Verordnung der Bundesministerin für Frauenangelegenheiten und Verbraucherschutz über Kondensmilch- und Milchpulverarten (CELEX-Nr.: 376L0118, 378L0630, 383L0635, 379L1067, 387L0524)

4.1. Zinkacetatlösung, 1 M: 21,9 g kristallisiertes Zinkacetat

(Zn(C2H3O2)2.2 H2O und 3 ml Eisessig auf 100 ml mit Wasser

auffüllen.

4.2. Kaliumhexacyanoferrat(II)lösung, 0,25 M: 10,6 g

kristallisiertes Kaliumhexacyanoferrat(II)

K4(Fe(CN)6).3 H2O auf 100 ml mit Wasser auffüllen.

4.3. Salzsäurelösung, 6,35 +- 0,20 M (20 bis 22%) oder 5,0 +-

0,2 M (16 bis 18%)

4.4. Ammoniaklösung, 2,0 +- 0,2 M (3,5%)

4.5. Essigsäurelösung, 2,0 +- 0,2 M (12%)

4.6. Bromothymolblau-Indikator, 1%ige Lösung (m/v) in Äthanol

5.1. Waage, Empfindlichkeit 10 mg

5.2. Polarimeter-Rohr, 2 dm, mit genau kalibrierter Länge

5.3. Polarimeter oder Saccharimeter:

```

```

Quecksilberlicht (Quecksilberdampflampe mit Prisma oder

dem speziellen Wratten-Filter Nr. 77A), das mit einer

Genauigkeit von mindestens 0,05 Winkelgraden abgelesen

werden kann;

```

```

Verwendung von weißem, durch ein 15 mm dickes Filter

einer 6%igen Kaliumdichromatlösung geleiteten Licht

oder Natriumlicht mit einer Ablesegenauigkeit von

mindestens 0,1 Grad auf der internationalen

Zuckerskala.

5.4. Wasserbad, eingestellt auf 60 +- 1 Grad C

6.1. Kontrollbestimmung

Zur Überprüfung der Methode, der Reagenzien und der Geräte

nach der nachstehenden Methode eine

Doppelkontrollbestimmung durchführen, unter Verwendung

eines Gemisches von 100 g Milch oder 110 g Magermilch und

18,00 g reiner Saccharose; diese Mischung entspricht

40,00 g kondensierter Milch mit einem Saccharosegehalt von

45%. Den Zuckergehalt anhand der Formel unter 7 berechnen,

wobei in der Formel 1 für M, F und P die gewogene

Milchmenge, der Fettgehalt und der Eiweißgehalt dieser

Milch, und in der Formel 2 für M die Zahl 40,00 eingesetzt

werden. Der Mittelwert der festgestellten Werte sollte

nicht um mehr als 0,2% von den tatsächlichen 45,0%

abweichen.

6.2. Bestimmung

6.2.1. Etwa 40 g der gut durchgemischten Probe mit einer

Genauigkeit von 10 mg in ein 100 ml fassendes Becherglas

einwiegen. 50 ml heißes Wasser (80 bis 90 Grad C)

hinzufügen und gut mischen.

6.2.2. Die Mischung quantitativ in einen 200-ml-Meßkolben

überführen und das Becherglas mehrmals mit kleinen Mengen

destillierten Wassers von 60 Grad C bis zu einem

Gesamtvolumen von 120 bis 150 ml nachspülen. Mischen und

auf Zimmertemperatur abkühlen.

6.2.3. 5 ml der verdünnten Ammoniaklösung (4.4) hinzufügen.

Erneut mischen und dann 15 Minuten stehen lassen.

6.2.4. Den Ammoniak durch Zugabe einer äquivalenten Menge

verdünnter Essigsäurelösung (4.5) neutralisieren. Vorher

die genaue Zahl von Milliliter durch Titration der

Ammoniaklösung mit Bromthymolblau als Indikator (4.6)

bestimmen. Mischen.

6.2.5. 12,5 ml Zinkacetatlösung (4.1) unter vorsichtigem

Vermischen durch kreisende Bewegung des geneigten Kolbens

hinzufügen.

6.2.6. In gleicher Weise wie bei der Acetatlösung 12,5 ml

Kaliumhexacyanoferratlösung(II) (4.2) hinzufügen.

6.2.7. Den Inhalt des Kolbens auf 20 Grad C bringen und Wasser

(von 20 Grad C) bis zur 200-ml-Marke hinzufügen.

Anmerkung:

Bis zu diesem Stadium sollten alle Zusätze von Wasser oder

Reagenzien in einer solchen Weise erfolgen, daß die

Bildung von Luftblasen vermieden wird, und mit dem

gleichen Ziel sollte jedes Mischen durch kreisende

Bewegung des Kolbens und nicht durch Schütteln erfolgen.

