztoku vzorku indikuje přítomnost benzylalkoholu.

Mez detekce: 0,1 μg benzylalkoholu.

B. Kvantitativní stanovení

• 1. Rozsah a oblast použití

V této metodě je popsáno kvantitativní stanovení obsahu benzylalkoholu v kosmetických prostředcích.

• 1. Definice

Množství benzylalkoholu stanovené touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech (% m/m).

• 1. Princip

Vzorek se extrahuje methanolem a množství benzylalkoholu v extraktu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a podle potřeby musí být vhodná pro HPLC.

• 4.1 Methanol

• 4.2 4-Ethoxyfenol

• 4.3 Benzylalkohol

• 4.4 Mobilní fáze: methanol (4.1)/voda (45:55; V/V)

• 4.5 Zásobní roztok benzylalkoholu: do odměrné baňky na 100 ml se přesně naváží asi 0,1 g benzylalkoholu (4.3). Doplní se po rysku methanolem (4.1) a promíchá.

• 4.6 Zásobní roztok vnitřního standardu: do odměrné baňky na 100 ml se naváží asi 0,1 g 4-ethoxyfenolu (4.2) přesně. Doplní se po rysku methanolem (4.1) a promíchá.

• 4.7 Standardní roztoky: Do série odměrných baněk na 25 ml se odpipetuje zásobní roztok benzylalkoholu (4.5) a zásobní roztok vnitřního standardu (4.6) podle níže uvedené tabulky. Doplní se po rysku methanolem (4.1) a promíchá.

Standardní roztok	Koncentrace benzylalkoholu	Koncentrace 4-ethoxyfenolu
počet přidaných ml (4.5)	μg/ml (*)	počet přidaných ml (4.6)	μg/ml (*)
I	0,5	20	2,0	80
II	1,0	40	2,0	80
III	2,0	80	2,0	80
IV	3,0	120	2,0	80
V	4,0	200	2,0	80
(*) Tyto hodnoty jsou uvedeny jako ukazatele a odpovídají koncentracím standardních roztoků připravených z roztoků benzylalkoholu (4.5) a 4-ethoxyfenolu (4.6), které obsahují přesně 0,1 % (m/V) benzylalkoholu a přesně 0,1 % (m/V) 4-ethoxyfenolu.

• 1. Přístroje a pomůcky

• 5.1 Obvyklé laboratorní vybavení

• 5.2 Zařízení pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s UV detektorem s nastavitelnou vlnovou délkou a s nastřikovací smyčkou o objemu 10 μl

• 5.3 Analytická kolona: kolona z nerezové oceli: 250 mm x 4,6 mm s náplní Spherisorb ODS o velikosti částic 5 μm nebo s ekvivalentní náplní.

• 5.4 Vodní lázeň

• 5.5 Ultrazvuková lázeň

• 5.6 Odstředivka

• 5.7 Centrifugační kyvety na 15 ml

• 1. Postup

• 6.1 Příprava vzorku

• 6.1.1 Do centrifugační kyvety (5.7) se naváží asi 0,1 g (m gramů) vzorku přesně a přidá se 5 ml methanolu (4.1).

• 6.1.2 Zahřívá se po dobu 10 minut na vodní lázni (5.4) nastavené na teplotu 50 °C a poté se vloží do ultrazvukové lázně (5.5), kde se ponechá do důkladného rozptýlení vzorku.

• 6.1.3 Ochladí se a poté se odstředí 5 minut při 3 500 ot./min.

• 6.1.4 Supernatant se převede do odměrné baňky na 25 ml.

• 6.1.5 Zbytek vzorku se extrahuje dalšími 5 ml methanolu (4.1). Extrakty se sloučí v odměrné baňce na 25 ml.

• 6.1.6 Do odměrné baňky na 25 ml se odpipetují 2,0 ml zásobního roztoku vnitřního standardu (4.6). Doplní se po rysku methanolem (4.1) a promíchá se. Tento roztok se použije pro chromatografii popsanou v bodě 6.4.

• 6.2 Chromatografie

• 6.2.1 Obvyklým způsobem se sestaví zařízení pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (5.2). Průtoková rychlost mobilní fáze (4.4) se nastaví na 2,0 ml/min.

• 6.2.2 Vlnová délka UV detektoru (5.2) se nastaví na 210 nm.

• 6.3 Kalibrace

• 6.3.1 Nastříkne se po 10 μl každého ze standardních roztoků benzylalkoholu (4.7) a změří se plocha píků benzylalkoholu a 4-ethoxyfenolu.

• 6.3.2 Pro každý standardní roztok benzylalkoholu (4.7) se vypočte poměr plochy píku benzylalkoholu a 4-ethoxyfenolu. Kalibrační křivka se sestrojí vynesením těchto poměrů na osu y a odpovídajících koncentrací benzylalkoholu v μg/ml na osu x.

• 6.4 Kvantitativní stanovení

• 6.4.1 Na kolonu se nastříkne 10 μl roztoku vzorku (6.1.6) a změří se plochy píků benzylalkoholu 4-ethoxyfenolu. Vypočítá se poměr ploch píků benzylalkoholu a 4-ethoxyfenolu. Tento postup se opakujte s dalšími s alikvotními podíly po 10 μl roztoku vzorku, dokud se nezískají shodné výsledky.

• 6.4.2 Z kalibrační křivky (6.3.2) se odečte koncentrace benzylalkoholu odpovídající poměru ploch píků benzylalkoholu a 4-ethoxyfenolu.

• 1. Výpočet

Obsah benzylalkoholu ve vzorku v hmotnostních procentech se vypočítá podle vzorce:

% (m/m) benzylakoholu = c400×m

kde

m =	hmotnost analyzovaného vzorku (6.1.1) v g,
c =	koncentrace benzylalkoholu v roztoku vzorku (6.1.1) v μg/ml, odečtená z kalibrační křivky.

• 1. Opakovatelnost

Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) benzylalkoholu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,10 %.

• 1. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ ZIRKONIA A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ ZIRKONIA, HLINÍKU A CHLORU V NEAEROSOLOVÝCH ANTIPERSPIRANTECH

Tato metoda má pět fází:

A. Kvalitativní stanovení zirkonia

B. Kvantitativní stanovení zirkonia

C. Kvantitativní stanovení hliníku

D. Kvantitativní stanovení chloru

E. Výpočet poměru obsahu atomů hliníku k obsahu atomů zirkonia a výpočet poměru obsahu atomů hliníku a zirkonia k obsahu atomů chloru.

A. Kvalitativní stanovení zirkonia

• 1. Rozsah a oblast použití

V této metodě je popsáno kvalitativní stanovení zirkonia v neaerosolových antiperspirantech. Nejsou popsány metody vhodné pro kvalitativní stanovení chloro(hydroxo)komplexů hliníku a zirkonia AlxZr(OH)yClZ.

• 1. Princip

Kvalitativní stanovení zirkonia se provede prostřednictvím tvorby charakteristické červenofialové sraženiny při reakci s alizarinovou červení S v silně kyselém prostředí.

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 3.1 Kyselina chlorovodíková, koncentrovaná (d20 = 1,18g/ml)

• 3.2 Roztok alizarinu S (CI 58005: 2 % (m/V) alizarinsulfonátu sodného ve vodě)

• 1. Přístroje a pomůcky

• 4.1 Běžné laboratorní vybavení

• 1. Postup

• 5.1 K přibližně 1 g vzorku ve zkumavce se přidají 2 ml vody. Zazátkuje se a protřepe.

• 5.2 Přidají se tři kapky roztoku alizarinové červeně S (3.2) a poté 2 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové (3.1). Zazátkuje se a protřepe.

• 5.3 Nechá se přibližně 2 minuty stát.

• 5.4 Červenofialové zabarvení supernatantu a sraženiny znamená přítomnost zirkonia.

B. Kvantitativní stanovení zirkonia

• 1. Rozsah a oblast použití

Tato metoda je vhodná pro kvantitativní stanovení zirkonia v chloro(hydroxo)komplexech hliníku a zirkonu až do maximální koncentrace zirkonu 5,4 % (m/m) v neaerosolových antiperspirantech.

• 1. Princip

Zirkonium se extrahuje z prostředku v kyselém prostředí a kvantitativní stanovení se provede plamenovou atomovou absorpční spektrometrií.

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 3.1 Kyselina chlorovodíková, koncentrovaná (d20 =1,18 g/ml)

• 3.2 Roztok kyseliny chlorovodíkové, 10% (V/V): k 500 ml vody v kádince se za stálého míchání přidá 100 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové (3.1). Tento roztok se převede do odměrné baňky na 1 litr a doplní se po rysku vodou.

• 3.3 Zásobní standardní roztok zirkonia, 1000 μg/ml v 0,5 mol/l roztoku kyseliny chlorovodíkové („SpectrosoL“ nebo ekvivalentní)

• 3.4 Chlorid hlinitý (hydratovaný) [AlCl3·6H2O]: činidlo: 22,6 g hexahydrátu chloridu hlinitého se rozpustí ve 250 ml 10% (V/V) roztoku kyseliny chlorovodíkové (3.2).

• 3.5 Chlorid amonný: činidlo: 5,0 g chloridu amonného se rozpustí ve 250 ml 10% (V/V) roztoku kyseliny chlorovodíkové (3.2).

• 1. Přístroje a pomůcky

• 4.1 Obvyklé laboratorní vybavení

• 4.2 Topná deska s magnetickým míchadlem

• 4.3 Filtrační papír (Whatman č. 41 nebo ekvivalentní)

• 4.4 Atomový absorpční spektrofotometr vybavený zirkoniovou výbojkou s dutou katodou

• 1. Postup

• 5.1 Příprava vzorku

• 5.1.1 Do kádinky na 150 ml se naváží asi 1,0 g (m gramů) homogenního vzorku prostředku přesně. Přidá se 40 ml vody a 10 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové (3.1).

• 5.1.2 Kádinka se umístí na topnou desku s magnetickým míchadlem (4.2). Zapne se míchání a zahřeje se až k varu. Aby se zabránilo rychlému odpaření, umístí se na kádinku hodinové sklo. Vaří se 5 minut, kádinka se sejme z topné desky a ochladí se na laboratorní teplotu.

• 5.1.3 Za použití filtračního papíru (4.3) se obsah kádinky zfiltruje do odměrné baňky na 100 ml. Kádinka se dvakrát vypláchne vždy 10 ml vody a oplachová voda se po zfiltrování přidá do baňky. Doplní se po rysku vodou a promíchá se. Tento roztok se také použije ke kvantitativnímu stanovení hliníku (část C).

• 5.1.4 Do odměrné baňky na 50 ml se odpipetuje 20,00 ml roztoku vzorku (5.1.1), 5,00 ml činidla chloridu hlinitého (3.4) a 5,00 ml činidla chloridu amonného (3.5). Doplní se po rysku 10% (V/V) roztokem kyseliny chlorovodíkové a promíchá se.

• 5.2 Podmínky atomové absorpční spektrometrie

Plamen: oxid dusný/acetylen

Vlnová délka: 360,1 nm

Korekce pozadí: ne

Podmínka paliva: bohaté; pro maximální absorbanci je nutná optimalizace výšky hořáku a palivových podmínek.

• 5.3 Kalibrace

• 5.3.1 Do série odměrných baněk na 50 ml se odpipetuje 5,00; 10,00; 15,00; 20,0 a 25,00 ml zásobního standardního roztoku zirkonia (3.3). Do každé odměrné baňky se odpipetuje 5,00 ml činidla chloridu hlinitého (3.4) a 5,00 ml činidla chloridu amonného (3.5). Doplní se po rysku 10% (V/V) kyselinou chlorovodíkovou (3.2) a promíchá se. Tyto roztoky obsahují 100, 200, 300, 400 a 500 μg zirkonia na mililitr.

Podobně se připraví slepý pokus, vynechá se standardní roztok zirkonia.

• 5.3.2 Změří se absorbance slepého pokusu (5.3.1) a získaná hodnota se použije jako nulová koncentrace zirkonia pro kalibrační křivku. Změří se absorbance každého kalibračního standardu zirkonia (5.3.1). Sestrojí se kalibrační křivka vynesením závislosti hodnot absorbance na koncentraci zirkonia.

• 5.4 Kvantitativní stanovení

Změří se absorbance roztoku vzorku (5.1.4). Z kalibrační křivky se odečte koncentrace zirkonia odpovídající hodnotě absorbance naměřené pro roztok vzorku.

• 1. Výpočet

Obsah zirkonia ze vzorku vyjádřený v hmotnostních procentech se vypočte podle vzorce:

% (m/m) zirkonia = c40 × m

kde

m =	hmotnost analyzovaného vzorku (5.1.1) v g,
c =	koncentrace zirkonia v roztoku vzorku (5.1.4) v μg/ml, odečtená z kalibrační křivky.

• 1. Opakovatelnost

Pro výrobky obsahující asi 3 % (m/m) zirkonia nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,10 %.

• 1. Poznámka

Použití metody spektrometrie s indukčně vázanou plazmou - optická emisní spektrometrie je povoleno jako alternativa plamenové atomové absorpční spektrometrie.

C. Kvantitativní stanovení hliníku

• 1. Rozsah a oblast použití

Tato metoda je vhodná pro kvantitativní stanovení hliníku v chloro(hydroxo)komplexech hliníku a zirkonia až do koncentrace hliníku 12 % (m/m) v neaerosolových antiperspirantech.

• 1. Princip

Hliník se extrahuje z prostředku v kyselém prostředí a kvantitativní stanovení se provede plamenovou atomovou absorpční spektrometrií.

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 3.1 Kyselina chlorovodíková, koncentrovaná (d20 = 1,18 g/ml)

• 3.2 Kyselina chlorovodíková, 1% (V/V) roztok: k 500 ml vody v kádince se za stálého míchání přidá 10 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové (3.1). Tento roztok se převede do odměrné baňky na 1 litr a doplní se po rysku vodou.

• 3.3 Zásobní standardní roztok hliníku: 1 000 μg/ml v 0,5M roztoku kyseliny dusičné („SpectrosoL“ nebo ekvivalentní)

• 3.4 Činidlo s chloridem draselným: 10,0 g chloridu draselného se rozpustí ve 250 ml 1 % kyseliny chlorovodíkové (3.2).

• 1. Přístroje a pomůcky

• 4.1 Obvyklé laboratorní vybavení

• 4.2 Atomový absorpční spektrofotometr vybavený hliníkovou výbojkou s dutou katodou

• 1. Postup

• 5.1 Příprava vzorku

Pro kvantitativní stanovení hliníku se použije roztok připravený v části B 5.1.3.

• 5.1.1 Do odměrné baňky na 100 ml se odpipetuje 5,00 ml roztoku vzorku (B 5.1.3) a 10,00 ml činidla s chloridem draselným (3.4). Doplní se po rysku 1% roztokem kyseliny chlorovodíkové (3.2) a promíchá se.

• 5.2 Podmínky atomové absorpční spektrometrie

Plamen: oxid dusný-acetylen

Vlnová délka: 309,3 nm

Korekce pozadí: ne

Podmínka paliva: bohaté; pro maximální absorbanci je nutná optimalizace výšky hořáku a palivových podmínek.

• 5.3 Kalibrace

• 5.3.1 Do série odměrných baněk na 100 ml se odpipetuje 1,00; 2,00; 3,00; 4,00 a 5,00 ml zásobního standardního roztoku hliníku (3.3). Do každé odměrné baňky se odpipetuje 10,00 ml činidla s chloridem draselným (3.4) a doplní se po rysku 1% roztokem kyseliny chlorovodíkové (3.2) a promíchá se. Tyto roztoky obsahují 10, 20, 30, 40 a 50 μg hliníku na mililitr.

Obdobně se připraví slepý pokus, vynechá se standardní roztok hliníku.

• 5.3.2 Změří se absorbance slepého pokusu (5.3.1) a takto získaná hodnota se použije jako nulová koncentrace hliníku pro kalibrační křivku. Změří se absorbance každého standardního roztoku hliníku. Sestrojí se kalibrační křivka vynesením závislosti hodnot absorbance na koncentraci hliníku.

• 5.4 Kvantitativní stanovení

Změří se absorbance roztoku vzorku (5.1.1). Z kalibrační křivky se odečte koncentrace hliníku odpovídající hodnotě absorbance naměřené pro roztok vzorku.

• 1. Výpočet

Obsah hliníku ve vzorku vyjádřený v hmotnostních procentech se vypočte podle vzorce:

% (m/m) hliníku = c5×m

kde

m =	hmotnost analyzovaného vzorku (B 5.1.1) v g,
c =	koncentrace hliníku v roztoku vzorku (5.1.1) v μg/ml, odečtená z kalibrační křivky.

• 1. Opakovatelnost

Pro výrobky obsahující asi 3,5% (m/m) hliníku nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,10 %.

• 1. Poznámka

Použití metody spektrometrie s indukčně vázanou plazmou - optická emisní spektrometrie je povoleno jako alternativa plamenové atomové absorpční spektrometrie.

D. Kvantitativní stanovení chloru

• 1. Rozsah a oblast použití

Tato metoda je vhodná pro kvantitativní stanovení chloru přítomného ve formě chloridových iontů v chloro(hydroxo)komplexech hliníku a zirkonia v neaerosolových antiperspirantech.

• 1. Princip

Obsah chloridových iontů v prostředku se stanoví potenciometrickou titrací standardním roztokem dusičnanu stříbrného.

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 3.1 Kyselina dusičná, koncentrovaná (d20 = 1,42 g/ml)

• 3.2 Kyselina dusičná, 5% (V/V) roztok: ke 250 ml vody v kádince se za stálého míchání přidá 25 ml koncentrované kyseliny dusičné (3.1). Tento roztok se přenese do odměrné baňky na 500 ml a doplní se po rysku vodou.

• 3.3 Aceton

• 3.4 Dusičnan stříbrný, 0,1 mol/l odměrný roztok („AnalaR“ nebo ekvivalentní)

• 1. Přístroje a pomůcky

• 4.1 Obvyklé laboratorní vybavení

• 4.2 Topná deska s magnetickým míchadlem

• 4.3 Stříbrná elektroda

• 4.4 Kalomelová referentní elektroda

• 4.5 pH-metr nebo milivoltmetr vhodný pro potenciometrickou titraci

• 1. Postup

• 5.1 Příprava vzorku

• 5.1.1 Do kádinky na 250 ml se odváží přibližně 1,0 g (m gramů) homogenního vzorku prostředku přesně. Přidá se 80 ml vody a 20 ml roztoku 5% kyseliny dusičné (3.2).

• 5.1.2 Kádinka se umístí na topnou desku s magnetickým míchadlem (4.2). Zapne se míchání a zahřeje se až k varu. Aby se zabránilo rychlému odpaření, umístí se na kádinku hodinové sklo. Vaří se 5 minut, kádinka se sejme z topné desky a ochladí se na laboratorní teplotu.

• 5.1.3 Přidá se 10 ml acetonu (3.3), elektrody (4.3 a 4.4) se ponoří pod hladinu roztoku a zapne se míchání. Provede se potenciometrická titrace 0,1 mol/l roztokem dusičnanu stříbrného (3.4) a sestrojí se diferenciální křivka za účelem stanovení bodu ekvivalence (V ml).