Luftblasen, die vor der vollständigen Verdünnung auf

200 ml festgestellt werden, können durch vorübergehenden

Anschluß des Kolbens an eine Vakuumpumpe und kreisende

Bewegung des Kolbens beseitigt werden.

6.2.8. Den Kolben mit einem trockenen Stopfen verschließen und

durch kräftiges Schütteln gründlich mischen.

6.2.9. Einige Minuten stehen lassen und dann durch ein trockenes

Filterpapier filtrieren und die ersten 25 ml Filtrat

verwerfen.

6.2.10. Direkte Polarisation: die optische Drehung des Filtrats

bei +- 1 Grad C bestimmen.

6.2.11. Inversion: 40 ml des wie oben erhaltenen Fitrats in einen

50-ml-Meßkolben pipettieren. 6,0 ml 6,35 M oder 7,5 ml

5,0 M Salzsäure (4.3) hinzugeben.

Den Kolben für 15 Minuten in ein Wasserbad von 60 Grad C

stellen, wobei der Kolben bis zum Hals eingetaucht wird.

Durch kreisende Bewegung während der ersten 5 Minuten

mischen; in dieser Zeit sollte der Inhalt des Kolbens die

Temperatur des Bades erreicht haben. Auf 20 Grad C

abkühlen und bis zur 50-ml-Marke mit Wasser von 20 Grad C

auffüllen. Mischen und bei dieser Temperatur eine Stunde

stehen lassen.

6.2.12. Polarisation nach Inversion

Die Drehung der invertierten Lösung bei 20 +- 0,2 Grad C

bestimmen. (Wenn die Temperatur T der Flüssigkeit im

Polarisationsrohr jedoch während der Messung um mehr als

0,2 Grad von 20 Grad C abweicht, muß die unter Ziffer 7.2

angegebene Temperaturkorrektur angewandt werden.)

```

```

7.1. Berechnung

Berechnen des Saccharosegehalts mit folgenden Formeln:

M

1 v = ---(1,08F+1,55P)

100

D-1,25 I V-v V

2 S = --------x---x---%

Q V LxM

S = Saccharosegehalt,

M = Masse der eingewogenen Probe in Gramm,

F = Fettgehalt in der Probe in %,

P = Eiweißgehalt (N x 6,38) in der Probe in %,

V = Volumen in ml, auf das die Probe vor dem Filtrieren

verdünnt wurde,

v = Korrektur in ml für das Volumen des durch die Fällung

gebildeten Niederschlags,

D = direkte Polarimeter-Ablesung (Polarisation vor der

Inversion),

I = Polarimeter-Ablesung nach der Inversion,

L = Länge in dm des Polarimeterrohrs,

Q = Inversionsfaktor, dessen Werte unten angegeben werden.

Anmerkungen:

```

```

Polarimeter mit Natriumlicht, Winkelgraden und einem

Polarimeterrohr von 2 dm Länge bei 20 +- 0,1 Grad C

verwendet werden, kann der Saccharosegehalt normaler

Kondensmilch (C = 9) mit der folgenden Formel berechnet

werden:

S = (D - 1,25 I) x (2,833 - 0,00612 F - 0,00878 P).

```

```

20 Grad C abweichenden Temperatur (T) gemessen wird,

müssen die Werte multipliziert werden mit:

(1 + 0,0037 (T - 20))

7.2. Werte für den Inversionsfaktor Q

Die folgenden Formeln ergeben genaue Werte für Q bei

verschiedenen Lichtquellen, mit Korrekturen für

Konzentration und Temperatur:

Natriumlicht und Polarimeter mit Winkelgraden:

Q = 0,8825 + 0,0006 (C - 9) - 0,0033 (T - 20);

grünes Quecksilberlicht und Polarimeter mit Winkelgraden:

Q = 1,0392 + 0,0007 (C - 9) - 0,0039 (T - 20);

weißes Licht mit Dichromatfilter und Saccharimeter mit

internationalen Zuckerskalagraden:

Q = 2,549 + 0,0017 (C - 9) - 0,0095 (T - 20).

In den obigen Formeln sind:

C = Gesamtgehalt an Zucker in der invertierten Lösung

entsprechend der polarimetrischen Messung in Prozent,

T = Temperatur der invertierten Lösung bei der

polarimetrischen Messung.

Anmerkung 1:

Der Gehalt an Gesamtzucker in % (C) in der invertierten

Lösung kann aus der direkten Ablesung und der Änderung

nach der Inversion in der üblichen Weise unter Verwendung

der normalen Werte für das spezifische Drehungsvermögen

von Saccharose, Lactose und Invertzucker berechnet werden.

Die Korrektur 0,0006 (C - 9) usw. ist nur dann genau, wenn

C etwa = 9 ist; bei normaler Kondensmilch kann auf diese

Korrektur verzichtet werden, da C nahe bei 9 liegt.

Anmerkung 2:

Eine Temperaturabweichung von 1 Grad C gegenüber der

Meßtemperatur von 20 Grad C macht bei der direkten

Ablesung wenig aus, jedoch Abweichungen von mehr als

0,2 Grad C bei der Ablesung nach der Inversion erfordern

eine Korrektur. Die Korrektur -0,0033 (T - 20) usw. ist

nur zwischen 18 Grad C und 22 Grad C genau.

7.3. Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen von

Doppelbestimmungen, die gleichzeitig oder unmittelbar

nacheinander von demselben Untersucher mit der gleichen

Probe und unter denselben Bedingungen durchgeführt worden

sind, darf 0,3 g Saccharose/100 g Kondensmilch nicht

überschreiten.

METHODE 6: BESTIMMUNG DES MILCHSÄURE- UND LACTATGEHALTS

```

```

Nach dieser Methode wird bestimmt der Milchsäure- und

Lactatgehalt von:

- Milchpulver mit hohem Fettgehalt,

- Milchpulver (Vollmilchpulver),

- teilentrahmtem Milchpulver,

- Magermilchpulver.

```

```

Milchsäure- und Lactatgehalt von getrockneter Milch: der

nach dieser Methode bestimmte Milchsäure- und

Lactatgehalt, berechnet als Milchsäure.

```

```

Fett, Protein und Lactose werden gleichzeitig durch Zusatz

von Kupfersulfat und Calciumhydroxid und anschließende

Filtration entfernt.

Die Milchsäure im Filtrat wird durch konzentrierte

Schwefelsäure in Gegenwart von Kupfersulfat in Acetaldehyd

umgewandelt.

Der entstandene Acetaldehyd wird kolorimetrisch unter

Verwendung von 4-Hydroxydiphenyl bestimmt.

Der Milchsäure- und Lactatgehalt wird in mg Milchsäure pro

100 g fettfreier Trockenmasse ausgedrückt.

```

```

4.1. Kupfer(II)sulfatlösung: 250 g Kupfer(II)sulfat (CuSo4.5

H2O) in Wasser auflösen und auf 1 000 ml verdünnen.

4.2. Calciumhydroxid-Suspension:

4.2.1. 300 g Calciumhydroxid (Ca(OH)2) in einem Mörser mit Wasser

unter Verwendung von insgesamt 900 ml mahlen. Die

Suspension ist vor Gebrauch frisch herzustellen.

4.2.2. Alternativ: 300 g Calciumhydroxid (Ca(OH)2) in einem

Mörser mit Wasser unter Verwendung von insgesamt 1 400 ml

mahlen. Die Suspension ist vor Gebrauch frisch

herzustellen.

4.3. Schwefelsäure-Kupfer(II)sulfatlösung: Zu 300 ml

Schwefelsäure (95,5 bis 97,0% (m/m) H2SO4) 0,5 ml der

Kupfer(II)sulfatlösung (4.1) hinzufügen.

4.4. Lösung von 4-Hydroxydiphenyl (C6H5C6H4OH): Durch Schütteln

und leichtes Erhitzen 0,75 g 4-Hydroxydiphenyl in 5 ml

einer wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid auflösen, die

5 g NaOH pro 100 ml enthält. Mit Wasser auf 50 ml in einem

Meßkolben verdünnen. Die Lösung an einem dunklen und

kühlen Ort in einer braunen Glasflasche aufbewahren. Nicht

verwenden, falls Farbänderungen oder Trübungen auftreten.

Die maximale Lagerfähigkeit beträgt 72 Stunden.

4.5. Milchsäure-Standardlösung: Kurz vor der Verwendung

0,1067 g Lithiumlactat (CH3CHOHCOOLi) in Wasser auflösen

und in einem Meßkolben auf 1 000 ml verdünnen. 1 ml dieser

Lösung entspricht 0,1 mg Milchsäure.

4.6. Rekonstituierte Standardmilch: Mehrere Proben Trockenmilch

von hoher Qualität werden im Vorwege analysiert. Zur

Aufstellung der Eichkurve die Probe auswählen, die den

geringsten Milchsäuregehalt hat und die nicht mehr als

30 mg Milchsäure pro 100 g fettfreier Trockenmasse

enthält. Die Arbeitsschritte gemäß 6.2.1 und 6.2.2

einhalten.

```

```

5.1. Analysenwaage

5.2. Spektralphotometer, geeignet für Ablesungen bei einer

Wellenlänge von 570 nm.