• 1. Výpočet

Obsah chloru ve vzorku, vyjádřený v hmotnostních procentech, se vypočítá podle vzorce:

% (m/m) chloru = 0,3545×Vm

kde

m =	hmotnost anylyzovaného vzorku (5.1.1) v g,
V =	objem 0,1 mol/l roztoku dusičnanu stříbrného v mililitrech, spotřebovaného pro titraci do bodu ekvivalence.

• 1. Opakovatelnost

Pro výrobky obsahující asi 4 % (m/m) chloru nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,10 %.

E. Výpočet poměru obsahu atomů hliníku k obsahu atomů zirkonia a výpočet poměru obsahu atomů hliníku a zirkonia k obsahu atomů chloru

• 1. Výpočet poměru obsahu atomů hliníku k obsahu atomů zirkonia

Poměr Al:Zr se vypočítá podle vzorce:

poměr Al:Zr = Al%m/m×91,22Zr%m/m×26,98

• 1. Výpočet poměru obsahu atomů hliníku a zirkonia k obsahu atomů chloru

Poměr (Al + Zr):Cl se vypočítá podle vzorce:

poměr Al + Zr:Cl = Al%m/m26,98+Zr%m/m91,22Cl%m/m35,45

• 1. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ HEXAMIDINU, DIBROMHEXAMIDINU, DIBROMPROPAMIDINU A CHLORHEXIDINU

• 1. Rozsah a oblast použití

V této metodě je popsáno kvalitativní a kvantitativní stanovení

— hexamidinu a jeho solí včetně 2-hydroxyethansulfonátu a 4-hydroxybenzoátu,

— dibromhexamidinu a jeho solí včetně 2-hydroxyethansulfonátu,

— dibrompropamidinu a jeho solí včetně 2-hydroxyethansulfonátu,

— diacetátu, diglukonátu a dihydrochloridu chlorhexidinu

v kosmetických prostředcích.

• 1. Definice

Koncentrace hexamidinu, bromdibromhexamidinu, bromdibrompropamidinu a chlorhexidinu stanovené touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech (% m/m).

• 1. Podstata metody

Kvalitativní a kvantitativní stanovení se provádí pomocí chromatografie iontových párů za použití vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) s obrácenými fázemi s následnou detekcí UV spektrofotometrií. Hexamidin, dibromhexamidin, dibrompropamidin a chlorhexidin se kvalitativně stanovují podle svých retenčních časů v chromatografické koloně.

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a podle potřeby musí být vhodná pro HPLC.

• 4.1 Methanol

• 4.2 Natrium-heptan-1-sulfonát monohydrát

• 4.3 Ledová kyselina octová (d20 = 1,05 g/ml)

• 4.4 Chlorid sodný

• 4.5 Mobilní fáze

• 4.5.1 Eluent I: 0,005 mol/l roztok natrium-heptan-1-sulfonátu monohydrátu (4.2) v methanolu (4.1) upravený ledovou kyselinou octovou (4.3) na hodnotu pH 3,5.

• 4.5.2 Eluent II: 0,005 mol/l roztok natrium-heptan-1-sulfonátu monohydrátu (4.2) ve vodě upravený ledovou kyselinou octovou (4.3) na hodnotu pH 3,5.

Poznámka: Je-li nutné zlepšit tvar píků, lze mobilní fáze upravit a připravit níže uvedeným způsobem:

— eluent I: 5,84 g chloridu sodného (4.4) a 1,1013 g natrium-heptan-1-sulfonátu monohydrátu (4.2) se rozpustí ve 100 ml vody. Přidá se 900 ml methanolu (4.1) a upraví se ledovou kyselinou octovou (4.3) na hodnotu pH 3,5.

— eluent II: 5,84 g chloridu sodného (4.4) a 1,1013 g natrium-heptan-1-sulfonátu monohydrátu (4.2) se rozpustí v jednom litru vody a upraví se ledovou kyselinou octovou (4.3) na hodnotu pH 3,5.

• 4.6 Hexamidin-di(2-hydroxyethansulfonát) [C20H26N4O2·2C2H6O4S]

• 4.7 Dibromhexamidin-di(2-hydroxyethansulfonát) [C20H24Br2N4O2·2C2H6O4S]

• 4.8 Dibrompropamidin-di(2-hydroxyethansulfonát) [C17H18Br2N4O2·2C2H6O4S]

• 4.9 Chlorhexidin-diacetát [C22H30Cl2N10·2C2H4O2]

• 4.10 Standardní roztoky: v eluentu I (4.5.1) se připraví 0,05% (m/V) roztoky všech čtyř konzervantů (4.6 až 4.9).

• 4.11 3,4,4'-Trichlorkarbanilid (Triclocarban - INN)

• 4.12 4,4'-Dichlor-3-(trifluormethyl)karbanilid (Halocarban - INN)

• 1. Přístroje a pomůcky

• 5.1 Obvyklé laboratorní vybavení

• 5.2 Chromatograf pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s UV detektorem s nastavitelnou vlnovou délkou

• 5.3 Analytická dělicí kolona: kolona z nerezové oceli o délce 30 cm a vnitřním průměru 4 mm, s náplní μ-Bondapack C18, 10 μm, nebo s ekvivalentní náplní.

• 5.4 Ultrazvuková lázeň

• 1. Kvalitativní stanovení

• 6.1 Příprava vzorku

Do odměrné baňky na 10 ml se naváží asi 0,5 g vzorku přesně a doplní se po rysku eluentem I (4.5.1). Baňka se na 10 minut vloží do ultrazvukové lázně (5.4). Roztok se zfiltruje nebo odstředí. Filtrát nebo supernatant se použije pro chromatografii.

• 6.2 Chromatografie

• 6.2.1 Gradient mobilní fáze

Čas (min)	eluent I (% V/V) (4.5.1)	eluent II (% V/V) (4.5.2)
0	50	50
15	65	35
30	65	35
45	50	50

• 6.2.2 Průtok mobilní fáze (6.2.1) se nastaví na 1,5 ml/min a teplota kolony se nastaví na 35 °C.

• 6.2.3 Vlnová délka detektoru se nastaví na 264 nm.

• 6.2.4 Provede se nástřik 10 μl každého z referenčních roztoků (4.10) a zaznamenají se jejich chromatogramy.

• 6.2.5 Provede se nástřik 10 μl roztoku vzorku (6.1) a zaznamená se jeho chromatogram.

• 6.3 Důkaz přítomnosti hexamidinu, dibromhexamidinu, dibrompropamidinu nebo chlorhexidinu se provede porovnáním retenčních časů píků zaznamenaných v bodě 6.2.5 s píky získanými pro referenční roztoky v bodě 6.2.4.

• 1. Kvantitativní stanovení

• 7.1 Příprava standardních roztoků

Jako vnitřní standard se použije jeden z konzervantů (4.6 až 4.9), který není ve vzorku přítomen. Není-li to možné, může být použit Triclocarban (4.11) nebo Halocarban (4.12).

• 7.1.1 Zásobní roztok konzervantu, jehož přítomnost je prokázána v bodě 6.3, 0,05% (m/V) v eluentu I (4.5.1).

• 7.1.2 Zásobní roztok konzervantu zvoleného jako vnitřní standard, 0,05% (m/V) v eluentu I (4.5.1).

• 7.1.3 Pro každý nalezený konzervant se připraví čtyři standardní roztoky tak, že se do odměrných baněk na 10 ml odměří podle níže uvedené tabulky množství zásobního roztoku prokázaného konzervantu (7.1.1) a množství zásobního roztoku vnitřního standardu (7.1.2).

Standardní roztok	Zásobní roztok vnitřního standardu	Zásobní roztok konzervantu, jehož přítomnost byla prokázána
počet přidaných ml (7.1.2)	počet přidaných ml (7.1.1)	μg/ml (*)
I	1,0	0,5	25
II	1,0	1,0	50
III	1,0	1,5	75
IV	1,0	2,0	100
(*) Tyto hodnoty jsou uvedeny jako ukazatele a odpovídají koncentracím standardních roztoků prokázaných konzervantů, připravených ze zásobních roztoků obsahujících přesně 0,05 % prokázaného konzervantu.

• 7.2 Příprava vzorku

• 7.2.1 Do odměrné baňky na 10 ml se naváží asi 0,5 g (p gramů) vzorku přesně, přidá se 1,0 ml roztoku vnitřního standardu (7.1.2) a 6 ml eluentu I (4.5.1) a promíchá se.

• 7.2.2 Baňka se umístí na 10 minut do ultrazvukové lázně (5.4). Ochladí se. Doplní se po rysku eluentem I a promíchá. Odstředí se nebo se zfiltruje přes skládaný filtrační papír. Supernatant nebo popřípadě filtrát se použije pro chromatografii.

• 7.3 Chromatografie

• 7.3.1 Gradient mobilní fáze, průtok, teplota kolony a vlnová délka detektoru zařízení pro HPLC (5.2) se nastaví podle podmínek požadovaných při kvalitativním stanovení (6.2.1 až 6.2.3).

• 7.3.2 Nastříkne se 10 μl roztoku vzorku (7.2.2) a změří se plochy píků. Tento postup se opakuje s dalšími 10μl alikvotními podíly roztoku vzorku tak dlouho, dokud se nezískají shodné výsledky. Vypočítá se poměr plochy píku analyzované sloučeniny k ploše píku vnitřního standardu.

• 7.4 Kalibrace

• 7.4.1 Nastříkne se 10 μl každého standardního roztoku (7.1.3) a změří se plochy píků.

• 7.4.2 Pro každý standardní roztok (7.1.3) se vypočítá poměr plochy píku hexamidinu, dibromhexamidinu, dibrompropamidinu nebo chlorhexidinu k ploše píku vnitřního standardu. Kalibrační křivka se sestrojí vynesením těchto poměrů na osu y a odpovídajících koncentrací standardních roztoků prokázaných konzervantů v μg/ml na osu x.