5.3. Wasserbad bei 30 +- 2 Grad C

5.4. Mörser und Pistill

5.5. Filterpapier (Schleicher und Schüll 595, Whatman 1 oder

äquivalent)

5.6. Reagenzgläser aus Pyrex oder äquivalent (Abmessungen

25 x 150 mm)

Anmerkung:

Alle Glasgefäße müssen vollkommen rein und nur für die

Verwendung zu dieser Bestimmung vorgesehen sein.

Glasgefäße, die Niederschläge enthalten, mit

konzentrierter Salzsäure spülen und dann auswaschen.

```

```

6.1. Blindversuch

Eine Blindprobe durchführen, indem 30 ml Wasser in einen

50-ml-Meßkolben gegeben werden und wie unter 6.2.4 bis

einschließlich 6.2.11 beschrieben weiter verfahren wird.

Wenn die Ergebnisse des Blindversuchs, gegen Wasser

gemessen, das Äquivalent von 20 mg Milchsäure pro 100 g

fettfreier Trockenmasse überschreiten, sollten die

Reagenzien geprüft werden und die unreinen Reagenzien bzw.

das unreine Reagenz ersetzt werden. Den Blindversuch

gleichzeitig mit der Untersuchung der Probe durchführen.

6.2. Bestimmung

Anmerkung: Verunreinigungen insbesondere mit Speichel und

Schweiß vermeiden.

6.2.1. Der Gehalt an fettfreier Trockenmasse (a) der Probe wird

durch Abzug des Fettgehalts (erhalten nach Methode 4) und

des Wassergehalts (erhalten nach Methode 2) von 100

errechnet.

1 000

6.2.2. ------ g der Probe auf 0,1 g genau abwiegen. Zu dieser

a - 10

Probemenge 100 ml Wasser geben, gründlich mischen.

6.2.3. 5 ml der erhaltenen Lösung in einen 50-ml-Meßkolben

pipettieren und mit Wasser auf etwa 30 ml verdünnen.

6.2.4. Unter Umschwenken langsam 5 ml der Kupfersulfatlösung

(4.1) hinzufügen und zehn Minuten stehen lassen.

6.2.5. Unter Umschwenken langsam 5 ml der

Calciumhydroxidsuspension 4.2.1 oder 10 ml der

Calciumhydroxidsuspension 4.2.2 hinzufügen.

6.2.6. Auf 50 ml mit Wasser verdünnen, kräftig schütteln, zehn

Minuten stehen lassen, dann filtrieren. Die ersten

Filtratanteile verwerfen.

6.2.7. 1 ml des Filtrats in ein Reagenzglas (5.6) pipettieren.

6.2.8. Mit einer Bürette oder einer graduierten Pipette 6,0 ml

der Schwefelsäure-Kupfersulfatlösung (4.3) in das

Reagenzglas geben. Mischen.

6.2.9. Das Reagenzglas fünf Minuten lang in kochendem Wasserbad

erhitzen. Unter fließendem Wasser auf Raumtemperatur

abkühlen.

6.2.10. 2 Tropfen 4-Hydroxydiphenyl-Reagenz (4.4) hinzufügen und

kräftig schütteln, um das Reagenz gleichmäßig in der

ganzen Flüssigkeit zu verteilen. Das Reagenzglas in das

Wasserbad von 30 +- 2 Grad C bringen; es dort 15 Minuten

belassen, von Zeit zu Zeit schütteln.

6.2.11. Das Reagenzglas 90 Sekunden in das kochende Wasserbad

einsetzen. Unter fließendem Wasser auf Raumtemperatur

abkühlen.

6.2.12. Die optische Dichte gegen den Blindversuch (6. 1)

innerhalb von drei Stunden bei der unter 5.2 angegebenen

Wellenlänge messen.

6.2.13. Falls die optische Dichte diejenige des höchsten Punktes

der Eichkurve überschreitet, die Untersuchung unter

Verwendung einer geeigneten Verdünnung des unter 6.2.6

erhaltenen Filtrats wiederholen.

6.3. Erstellung der Eichkurve

6.3.1. 5 ml der rekonstituierten Milch (4.6) in fünf

50-ml-Meßkolben pipettieren. In diese Kolben 0, 1, 2, 3

bzw. 4 ml der Eichlösung (4.5) pipettieren, um so

Eichlösungen zu erhalten, die 0, 20, 40, 60 und 80 mg

zugesetzter Milchsäure pro 100 g fettfreier Trockenmasse

des Milchpulvers entsprechen.