• 7.4.3 Z kalibrační křivky (7.4.2) se odečte koncentrace prokázaného konzervantu odpovídající poměru ploch píků vypočítanému v bodě 7.3.2.

• 1. Výpočet

• 8.1 Obsah hexamidinu, dibromhexamidinu, dibrompropamidinu nebo chlorhexidinu ve vzorku v hmotnostních procentech se vypočítá podle vzorce:

%m/m=c1000×p×MW1MW2

kde

p =	hmotnost analyzovaného vzorku (7.2.1) v g,
c =	koncentrace konzervantu v roztoku vzorku, odečtená z kalibrační křivky, v μg/ml,
MW1 =	molekulová hmotnost základní formy přítomného konzervantu,
MW2 =	molekulová hmotnost odpovídající soli (viz bod 10).

• 1. Opakovatelnost

Pro výrobky obsahující asi 0,1 % (m/m) hexamidinu, dibromhexamidinu, dibrompropamidinu nebo chlorhexidinu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,005 %.

• 1. Tabulka molárních hmotností

Hexamidin	C20H26N4O2	354,45
Hexamidin-di(2-hydroxyethansulfonát)	C20H26N4O2·2C2H6O4S	606,72
Hexamidin-di-p-hydroxybenzoát	C20H26N4O2·2C7H6O3	630,71
Dibromhexamidin	C20H24Br2N4O2	512,24
Dibromhexamidin-di(2-hydroxyethansulfonát)	C20H24Br2N4O2·2C2H6O4S	764,51
Dibrompropamidin	C17H18Br2N4O2	470,18
Dibrompropamidin-di(2-hydroxyethansulfonát)	C17H18Br2N4O2·2C2H6O4S	722,43
Chlorhexidin	C22H30Cl2N10	505,45
Chlorhexidin-diacetát	C22H30Cl2N10·2C2H4O2	625,56
Chlorhexidin-diglukonát	C22H30Cl2N10·2C6H12O7	897,76
Chlorhexidin-dihydrochlorid	C22H30Cl2N10·2HCl	578,37

• 1. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ KYSELINY BENZOOVÉ, KYSELINY 4-HYDROXYBENZOOVÉ, KYSELINY SORBOVÉ, KYSELINY SALICYLOVÉ A KYSELINY PROPIONOVÉ V KOSMETICKÝCH PROSTŘEDCÍCH

• 1. Rozsah a oblast použití

Metoda je použitelná pro kvalitativní a kvantitativní stanovení kyseliny benzoové, kyseliny 4-hydroxybenzoové, kyseliny sorbové, kyseliny salicylové a kyseliny propionové v kosmetických prostředcích. Samostatně jsou popsány postupy kvalitativního stanovení těchto konzervantů, kvantitativního stanovení kyseliny propionové a kvantitativního stanovení kyseliny 4-hydroxybenzoové, kyseliny salicylové, kyseliny sorbové a kyseliny benzoové.

• 1. Definice

Množství kyseliny benzoové, kyseliny 4-hydroxybenzoové, kyseliny salicylové, kyseliny sorbové a kyseliny propionové stanovená touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech volných kyselin.

A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ

• 1. Princip

Po kyselé/zásadité extrakci konzervantů se extrakt analyzuje chromatografií na tenké vrstvě (TLC) a reakční chromatografií („derivatizace na desce“). V závislosti na výsledcích se kvalitativní stanovení potvrdí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) nebo, v případě kyseliny propionové, plynovou chromatografií (GC).

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

• 2.1 Všeobecně

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší. Musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň ekvivalentní čistoty.

• 2.2 Aceton

• 2.3 Diethylether

• 2.4 Acetonitril

• 2.5 Toluen

• 2.6 n-Hexan

• 2.7 Parafin, tekutý

• 2.8 Kyselina chlorovodíková, 4 mol/l

• 2.9 Hydroxid draselný,4 mol/l vodný roztok

• 2.10 Chlorid vápenatý, CaCl2·2H2O

• 2.11 Uhličitan lithný, Li2CO3

• 2.12 2-Brom-2'-acetonafton

• 2.13 Kyselina 4-hydroxybenzoová

• 2.14 Kyselina salicylová

• 2.15 Kyselina benzoová

• 2.16 Kyselina sorbová

• 2.17 Kyselina propionová

• 2.18 Standardní roztoky

Připraví se 0,1% (m/V) roztoky (100 mg/100 ml) každého z pěti konzervantů (2.13 až 2.17) v diethyletheru.

• 2.19 Derivatizační činidlo

0,5% roztok 2-bromo-2'-acetonaftonu (2.12) v acetonitrilu (2.4) (50 mg/10 ml). Tento roztok by měl být připravován každý týden a uchováván v ledničce.

• 2.20 Roztok katalyzátoru

0,3% (m/V) roztok uhličitanu lithného (2.11) ve vodě (300 mg/100 ml). Tento roztok by měl být připravován vždy čerstvý.

• 2.21 Mobilní fáze

Toluen (2.5)/aceton (2.2) (20:0,5, V/V)

• 2.22 Tekutý parafin (2.7)/n-hexan (2.6) (1:2, V/V)

• 1. Přístroje a pomůcky

Obvyklé laboratorní vybavení

• 3.1 Vodní lázeň nastavitelná na teplotu 60 °C

• 3.2 Vyvíjecí komora

• 3.3 Zdroj ultrafialového světla, 254 a 366 nm

• 3.4 Hotové desky pro chromatografii na tenké vrstvě, Silikagel 60, bez fluorescenčního indikátoru, 20 x 20 cm, tloušťka vrstvy 0,25 mm s koncentrační zónou 2,5 x 20 cm (Merck 11845 nebo ekvivalentní)

• 3.5 Mikrostříkačka na 10 μl

• 3.6 Mikrostříkačka na 25 μl

• 3.7 Sušárna nastavitelná na teplotu až 105 °C

• 3.8 Erlenmeyerovy baňky na 50 a 200 ml se zábrusovou zátkou

• 3.9 Filtrační papír, průměr 90 mm, Schleicher & Schüll, Weissband No. 5892, nebo ekvivalentní

• 3.10 Univerzální indikátorový papírek, pH 1 - 11

• 3.11 Skleněné vzorkovací lahvičky na 5 ml

• 3.12 Rotační vakuová odparka (Rotavapor nebo ekvivalentní)

• 3.13 Topná deska

• 1. Postup

• 4.1 Příprava vzorků

Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se zábrusovou zátkou (3.8) se odváží přibližně 1 g vzorku. Přidají se čtyři kapky 4 mol/l kyseliny chlorovodíkové (2.8) a 40 ml acetonu (2.2). U silně zásaditých prostředků, jako je toaletní mýdlo, by mělo být přidáno 20 kapek 4 mol/l kyseliny chlorovodíkové (2.8). Pomocí indikátorového papírku (3.10) se zkontroluje, zda je pH přibližně 2. Baňka se uzavře a po dobu 1 minuty se silně protřepává.

Je-li nezbytné usnadnit extrakci konzervantů do acetonové fáze, směs se opatrně zahřeje na asi 60 °C, aby se tekutá fáze rozpustila.

Roztok se zchladí na laboratorní teplotu a přefiltruje přes filtrační papír (3.9) do Erlenmeyerovy baňky.

20 ml filtrátu se převede do Erlenmeyerovy baňky na 200 ml, přidá se 20 ml vody a promíchá se. pH směsi se upraví přibližně na 10 pomocí 4 mol/l hydroxidu draselného (2.9) za použití indikátorového papírku (3.10).

Přidá se 1 g chloridu vápenatého (2.10) a silně se protřepe. Zfiltruje se přes filtrační papír (3.9) do dělicí nálevky na 250 ml obsahující 75 ml diethyletheru (2.3) a silně se třepe 1 minutu. Vrstvy se nechají oddělit a vodná vrstva se převede do Erlenmeyerovy baňky na 250 ml. Etherová vrstva se zlikviduje. Za použití indikátorového papírku (3.10) se pH vodného roztoku upraví na přibližně 2 okyselením 4 mol/l kyselinou chlorovodíkovou (2.8). Přidá se 10 ml diethyletheru (2.3), baňka se zazátkuje a silně protřepává 1 minutu; vrstvy se nechají oddělit a etherová vrstva se převede do rotační odparky (3.12). Vodná vrstva se zlikviduje.

Etherová vrstva se odpaří téměř do sucha a zbytek se znovu rozpustí v 1 ml diethyletheru (2.3). Roztok se převede do vzorkovací lahvičky (3.11).

• 4.2 Chromatografie na tenké vrstvě

Na startovní linii koncentrační zóny TLC desky (3.4) se do bodů, jejichž počet odpovídá počtu referenčních roztoků a roztoků vzorků, které mají být analyzovány, nanese stříkačkou (3.5) ve stejných odstupech vždy po 3 μl uhličitanu lithného (2.20) a vysuší se v proudu studeného vzduchu.

Chromatografická deska se přenese na topnou desku (3.13) zahřátou na 40 °C, aby se skvrny udržely co nejmenší. Mikrostříkačkou (3.5) se na startovní linii desky nanese vždy 10 μl každého standardního roztoku (2.18) a roztoku vzorku (4.1) přesně do bodů, kam byl nanesen uhličitan lithný.

Nakonec se opět přesně do bodů, kam byly naneseny referenční roztoky/roztoky vzorku a roztok uhličitanu lithného, nanese přibližně 15 μl derivatizačního činidla (2.19) (roztok 2-bromo-2'-acetonaftonu).

Chromatografická deska se zahřívá v sušárně (3.7) 45 minut při 80 °C. Po vychladnutí se deska vyvíjí v komoře (3.2), která byla 15 minut (bez vyložení filtračním papírem) sycena mobilní fází 2.21 (toluen/aceton), dokud čelo rozpouštědla nedosáhne vzdálenosti 15 cm (doba vyvíjení je přibližně 80 minut).

Deska se vysuší v proudu studeného vzduchu a získané skvrny se vyhodnotí pod UV světlem (3.3). Pro zesílení fluorescence slabých skvrn může být chromatografická deska ponořena do tekutého parafinu/n-hexanu (2.22).

• 1. Kvalitativní stanovení

Pro každou skvrnu se vypočte hodnota Rf.

Hodnoty Rf a chování vzorku pod UV světlem se porovnají s hodnotami a chováním referenčních vzorků.

Učiní se předběžné závěry o přítomnosti a kvalitativním stanovení konzervantů. Provede se vysokoúčinná kapalinová chromatografie popsaná v oddílu B, nebo ukazuje-li se, že je přítomna kyselina propionová, provede se plynová chromatografie popsaná v oddílu C. Získané retenční časy se porovnají s retenčními časy referenčních vzorků.

Výsledky TLC a HPLC nebo GC se zkombinují a konečný důkaz konzervantů vychází z kombinace výsledků.

B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ KYSELINY BENZOOVÉ, KYSELINY 4-HYDROXYBENZOOVÉ, KYSELINY SORBOVÉ A KYSELINY SALICYLOVÉ

• 1. Princip

Vzorek se po okyselení extrahuje směsí ethanolu a vody. Po filtraci se konzervanty stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

• 2.1 Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a musí být vhodná pro HPLC. Musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň ekvivalentní čistoty.

• 2.2 Ethanol, absolutní

• 2.3 Kyselina 4-hydroxybenzoová

• 2.4 Kyselina salicylová

• 2.5 Kyselina benzoová

• 2.6 Kyselina sorbová

• 2.7 Octan sodný, (CH3COONa·3H2O)

• 2.8 Kyselina octová,d420 = 1,05 g/ml

• 2.9 Acetonitril

• 2.10 Kyselina sírová, 2 mol/l

• 2.11 Hydroxid draselný, 0,2 mol/l vodný roztok

• 2.12 Kyselina 2-methoxybenzoová

• 2.13 Směs ethanol/voda

Devět dílů ethanolu (2.2) se smíchá s jedním dílem vody (2:1)

• 2.14 Roztok vnitřního standardu

Připraví se roztok obsahující 1 g kyseliny 2-methoxybenzoové (2.12) v 500 ml směsi ethanol/voda (2.13).

• 2.15 Mobilní fáze pro HPLC

• 2.15.1 Acetátový tlumivý roztok: do 1 litru vody se přidá 6,35 g octanu sodného (2.7) a 20,0 ml kyseliny octové (2.8) a smíchá se.

• 2.15.2 Mobilní fáze se připraví smícháním devíti dílů acetátového tlumivýho roztoku (2.15.1) a jednoho dílu acetonitrilu (2.9).

• 2.16 Zásobní roztok konzervantů

Do odměrné baňky na 50 ml se naváží asi 0,05 g kyseliny 4-hydroxybenzoové (2.3), 0,2 g kyseliny salicylové (2.4), 0,2 g kyseliny benzoové (2.5) a 0,05 g kyseliny sorbové (2,6) přesně a objem se doplní směsí ethanol/voda (2.13). Roztok se uchovává v ledničce. Roztok je stabilní jeden týden.

• 2.17 Standardní roztoky konzervantů

Do odměrných baněk na 20 ml se odměří 8,00; 4,00; 2,00; 1,00 a 0,50 ml zásobního roztoku (2.16). Do každé baňky se přidá 10,00 ml roztoku vnitřního standardu (2.14) a 0,5 ml 2 mol/l kyseliny sírové (2.10). Objem se doplní směsí ethanol/voda (2.13). Tyto roztoky musí být připravovány čerstvé.

• 1. Přístroje a pomůcky

Obvyklé laboratorní vybavení, které není nijak specifikováno a

• 3.1 Vodní lázeň, nastavená na 60 °C

• 3.2 Chromatograf pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s UV detektorem s nastavitelnou vlnovou délkou a 10μl nastřikovací smyčkou

• 3.3 Analytická kolona

Nerezová ocel, délka 12,5 až 25 cm, vnitřní průměr 4,6 mm, plněná Nucleosilem 5C18 nebo ekvivalentní náplní

• 3.4 Filtrační papír, průměr: 90 mm, Schleicher and Schüll, Weissband No 5892 nebo ekvivalentní

• 3.5 Erlenmeyerovy baňky na 50 ml

• 3.6 Skleněné vzorkovací lahvičky na 5 ml

• 3.7 Varné kamínky, karborundum, velikost 2 – 4 mm, nebo ekvivalentní

• 1. Postup

• 4.1 Příprava vzorku

• 4.1.1 Příprava vzorku bez přidání vnitřního standardu

Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml (3.5) se naváží 1 g vzorku. Do baňky se odpipetuje 1,00 ml 2 mol/l kyseliny sírové (2.10) a 40,0 ml směsi ethanol/voda (2.13). Přidá se přibližně 1 g varných kamínků (3.7), zkumavka se uzavře a silně se alespoň 1 minutu protřepává, dokud nevznikne homogenní suspenze. Pro usnadnění extrakce konzervantů do ethanolové fáze se baňka zahřívá přesně 5 minut na vodní lázni (3.1) při 60 °C.

Baňka se ihned ochladí v proudu studené vody a extrakt se na hodinu uloží při 5 °C.

Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír (3.4). Asi 2 ml extraktu se převedou do vzorkovací lahvičky (3.6). Extrakt se uchovává při 5 °C a stanovení pomocí HPLC se provede do 24 hodin.

• 4.1.2 Příprava vzorku s přidáním vnitřního standardu

Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml (3.5) se s přesností na tři desetinná místa naváží 1 ± 0,1 g vzorku (a gramů). Pipetou se přidá 1,00 ml 2 mol/l kyseliny sírové (2.10) a 30,0 ml směsi ethanol/voda (2.13). Přidá se přibližně 1 g varných kamínků (3.7) a 10,00 ml roztoku vnitřního standardu. Baňka se uzavře a silně se alespoň 1 minutu protřepává, dokud nevznikne homogenní suspenze. Pro usnadnění extrakce konzervantů do ethanolové fáze se baňka zahřívá přesně 5 minut na vodní lázni (3.1) při 60 °C.

Zkumavka se ihned ochladí v proudu studené vody a extrakt se uloží na hodinu při 5 °C.

Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír (3.4). Asi 2 ml extraktu se převedou do vzorkovací lahvičky (3.6). Extrakt se uchovává při 5 °C a stanovení pomocí HPLC se provede do 24 hodin.

• 4.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Mobilní fáze: acetonitril/acetátový tlumivý roztok (2.15).

Průtok mobilní fáze kolonou se nastaví na 2,0 ± 0,5 ml/min. Vlnová délka detektoru se nastaví na 240 nm.

• 4.2.1 Kalibrace

Do kapalinového chromatografu (3.2) se nastříkne po 10 μl standardních roztoků konzervantů (2.17). Pro každý roztok se ze získaných chromatogramů stanoví poměr výšky píku vyšetřovaného konzervantu k výšce píku vnitřního standardu získaného z chromatogramů. Sestrojí se graf závislosti poměru výšek píků na koncentraci každého standardního roztoku.

Přesvědčte se, že při kalibraci byla pro standardní roztoky získána lineární odezva.

• 4.2.2 Stanovení

Do kapalinového chromatografu (3.2) se nastříkne 10 μl extraktu vzorku (4.1.1) a zaznamená se chromatogram. Nastříkne se 10 μl standardního roztoku konzervantu (2.17) a zaznamená se chromatogram. Obdržené chromatogramy se porovnají. Není-li v chromatogramu extraktu vzorku (4.1.1) žádný pík s přibližně stejným retenčním časem jako pík kyseliny 2-methoxybenzoové (doporučený vnitřní standard), nastříkne se do kapalinového chromatografu 10 μl extraktu vzorku s přidaným vnitřním standardem (4.1.2) a zaznamená se chromatogram.

Je-li v chromatogramu extraktu vzorku (4.1.1) rušivý pík se stejným retenčním časem jako kyselina 2-methoxybenzoová, měl by být vybrán jiný vnitřní standard. (Není-li jeden z vyšetřovaných konzervantů v chromatogramu přítomen, lze tento konzervant použít jako vnitřní standard.)

Je třeba se ujistit, že při kalibraci byla pro standardní roztoky získána lineární odezva.

Je třeba ověřit, zda chromatogramy získané pro standardní roztok a roztok vzorku splňují následující požadavky:

— rozlišení píků nejhůře odděleného páru je alespoň 0,90. (Definice rozlišení píků je uvedena na obrázku 12);

[image omitted]

Obrázek 12: Rozlišení píků

Není-li požadovaného rozlišení dosaženo, měla by být buď použita účinnější kolona nebo by mělo být složení mobilní fáze upraveno tak, aby byl požadavek splněn;

— faktor asymetrie As všech získaných píků by se měl pohybovat od 0,9 do 1,5. (Definice faktoru asymetrie je uvedena na obrázku 13) Při zaznamenání chromatogramu za účelem stanovení faktoru asymetrie je doporučená rychlost papíru 2 cm/min.

[image omitted]

Obrázek 13: Faktor asymetrie píku

— Základna musí být stabilní.