6.3.2. Mit Wasser auf etwa 30 ml verdünnen und wie unter 6.2.4

bis einschließlich 6.2.11 beschrieben behandeln.

6.3.3. Die optischen Dichten der Standards (6.3.1) gegen den

Blindversuch (6.1) bei der unter 5.2 angegebenen

Wellenlänge messen. In ein Diagramm die optischen Dichten

gegen die Mengen an Milchsäure eintragen, die in 6.3.1

angegeben sind, also 0 mg, 20 mg, 40 mg, 60 mg und 80 mg

pro 100 g fettfreier Trockenmasse. Eine diesen Punkten am

besten entsprechende Gerade zeichnen und die Eichkurve

anfertigen, indem diese Gerade parallel zu sich selbst

verschoben wird, so daß sie durch den Nullpunkt der

Koordinaten geht.

```

```

7.1. Berechnung

Die optische Dichte, die unter 6.2.12 oder 6.2.13 gemessen

wurde, in mg Milchsäure pro 100 g fettfreie Trockenmasse

in der Probe entsprechend der Eichkurve verwandeln. Dieses

Ergebnis mit dem Verdünnungsfaktor multiplizieren, falls

das Filtrat gemäß 6.2.13 verdünnt worden ist.

7.2. Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen von

Doppelbestimmungen, die gleichzeitig oder unmittelbar

nacheinander von demselben Untersucher mit der gleichen

Probe und unter denselben Bedingungen durchgeführt worden

sind, darf 8 mg Milchsäure pro 100 g fettfreie

Trockenmasse für Gehalte bis 80 mg nicht überschreiten.

Bei höheren Werten darf diese Differenz 10%, bezogen auf

den niedrigsten Wert, nicht überschreiten.

METHODE 7: BESTIMMUNG DER PHOSPHATASEAKTIVITÄT

(MODIFIZIERTES SANDERS- UND SAGAR-VERFAHREN)

```

```

Diese Methode beschreibt die Bestimmung der

Phosphataseaktivität in

- Milchpulver mit hohem Fettgehalt,

- Milchpulver (Vollmilchpulver),

- teilentrahmtem Milchpulver,

- Magermilchpulver.

```

```

Die Phosphataseaktivität ist ein Maß für die vorhandene

Menge an aktiver alkalischer Phosphatase. Sie wird in myg

Phenol, die nach der hier beschriebenen Methode von 1 ml

der rekonstituierten Milch freigesetzt werden, bestimmt.

```

```

Die Phosphataseaktivität von Trockenmilch wird durch die

Fähigkeit der Phosphatase, Phenol aus

Dinatriumphenylphosphat freizusetzen, bestimmt. Die Menge

an Phenol, die unter den beschriebenen Bedingungen

freigesetzt wird, wird durch spektrophotometrische Messung

der mit dem Gibb'schen Reagenz entwickelten Farbe

bestimmt.

```

```

4.1. Lösung A

Bariumborat-hydroxid-Puffer: pH 10,6 +- 0,1 bei 20 Grad C.

25,0 g Bariumhydroxid (Ba(OH)2.8 H2O) werden in Wasser

gelöst und auf 500 ml verdünnt.

11,0 g Borsäure (H3BO3) werden in Wasser gelöst und auf

500 ml verdünnt.

Beide Lösungen auf 50 Grad C erwärmen und mischen.

Die Mischung schütteln und auf Raumtemperatur abkühlen.

Den pH-Wert mit Bariumhydroxidlösung auf 10,6 +- 0,1

einstellen und filtrieren.

Die Lösung in einem dicht verschlossenen Behälter

aufbewahren.

Den Puffer vor der Verwendung mit der gleichen Menge

Wasser verdünnen.

4.2. Lösung B

Farbentwicklungspuffer

6,0 g Natriummetaborat (NaBO2) (oder 12,5 g NaBO2.4 H2O)

und 20,0 g Natriumchlorid (NaCl) in Wasser auflösen und

auf 1 000 ml verdünnen.

4.3. Lösung C

Substrat-Puffer-Lösung

4.3.1. 0,5 g Dinatriumphenylphosphat (Na2C6H5PO4.2 H2O) in 4,5 ml

der Lösung B (4.2) auflösen. Zwei Tropfen von Lösung E

(4.5) hinzufügen und 30 Minuten stehen lassen. Farbstoff

mit 2,5 ml Butanol (4.10) extrahieren. Falls notwendig,

Farbstoffextraktion wiederholen. Nach der Abscheidung

Butanol verwerfen. Die Lösung kann in einem Kühlschrank

mehrere Tage aufbewahrt werden. Vor der Verwendung die

Farbe nochmals entwickeln und extrahieren.