• 1. Výpočet

Pro výpočet koncentrace konzervantů v roztoku vzorku se použijí poměry výšek píků vyšetřovaných konzervantů a výšky píku kyseliny 2-methoxybenzoové (vnitřní standard) a dále kalibrační graf. Obsah kyseliny benzoové, kyseliny 4-hydroxybenzoové, kyseliny sorbové nebo kyseliny salicylové ve vzorku v hmotnostních procentech (xi) se vypočte pomocí vzorce

xi % m/m = 100·20·b106·a=b500·a

kde

a =	hmotnost zkušebního vzorku (4.1.2) (g),
b =	koncentrace konzervantu v extraktu vzorku (4.1.2) (μl/ml) odečtená z kalibračního grafu.

• 1. Opakovatelnost

Pro výrobky obsahující asi 0,4 % (m/m) kyseliny 4-hydroxybenzoové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,035 %.

Pro výrobky obsahující asi 0,5 % (m/m) kyseliny benzoové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,050 %.

Pro výrobky obsahující asi 0,5 % (m/m) kyseliny salicylové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,045 %.

Pro výrobky obsahující asi 0,6 % (m/m) kyseliny sorbové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,035 %.

• 1. Poznámky

• 7.1 Výsledky testování robustnosti metody ukazují, že množství kyseliny sírové přidané do extraktu kyselin ze vzorku je rozhodující a množství zpracovávaného vzorku by tedy mělo být v předepsaném rozmezí.

• 7.2 Je-li to žádoucí, lze použít vhodnou ochrannou kolonu.

C. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ KYSELINY PROPIONOVÉ

• 1. Rozsah a oblast použití

Tato metoda je vhodná pro stanovení kyseliny propionové v kosmetických prostředcích až do maximální koncentrace 2 % (m/m).

• 1. Definice

Koncentrace kyseliny propionové stanovená touto metodou se vyjádří v procentech hmotnosti (% m/m) prostředku.

• 1. Princip

Po extrakci kyseliny propionové z prostředku se kvantitativní stanovení provede plynovou chromatografií za použití kyseliny 2-methylpropionové jako vnitřního standardu.

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň ekvivalentní čistoty.

• 4.1 Ethanol, 96% (V/V)

• 4.2 Kyselina propionová

• 4.3 Kyselina 2-methylpropionová

• 4.4 Kyselina trihydrogenfosforečná, 10% (m/V)

• 4.5 Roztok kyseliny propionové

Do odměrné baňky na 50 ml se naváží 1,00 g (p gramů) kyseliny propionové přesně a doplní se na objem ethanolem (4.1).

• 4.6 Roztok vnitřního standardu

Do odměrné baňky na 50 ml se přesně naváží 1,00 g (e gramů) kyseliny 2-methylpropionové a doplní se na objem ethanolem (4.1).

• 1. Přístroje a pomůcky

• 5.1 Obvyklé laboratorní vybavení

• 5.2 Plynový chromatograf s plamenovým ionizačním detektorem

• 5.3 Skleněná zkumavka (20 x 150 mm) se šroubovacím uzávěrem

• 5.4 Vodní lázeň nastavená na 60 °C

• 5.5 Skleněná injekční stříkačka na 10 ml s filtrační membránou (průměr pórů 0,45 μm)

• 1. Postup

• 6.1 Příprava vzorku

• 6.1.1 Příprava vzorku bez vnitřního standardu

Do skleněné zkumavky (5.3) se naváží asi 1 g vzorku přesně. Přidá se 0,5 ml kyseliny trihydrogenfosforečné(4.4) a 9,5 ml ethanolu (4.1).

Zkumavka se uzavře a silně protřepe. Je-li to nezbytné, umístí se zkumavka na 5 minut na vodní lázeň zahřátou na 60 °C (5.4), aby se zcela rozpustila tuková fáze. Zkumavka se rychle zchladí pod tekoucí vodou. Část roztoku se zfiltruje přes membránový filtr (5.5). Chromatografie filtrátu se provede tentýž den.

• 6.1.2 Příprava vzorku s vnitřním standardem

Do skleněné zkumavky (5.3) se s přesností na 3 desetinná místa naváží 1 ±0,1 g vzorku. Přidá se 0,5 ml kyseliny trihydrogenfosforečné (4.4), 0,50 ml roztoku vnitřního standardu a 9 ml ethanolu (4.1).

Zkumavka se uzavře a silně protřepe. Je-li to nezbytné, umístí se zkumavka na 5 minut na vodní lázeň zahřátou na 60 °C (5.4), aby se zcela rozpustila tuková fáze. Zkumavka se rychle zchladí pod tekoucí vodou. Část roztoku se zfiltruje přes membránový filtr (5.5). Chromatografie filtrátu se provede tentýž den.

• 6.2 Podmínky pro plynovou chromatografii

Doporučují se následující provozní podmínky

Kolona
Typ	nerezová ocel
Délka	2 m
Průměr	3 mm
Náplň	10% SP™ 1000 (nebo ekvivalentní) + 1% H3PO4 na Chromosorbu WAW 100 - 120 mesh
Teplota
---	---
Nástřik	200 °C
Kolona	120 °C
Detektor	200 °C
Nosný plyn	dusík
Průtoková rychlost	25 ml/min

• 6.3 Chromatografie

• 6.3.1 Kalibrace

Do řady odměrných baněk na 20 ml se odpipetuje 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 a 4,00 ml roztoku kyseliny propionové (4.5). Do každé odměrné baňky se odpipetuje 1,00 ml roztoku vnitřního standardu (4.6); doplní se na objem ethanolem a zamíchá. Takto připravené roztoky obsahují kyselinu 2-methylpropionovou jako vnitřní standard v koncentraci e mg/ml (to znamená 1 mg/ml, je-li e= 1,000) a kyselinu propionovou v koncentraci p/4, p/2, p, 2p, 4p mg/ml (to znamená 0,25; 0,50; 1,00; 2,00; 4,00 mg/ml, je-li p = 1,000).

Nastříkne se 1 μl těchto roztoků a kalibrační křivka se sestrojí vynesením poměru hmotností kyseliny propionové a kyseliny 2-methylpropionové na osu x a poměru odpovídajících ploch píků na osu y.

Nastříknou se 3 dávky z každého roztoku a vypočte se průměr poměrů ploch píku.

• 6.3.2 Kvantitativní stanovení

Nastříkne se 1 μl filtrátu vzorku 6.1.1. Chromatogram se porovná s chromatogramem jednoho ze standardních roztoků (6.3.1). Má-li pík přibližně stejný retenční čas jako pík kyseliny 2-methylpropionové, změní se vnitřní standard. Není-li pozorován žádný rušivý vliv, nastříkne se 1 μl filtrátu vzorku 6.1.2 a změří se plochy píku kyseliny propionové a píku vnitřního standardu.

Nastříknou se 3 dávky z každého roztoku a vypočte se průměr poměrů ploch píku.

• 1. Výpočty

• 7.1 Z kalibrační křivky sestrojené podle bodu 6.3.1 se odečte poměr hmotností (K), který odpovídá poměru ploch píků vypočtenému v bodě 6.3.2.

• 7.2 Z takto získaného poměru hmotností se vypočte obsah kyseliny propionové ve vzorku (x) v hmotnostních procentech pomocí vzorce

x%m/m=K0,5·100·e50·a=Kea

kde

K =	poměr vypočtený v bodě 7.1,
e =	hmotnost vnitřního standardu v g podle bodu 4.6,
a =	hmotnost vzorku v g podle bodu 6.1.2.

Výsledky se zaokrouhlí na jedno desetinné místo.

• 1. Opakovatelnost

Pro výrobky obsahující asi 2 % (m/m) kyseliny propionové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,12 %.

• 1. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ HYDROCHINONU, HYDROCHINON-MONOMETHYLETHERU, HYDROCHINON-MONOETHYLETHERU A HYDROCHINON- MONOBENZYLETHERU V KOSMETICKÝCH PROSTŘEDCÍCH

A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ

• 1. Rozsah a oblast použití

V metodě je popsána detekce a kvalitativní stanovení hydrochinonu, hydrochinon-monomethyletheru, hydrochinon-monoethyletheru a hydrochinon-monobenzyletheru (monobenzonu) v kosmetických prostředcích pro zesvětlení kůže.

• 1. Podstata metody

Kvalitativní stanovení hydrochinonu a jeho etherů se provede chromatografií na tenké vrstvě (TLC).

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 3.1 Ethanol, 96% (V/V)

• 3.2 Chloroform

• 3.3 Diethylether

• 3.4 Mobilní fáze:

Chloroform/diethylether, 66:33 (V/V)

• 3.5 Amoniak, 25% (m/m) (d420 = 0,91 g/ml)

• 3.6 Kyselina askorbová

• 3.7 Hydrochinon

• 3.8 Hydrochinon-monomethylether

• 3.9 Hydrochinon-monoethylether

• 3.10 Hydrochinon-monobenzylether (monobenzon)

• 3.11 Standardní roztoky

Následující standardní roztoky se připravují čerstvé a jsou stabilní jeden den.

• 3.11.1 Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 0,05 g hydrochinonu (3.7). Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). Přidává se amoniak (3.5), dokud není dosaženo pH 10, a doplní se ethanolem na objem 10 ml (3.1).

• 3.11.2 Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 0,05 g hydrochinon-monomethyletheru (3.8). Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). Přidává se amoniak (3.5), dokud není dosaženo pH 10, a doplní se ethanolem na objem 10 ml (3.1).

• 3.11.3 Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 0,05 g hydrochinon-monoethyletheru (3.9). Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). Přidává se amoniak (3.5), dokud není dosaženo pH 10, a doplní se ethanolem na objem 10 ml (3.1).

• 3.11.4 Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 0,05 g hydrochinon-monobenzyletheru (3.10). Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). Přidává se amoniak (3.5), dokud není dosaženo pH 10, a doplní se ethanolem na objem 10 ml (3.1).

• 3.12 Dusičnan stříbrný

• 3.13 Kyselina 12-molybdofosforečná

• 3.14 Kyanoželezitan draselný hexahydrát

• 3.15 Chlorid železitý hexahydrát

• 3.16 Detekční činidla

• 3.16.1 Do 5% vodného roztoku (m/V) dusičnanu stříbrného (3.12) se přidává amoniak (3.5), dokud se tvořící se sraženina opět nerozpustí.

Upozornění:

Při delším stání se v roztoku tvoří výbušné sloučeniny a měl by být po použití zlikvidován.

• 3.16.2 10% (m/V) roztok kyseliny 12-molybdofosforečné (3.13) v ethanolu (3.1).

• 3.16.3 Připraví se 1 % (m/V) vodný roztok kyanoželezitanu draselného (3.14) a 2% (m/V) vodný roztoku chloridu železitého (3.15). Těsně před použitím se smíchají stejné díly obou roztoků.

• 1. Přístroje a pomůcky

Obvyklé laboratorní vybavení, a

• 4.1 Obvyklé vybavení pro chromatografii na tenké vrstvě

• 4.2 Hotové TLC desky: silikagel GHR/UV254; 20 x 20 cm (Machery, Nagel nebo ekvivalentní). Tloušťka vrstvy 0,25 mm.

• 4.3 Ultrazvuková lázeň

• 4.4 Odstředivka

• 4.5 UV lampa, 254 nm

• 1. Postup

• 5.1 Příprava vzorku

Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 3,0 g vzorku. Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). pH roztoku se upraví amoniakem (3.5) na 10. Objem se doplní ethanolem (3.1) na 10 ml. Zkumavka se uzavře zátkou a homogenizuje se 10 minut v ultrazvukové lázni. Zfiltruje se přes filtrační papír nebo se odstředí při 3 000 ot./min.

• 5.2 Chromatografie na tenké vrstvě (TLC)

• 5.2.1 Chromatografická komora se nasytí mobilní fází (3.4).

• 5.2.2 Na desku se nanese po 2 μl standardních roztoků (3.11) a 2 μl roztoku vzorku (5.1). Vyvíjí se ve tmě při teplotě okolí, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne vzdálenosti 15 cm od startu.

• 5.2.3 Deska se vyjme, nechá se vyschnout při laboratorní teplotě.

• 5.3 Detekce

• 5.3.1 Deska se pozoruje pod UV světem při 254 nm a poloha skvrn se označí.

• 5.3.2 Deska se postříká

— dusičnanem stříbrným (3.16.1), nebo

— kyselinou 12-molybdofosforečnou (3.16.2); zahřeje se na asi 120 °C; nebo

— roztokem kyanoželezitanu draselného a roztokem chloridu železitého (3.16.3).

• 1. Kvalitativní stanovení

Spočítá se hodnota Rf každé skvrny.

Skvrny získané pro roztok vzorku se porovnají se skvrnami získanými pro standardní roztoky, pokud jde o jejich hodnoty Rf, barvu skvrn v UV světle a barvu skvrn po zviditelnění detekčním činidlem.

Provede se vysokoúčinná kapalinová chromatografie popsaná v následujícím oddílu (B) a porovnají se retenční časy získané pro pík (píky) vzorku s retenčními časy píků referenčních roztoků.

Výsledky z TLC a HPLC se zkombinují s cílem dokázat přítomnost hydrochinonu a/nebo jeho etherů.

• 1. Poznámky

Za uvedených podmínek byly pozorovány následující hodnoty Rf:

hydrochinon:	0,32
hydrochinon-monomethylether:	0,53
hydrochinon-monoethylether:	0,55
hydrochinon-monobenzylether:	0,58

B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ

• 1. Rozsah a oblast použití

V metodě je specifikován postup pro stanovení hydrochinonu, hydrochinon-monomethyletheru, hydrochinon-monoethyletheru a hydrochinon-monobenzyletheru v kosmetických prostředcích pro zesvětlení pleti.

• 1. Princip

Vzorek je extrahován směsí voda/methanol za mírného zahřátí, kterým se rozpustí tukový materiál. Kvantitativní stanovení analytů ve výsledném roztoku se provede kapalinovou chromatografií s obrácenou fází s UV detekcí.

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

• 3.1 Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší. Musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň ekvivalentní čistoty.

• 3.2 Methanol

• 3.3 Hydrochinon

• 3.4 Hydrochinon-monomethylether

• 3.5 Hydrochinon-monoethylether

• 3.6 Hydrochinon-monobenzylether (monobenzon)

• 3.7 Tetrahydrofuran, čistoty pro HPLC

• 3.8 Směs voda/methanol 1:1 (V/V). Smíchá se jeden díl vody a jeden díl methanolu (3.2).

• 3.9 Mobilní fáze: směs tetrahydrofuran/voda 45:55 (V/V). Smíchá se 45 dílů tetrahydrofuranu (3.7) a 55 dílů vody.

• 3.10 Standardní roztok

Do odměrné baňky na 50 ml se naváží 0,06 g hydrochinonu (3.3), 0,08 g hydrochinon-monomethyletheru (3.4), 0,10 g hydrochinon-monoethyletheru (3.5) a 0,12 g hydrochinon-monobenzyletheru (3.6). Rozpustí se a doplní se na objem methanolem (3.2). Standardní roztok se připraví zředěním 10,00 ml tohoto roztoku na 50,00 ml směsí voda/methanol (3.8). Tyto roztoky se připravují čerstvé.

• 1. Přístroje a pomůcky

Obvyklé laboratorní vybavení

• 4.1 Vodní lázeň nastavitelná na teplotu 60 °C

• 4.2 Chromatograf pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s UV detektorem s nastavitelnou vlnovou délkou a 10μl nastřikovací smyčkou

• 4.3 Analytická kolona:

Chromatografická kolona z nerezové oceli, délka 250 mm, vnitřní průměr 4,6 mm, plněná Zorbax fenylem (chemicky vázaným fenethylsilanem na Zorbaxu SIL, uzavřená trimethylchlorsilanem), velikost částic 6 μm, nebo ekvivalentní náplní. Nepoužívá se ochranná kolona, s výjimkou fenylové kolony nebo kolony s ekvivalentní náplní.

• 4.4 Filtrační papír, průměr 90 mm, Schleicher and Schüll, Weissband No 5892 nebo ekvivalentní

• 1. Postup

• 5.1 Příprava vzorku

Do odměrné baňky na 50 ml se s přesností na tři desetinná místa naváží 1 ± 0,1 g (a gramů) vzorku. Vzorek se rozptýlí ve 25 ml směsi voda/methanol (3.8). Baňka se uzavře a silně se protřepe, dokud se nevytvoří homogenní suspenze. Protřepává se alespoň 1 minutu. Baňka se umístí do vodní lázně (4.1) nastavené na 60 °C, aby se usnadnila extrakce. Baňka se ochladí a doplní se na objem směsí voda/methanol (3.8). Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír (4.4). Kvalitativní stanovení HPLC se provede do 24 hodin od přípravy extraktu.

• 5.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

• 5.2.1 Průtoková rychlost mobilní fáze (3.9) se upraví na 1,0 ml/min a vlnová délka detektoru se nastaví na 295 nm.

• 5.2.2 Nastříkne se 10 μl roztoku vzorku získaného podle bodu 5.1 a zaznamená se chromatogram. Změří se plochy píků. Provede se kalibrace podle bodu 5.2.3. Porovnají se chromatogramy získané pro vzorek a standardní roztoky. Pro výpočet koncentrace analytu v roztoku vzorku se použijí plochy píků a faktory odezvy (RF) vypočtené podle 5.2.3.

• 5.2.3 Kalibrace

Nastříkne se 10 μl standardního roztoku (3.10) a zaznamená se chromatogram. Nástřik se provede několikrát, dokud není plocha píku konstantní.

Stanoví se faktor odezvy RFi:

RFi = Pici

kde

pi =	plocha píku pro hydrochinon, hydrochinon-monomethylether, hydrochinon- monoethylether nebo hydrochinon- monobenzylether
ci =	koncentrace hydrochinonu, hydrochinon-monomethyletheru, hydrochinon- monoethyletheru nebo hydrochinon-monobenzyletheru v standardním roztoku (3.10) (g/50 ml).

Je třeba ověřit, zda chromatogramy získané pro standardní roztok a roztok vzorku splňují následující požadavky:

— rozlišení píků nejhůře odděleného páru je alespoň 0,90. (Definice rozlišení píků je uvedena na obrázku 14);

[image omitted]

Obrázek 14: Rozlišení píků

Není-li požadovaného rozlišení dosaženo, měla by být buď použita účinnější kolona nebo by mělo být složení mobilní fáze upraveno tak, aby byl požadavek splněn;

— faktor asymetrie As všech získaných píků by se měl pohybovat od 0,9 do 1,5. (Definice faktoru asymetrie je uvedena na obrázku 15) Při zaznamenání chromatogramu za účelem stanovení faktoru asymetrie je doporučená rychlost zaznamenávání 2 cm/min.

[image omitted]

Obrázek 15: Faktor asymetrie píku

— Základna musí být stabilní.

• 1. Výpočet

Pro výpočet koncentrace analytu (koncentrací analytů) ve vzorku se použijí plochy píků analytů. Koncentrace analytu ve vzorku vyjádřená v hmotnostních procentech (xi) se vypočte pomocí vzorce

xi % m/m = bi·100RFi·a

kde

a =	hmotnost vzorku v g,
bi =	plocha píku analytu i ve vzorku.

• 1. Opakovatelnost

• 7.1 Pro výrobky obsahující asi 2 % (m/m) hydrochinonu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,13 %.

• 7.2 Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) hydrochinon-monomethyletheru nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,1%.

• 7.3 Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) hydrochinon-monoethyletheru nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,11%.

• 7.4 Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) hydrochinon-monobenzyletheru nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,11%.