4.3.2. 1 ml dieser Lösung in einen 100-ml-Meßkolben überführen

und mit der Lösung A bis zur Marke auffüllen. Die

Pufferlösung unmittelbar vor der Verwendung vorbereiten.

4.4. Lösung D

Fällungsreagenz

3,0 g Zinksulfat (ZnSO4.7 H2O) und 0,6 g Kupfersulfat

(CuSO4.5 H2O) in Wasser auflösen und auf 100 ml auffüllen.

4.5. Lösung E

Gibb's-Reagenz

0,040 g 2,6-Dibromchinon-1,4-Chlorimid (O.C6H2Br2.NCl) in

10 ml 96%igem Äthylalkohol auflösen. Die Lösung in einer

Flasche aus dunklem Glas im Kühlschrank aufbewahren. Bei

Entfärbung das Reagenz verwerfen.

4.6. Farbverdünnungspuffer

10 ml der Lösung B (4.2) des Farbentwicklungspuffers mit

Wasser auf 100 ml verdünnen.

4.7. Kupfersulfatlösung

0,05 g Kupfersulfat (II) (CuSO4.5 H2O) in Wasser lösen und

auf 100 ml mit Wasser auffüllen.

4.8. Phenol-Standardlösung

0,200 +- 0,001 g reines Phenol in Wasser auflösen und auf

100 ml in einem Meßkolben auffüllen. Diese Lösung kann

einige Monate im Kühlschrank aufbewahrt werden. 10 ml

dieser Lösung mit Wasser auf 100 ml verdünnen. Diese

verdünnte Lösung enthält 200 myg Phenol in 1 ml und kann

zur Herstellung weiterer Verdünnungen verwendet werden.

4.9. Abgekochtes, destilliertes Wasser

4.10. n-Butanol

5.1. Analysenwaage

5.2. Wasserbad, thermostatisch eingestellt auf 37 Grad C +-

1 Grad C

5.3. Spektralphotometer, geeignet für Ablesungen bei einer

Wellenlänge von 610 nm

5.4. Filterpapier (Schleicher und Schüll 597, Whatman 42 oder

gleichwertiges Filterpapier)

5.5. Wasserbad, siedend

5.6. Aluminiumfolie

```

```

Vorsichtsmaßregeln:

```

```

```

```

vollständig sauber sein. Es wird empfohlen, diese

Gegenstände mit Wasser zu spülen und zu kochen oder sie

mit Dampf zu behandeln.

```

```

vermeiden, sie können Phenol enthalten.

```

```

Speichelspuren muß sorgfältig vermieden werden.

6.1. Vorbereitung der Probe

6.1.1. 10 g der Probe (auf 0,1 g genau gewogen) in 90 ml Wasser

auflösen. Die Temperatur bei der Auflösung des Pulvers

darf unter keinen Umständen 35 Grad C überschreiten.

6.2. Bestimmung

6.2.1. In zwei Reagenzgläser je 1 ml der rekonstituierten Milch

eingeben, die entsprechend 6.1.1 vorbereitet wurde.

6.2.2. Eines der Reagenzgläser zwei Minuten in kochendem Wasser

erhitzen. Das Reagenzglas und das Wasserbad (5.5) (zB ein

Becherglas) mit Aluminiumfolie (5.6) abdecken, um

sicherzustellen, daß das gesamte Reagenzglas erhitzt wird.

In kaltem Wasser auf Raumtemperatur abkühlen. Dieses

Reagenzglas wird für den Blindversuch verwendet. Von

diesem Punkt an die beiden Reagenzgläser in gleicher Weise

behandeln.

6.2.3. 10 ml Lösung C (4.3.2) hinzufügen. Mischen und das

Reagenzglas in das Wasserbad von 37 Grad C (5.2) stellen.

6.2.4. 60 Minuten im Wasserbad inkubieren und von Zeit zu Zeit

schütteln.

6.2.5. Die Reagenzgläser sofort in ein kochendes Wasserbad (5.5)

stellen und zwei Minuten erhitzen; in kaltem Wasser auf

Zimmertemperatur abkühlen.

6.2.6. 1 ml der Lösung D (4.4) hinzufügen, mischen und durch ein

trockenes Filterpapier filtrieren; die ersten Filtrate

verwerfen, bis eine klare Flüssigkeit erhalten wird.

6.2.7. 5 ml jedes der beiden Filtrate in Reagenzgläser eingeben,

5 ml Lösung B (4.2) und 0,1 ml Lösung E (4.5) hinzugeben.

Mischen.

6.2.8. Zur Farbentwicklung 30 Minuten bei Zimmertemperatur

geschützt vor Sonnenlicht stehen lassen.

6.2.9. Die optische Dichte der Probelösung gegen den Blindversuch

bei der unter 5.3 angegebenen Wellenlänge messen.

6.2.10. Die Bestimmung wiederholen, falls die optische Dichte der

Lösung über der der Standardprobe mit 20 myg Phenol

liegt, die gemäß 7 erhalten wurde.

Wenn dieser Wert überschritten wird, ein entsprechendes

Volumen rekonstituierter Milch (6.1.1) mit einem

entsprechenden Volumen dieser Milch, die gemäß 6.2.2

sorgfältig abgekocht wurde, um die vorhandene Phosphatase

zu inaktivieren, verdünnen.

```

```

7.1. In vier 100-ml-Meßkolben je 1, 3, 5 und 10 ml der nach 4.8

verdünnten Standardlösung eingeben und bis zur Marke mit

Wasser auffüllen; diese Verdünnungen enthalten 2, 6, 10

und 20 myg Phenol in 1 ml.

7.2. 1 ml Wasser oder 1 ml jeder Referenzlösung (7.1) in die

Reagenzgläser pipettieren, um eine Reihe von Proben zu

erhalten, die 0 (Nullwert) - 2 - 6 - 10 und 20 myg Phenol

enthalten.

7.3. Nacheinander in jedes Reagenzglas 1 ml der

Kupfersulfatlösung (4.7), 5 ml des Farbverdünnungspuffers

(4.6), 3 ml Wasser und 0,1 ml Lösung E (4.5) hinzufügen.

Mischen.

7.4. Die Reagenzgläser bei Zimmertemperatur vor Sonnenlicht

geschützt 30 Minuten stehen lassen.

7.5. Die optische Dichte der Lösungen aus den Reagenzgläsern im

Vergleich zum Nullwert bei der in 5.3 angegebenen

Wellenlänge messen.

7.6. Die Eichkurve durch Aufzeichnen der optischen Dichtewerte

gegen die Phenolmengen in myg wie bei 7.2 angegeben

aufzeichnen.

```

```

8.1. Berechnung

8.1.1. Die nach 6.2.9 erhaltenen Werte unter Benutzung der

Eichkurve in myg Phenol umrechnen.

8.1.2. Die Phosphataseaktivität, ausgedruckt als myg Phenol je ml

rekonstituierter Milch, wird nach folgender Formel

berechnet:

Phosphataseaktivität = 2,4 x P,

hierin ist P = die Phenolmenge in myg entsprechend 8.1.1.

8.1.3. Falls es nötig war, entsprechend der Angabe nach 6.2.10 zu

verdünnen, das unter 8.1.2 erhaltene Resultat mit dem

Verdünnungsfaktor multiplizieren.

8.2. Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen von

Doppelbestimmungen, die gleichzeitig oder unmittelbar

nacheinander von demselben Untersucher, mit derselben

Probe und unter denselben Bedingungen durchgeführt worden

sind, darf 2 myg freigesetztes Phenol je 1 ml

rekonstituierter Milch nicht überschreiten.

METHODE 8: BESTIMMUNG DER PHOSPHATASEAKTIVITÄT

(ASCHAFFENBURG- UND MULLEN-VERFAHREN)

```

```

Diese Methode beschreibt die Bestimmung der

Phosphataseaktivität in

- Milchpulver mit hohem Fettgehalt,

- Milchpulver (Vollmilchpulver),

- teilentrahmtem Milchpulver,

- Magermilchpulver.

```

```

Die Phosphataseaktivität von Trockenmilch ist ein Maß für

die Menge an aktiver alkalischer Phosphatase im Produkt.

Sie wird in myg p-Nitrophenol, die nach der hier

beschriebenen Methode von 1 ml der rekonstituierten Probe

freigesetzt werden, bestimmt.

```

```

Die rekonstituierte Probe wird mit einem Puffersubstrat

bei pH 10,2 verdünnt und bei einer Temperatur von

37 Grad C zwei Stunden bebrütet. Die in der Probe

vorhandene alkalische Phosphatase setzt unter diesen

Bedingungen p-Nitrophenol aus Dinatrium

(p-Nitrophenyl)-phosphat frei.

Das freigesetzte p-Nitrophenol wird durch direkten

Vergleich mit Standardfarbgläsern in einem einfachen

Komparator unter Verwendung von reflektiertem Licht

bestimmt.

```

```

4.1. Natriumcarbonat-Hydrogencarbonat-Puffer 3,5 g wasserfreies

Natriumcarbonat und 1,5 g Natrium-Hydrogencarbonat in

Wasser auflösen und in einem Meßkolben auf 1 000 ml

verdünnen.