• 1. Reprodukovatelnost

• 8.1 Pro výrobky obsahující asi 2 % (m/m) hydrochinonu nesmí absolutní hodnota rozdílu mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku provedených stejnou metodou za různých podmínek (různé laboratoře, různí experimentátoři, různé přístroje a/nebo různá doba), překročit absolutní hodnotu 0,37 %.

• 8.2 Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) hydrochinon-monomethyletheru nesmí absolutní hodnota rozdílu mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku, provedených stejnou metodou za různých podmínek (různé laboratoře, různí experimentátoři, různé přístroje a/nebo různá doba), překročit absolutní hodnotu 0,21 %.

• 8.3 Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) hydrochinon-monoethyletheru nesmí absolutní hodnota rozdílu mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku, za různých podmínek (různé laboratoře, různí experimentátoři, různé přístroje a/nebo různá doba), překročit absolutní hodnotu 0,19%.

• 8.4 Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) hydrochinon-monobenzyletheru nesmí absolutní hodnota rozdílu mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku, provedených stejnou metodou za různých podmínek (různé laboratoře, různí experimentátoři, různé přístroje a/nebo různá doba), překročit absolutní hodnotu 0,11%.

• 1. Poznámky

• 9.1 Je-li zjištěn obsah hydrochinonu výrazně vyšší než 2 % a je požadován přesný odhad obsahu, měl by se extrakt vzorku (5.1) zředit na podobnou koncentraci, kterou by měl vzorek obsahující 2 % hydrochinonu, a stanovení se opakuje.

(U některých přístrojů může při vysokých koncentracích hydrochinonu ležet hodnota absorbance mimo lineární rozsah detektoru.)

• 9.2 Rušivé vlivy

Výše popsaná metoda umožňuje stanovení hydrochinonu a jeho etherů v jednom izokratickém průběhu. Použití fenylové kolony zajistí dostatečnou retenci hydrochinonu, kterou nelze zajistit při použití kolony C18 s uvedenou mobilní fází.

U této metody však snadno dochází k rušivému vlivu celé řady parabenů. V takovém případě by stanovení mělo být zopakováno s jiným systémem mobilní fáze/stacionární fáze. Vhodné metody lze najít v odkazech:

„Magnesium as modifier for the determination of baryum by flame atomic emission spectrometry“. Jerrow M. et al., Analytical proceedings, 1991, 28, 40.

M. Herpol-Borremans et. M.-O. Masse, Identification et dosage de l'hydro-quinone et de ses éthers méthylique et benzylique dans les produits cosmétiques pour blanchir la peau. Int. J. Cosmet. Sci. 8-203-214 (1986).

Kolona:Zorbax ODS, 4,6 mm x 25 mm nebo ekvivalentní:

teplota: 36 °C

průtok: 1,5 ml/min

mobilní fáze:

pro hydrochinon: methanol/voda 5/95 (V/V)

pro hydrochinon-monomethylether: methanol/voda 30/70 (V/V)

pro hydrochinon-monobenzylether: methanol/voda 80/20(V/V).

Kolona: Spherisorb S5-ODS nebo ekvivalentní:

mobilní fáze: voda/methanol 90/10 (V/V)

průtok: 1,5 ml/min

Tyto podmínky jsou vhodné pro hydrochinon (J. Firth and I. Rix, Determination of hydroquinone in skin toning creams, Analyst (1986), 111, p. 129).

• 1. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ 2-FENOXYETHANOLU, 1-FENOXYPROPAN-2-OLU, METHYL-, ETHYL-, PROPYL-, BUTYL- A BENZYL-4-HYDROXYBENZOÁTU V KOSMETICKÝCH PROSTŘEDCÍCH

A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ

• 1. Rozsah a oblast použití

V této metodě je specifikován postup chromatografie na tenké vrstvě, který v kombinaci s metodou kvantitativního stanovení, popsanou v oddílu B, umožní identifikaci 2-fenoxyethanolu, 1-fenoxypropan-2-olu, methyl-4-hydroxybenzoátu, ethyl-4-hydroxybenzoátu, propyl-4-hydroxybenzoátu, butyl-4-hydroxybenzoátu a benzyl-4-hydroxybenzoátu v kosmetických prostředcích.

• 1. Princip

Konzervační přísady se extrahují z okyselených vzorků kosmetických prostředků acetonem. Po filtraci se acetonový roztok smíchá s vodou a mastné kyseliny se v alkalickém prostředí vysrážejí jako vápenaté soli. Alkalická směs aceton/voda je extrahována diethyletherem, čímž se odstraní lipofilní látky. Po okyselení se konzervační přísady extrahují diethyletherem. Alikvotní část diethyletherového extraktu se nanese na desku pokrytou tenkou vrstvou silikagelu. Po vyvíjení se získaný chromatogram pozoruje v UV světle a zviditelní se za použití Millonova činidla.

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

• 3.1 Všeobecně

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší Musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň stejné čistoty.

• 3.2 Aceton

• 3.3 Diethylether

• 3.4 n-Pentan

• 3.5 Methanol

• 3.6 Kyselina octová, ledová

• 3.7 Roztok kyseliny chlorovodíkové, 4 mol/l

• 3.8 Roztok hydroxidu draselného, 4 mol/l

• 3.9 Chlorid vápenatý dihydrát (CaCl2·2H2O)

• 3.10 Detekční činidlo: Millonovo činidlo

Millonovo činidlo (dusičnan rtuťnatý) je komerčně dostupný roztok (Fluka 69820).

• 3.11 2-Fenoxyethanol

• 3.12 1-Fenoxy-propan-2-ol

• 3.13 Methyl-4-hydroxybenzoát (methylparaben)

• 3.14 Ethyl-4-hydroxybenzoát (ethylparaben)

• 3.15 n-Propyl-4-hydroxybenzoát (propylparaben)

• 3.16 n-Butyl-4-hydroxybenzoát (butylparaben)

• 3.17 Benzyl-4-hydroxybenzoát (benzylparaben)

• 3.18 Standardní roztoky

Připraví se 0,1% (m/V) roztoky každé z referenčních látek 3.11, 3.12, 3.13, 3.14, 3.15, 3.16 a 3.17 v methanolu.

• 3.19 Mobilní fáze

Smíchá se 88 dílů n-pentanu (3.4) s 12 díly ledové kyseliny octové (3.6).

• 4 Přístroje a pomůcky

Běžné laboratorní vybavení a

• 4.1 Vodní lázeň nastavitelná na teplotu 60 °C

• 4.2 Vyvíjecí komora (nevyložená filtračním papírem)

• 4.3 Zdroj ultrafialového světla, 254 nm

• 4.4 Hotové desky 20 cm x 20 cm se sorbční vrstvou: silikagel 60F254 (fluorescenční indikátor), tloušťka vrstvy: 0,25 mm, s koncentrační zónou 25 x 200 mm (Merck No 11798, Darmstadt, nebo ekvivalentní)

• 4.5 Sušárna nastavitelná na teplotu až do 105 °C

• 4.6 Horkovzdušný fén

• 4.7 Vlněný malířský váleček o délce přibližně 10 cm, vnější průměr přibližně 3,5 cm. Vlněná vrstva by měla být 2 až 3 mm silná. Podle potřeby se vlna zastřihne.

Viz poznámka v bodě 5.2.

• 4.8 Erlenmeyerovy baňky na 50 a 200 ml, se zábrusovou zátkou

• 4.9 Elektrická topná deska s termostatem. Nastavení teploty: asi 80 °C. Topná deska se pokryje hliníkovou deskou o velikosti 20 cm x 20 cm a tloušťce asi 6 mm, čímž se dosáhne rovnoměrného rozložení tepla.

• 1. Postup

• 5.1 Příprava vzorku

Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se zábrusovou zátkou (4.8.) se odváží přibližně 1 g vzorku. Přidají se čtyři kapky roztoku kyseliny chlorovodíkové (3.7) a 40 ml acetonu.

V případě silně zásaditých kosmetických přípravků, jako je toaletní mýdlo, se přidá 20 kapek roztoku kyseliny chlorovodíkové. Baňka se uzavře, směs se zlehka zahřeje na asi 60 °C, aby se usnadnila extrakce konzervačních látek do acetonové fáze, a 1 minutu se silně třepe.

Indikátorovým papírkem se změří pH roztoku a upraví se na hodnotu ≤3 roztokem kyseliny chlorovodíkové. Znovu se 1 minutu silně třepe.

Roztok se ochladí na laboratorní teplotu a zfiltruje se přes filtrační papír do Erlenmeyerovy baňky. 20 ml filtrátu se převede do Erlenmeyerovy baňky na 200 ml, přidá se 60 ml vody a promíchá. Hodnota pH směsi se upraví hydroxidem draselným (3.8.) přibližně na 10 za použití indikátorového papírku.

Přidá se 1 g chloridu vápenatého dihydrátu (3.9) a silně se protřepe.

Roztok se zfiltruje přes filtrační papír do dělicí nálevky na 250 ml, která obsahuje 75 ml diethyletheru, a silně se 1 minutu protřepává. Fáze se nechají oddělit a vodná fáze se vypustí do Erlenmeyerovy baňky na 200 ml. Hodnota pH roztoku se upraví roztokem kyseliny chlorovodíkové na přibližně 2 za použití indikátorového papírku. Poté se přidá 10 ml diethyletheru a silně se 1 minutu protřepává. Fáze se nechají oddělit a asi 2 ml fáze diethyletheru se převede do vzorkovací lahvičky na 5 ml.

• 5.2 Chromatografie na tenké vrstvě (TLC)

TLC deska se umístí na zahřátou hliníkovou desku (4.9.) Na startovní linii koncentrační zóny TLC desky se nanese 10 μl každého z referenčních roztoků a 100 μl roztoku vzorku (vzorků) (5.1).