4.2. Puffersubstrat

1,5 g Dinatrium p-Nitrophenyl-Phosphat im

Natriumcarbonat-Hydrogencarbonat-Puffer (4.1) auflösen und

in einem Meßkolben mit dem Puffer (4.1) auf 1 000 ml

auffüllen.

Diese Lösung ist einen Monat stabil, wenn sie in einem

Kühlschrank (= 4 Grad C) gelagert wird, jedoch sollte

eine Farbprüfung an solchen gelagerten Lösungen

durchgeführt werden; siehe 6, Anmerkung 3.

4.3. Fällungsreagenzien

4.3.1. Zinksulfatlösung

30,0 g Zinksulfat in Wasser auflösen und in einem

Meßkolben auf 100 ml verdünnen.

4.3.2. Kalium-Hexacyanoferrat(II)lösung

17,2 g Kalium-Hexacyanoferrat(II)-Trihydrat in Wasser

auflösen und in einem Meßkolben auf 100 ml verdünnen.

```

```

5.1. Analysenwaage

5.2. Wasserbad, thermostatisch auf 37 +- 1 Grad C eingestellt

5.3. Komparator mit einer besonderen, auf myg p-Nitrophenol je

ml Milch geeichte, Standardfarbgläser aufweisende Scheibe

und zwei Küvetten von 25 mm

```

```

Vorsichtsmaßnahmen:

```

```

mit Wasser gespült, in heißem Wasser mit einem

alkalischen Waschmittel gewaschen und anschließend in

reinem heißem Leitungswasser gespült werden.

Schließlich müssen sie vor der Verwendung mit Wasser

gespült und getrocknet werden.

Die Pipetten sind gründlich in sauberem kaltem

Leitungswasser sofort nach der Verwendung zu spülen,

anschließend muß vor der Verwendung mit Wasser gespült

und getrocknet werden.

```

```

Verwendung in heißem Leitungswasser gründlich gespült

werden, anschließend sind sie zwei Minuten in Wasser

abzukochen.

```

```

Monat stabil bleiben, wenn sie in einem Kühlschrank bei

4 Grad C oder darunter aufbewahrt wird. Etwaige

Instabilitäten zeigen sich an der Bildung einer

Gelbfärbung. Während die Probe immer gegen eine

abgekochte Kontrollprobe abgelesen wird, die die

gleiche Puffersubstratlösung enthält, wird empfohlen,

daß die Lösung nicht verwendet werden sollte, wenn sich

eine Farbablesung ergibt, die in einer 25-mm-Küvette

des Komparators, bei dem in der anderen Küvette

destilliertes Wasser verwendet wird, mehr als 10 myg

beträgt.

```

```

Speichelkontamination der Pipette vermeiden.

```

```

ausgesetzt werden.

6.1. Vorbereitung der Probe

10 g Pulver in 90 ml Wasser auflösen. Die Temperatur für

die Lösung des Pulvers darf 35 Grad C nicht überschreiten.

6.2. Bestimmung

6.2.1. 15 ml des Puffersubstrats in ein sauberes trockenes

Reagenzglas pipettieren, anschließend 2 ml der zu

testenden rekonstituierten Probe (6.1). Das Reagenzglas

verschließen, durch Stürzen mischen und in das

37 Grad C-Wasserbad stellen.

6.2.2. Gleichzeitig ein Reagenzglas mit 15 ml Puffersubstrat und

2 ml der abgekochten rekonstituierten Probe in der

gleichen Art wie die zu prüfende Probe in das Wasserbad

stellen.

6.2.3. Nach zwei Stunden beide Reagenzgläser aus dem Wasserbad

entfernen, 0,5 ml Zinksulfatlösung (4.3.1) hinzufügen, den

Stopfen wieder aufsetzen, kräftig schütteln und drei

Minuten stehen lassen. 0,5 ml

Kalium-Hexacyanoferrat(II)lösung (4.3.2) hinzugeben,

gründlich mischen, filtern und das klare Filtrat in einem

sauberen Reagenzglas auffangen.

6.2.4. Das Filtrat in eine 25-mm-Küvette einbringen und mit dem

Filtrat der abgekochten Gegenprobe im Komparator unter

Verwendung der Spezialscheibe (5.3) vergleichen.

```

```

7.1. Berechnung

Die direkte Ablesung nach 6.2.4 wird als myg p-Nitrophenol

je ml der rekonstituierten Probe ausgedrückt.

7.2. Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen von

Doppelbestimmungen, die gleichzeitig oder unmittelbar

nacheinander mit derselben Probe von demselben Untersucher

und unter denselben Bedingungen durchgeführt worden sind,

darf nicht mehr als 2 myg Nitrophenol je ml

rekonstituierter Milch betragen.