Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997), ve znění vyhlášky č. 296/1999 Sb

Typ Vyhláška

Publikace 2001-02-15

Stav Platný

Zdroj e-Sbírka

článků Not indexed

Porovnávací roztok. Sacharosa R se suší 3 h při 105 °C a pak se rozpustí v COU vodě tak, aby získaný roztok obsahoval 1,19 mg sacharosy v litru (0,50 mg uhlíku v litru).

Zkoušený roztok. Voda, která má být zkoušena, se při řádném dodržování opatření zabraňujících znečištění shromáždí ve vzduchotěsně nádobě, přičemž zbývající prázdný prostor v nádobě musí být co nejmenší. Zkouška se provede co nejdříve, aby se snížilo znečištění vody z nádoby a z uzávěru na minimum.

Roztok pro způsobilost systému. 1,4-benzochinon R se rozpustí v COU vodě tak, aby získaný roztok obsahoval 0,75 mg 1,4-benzochinonu v litru (0,50 mg uhlíku v litru).

COU voda pro kontrolu. Použije se COU voda získaná současně s vodou použitou pro přípravu porovnávacího roztoku a roztoku pro způsobilost systému.

Kontrolní roztoky. Kromě COU vody pro kontrolu, se připraví vhodné kontrolní roztoky pro nulování přístroje nebo další roztoky potřebné pro stanovení základní linie nebo pro nastavení kalibrace podle pokynů výrobce; provede se slepá zkouška pro nastavení nulové polohy přístroje.

Způsobilost systému. Provede se měření s následujícími roztoky a zaznamenají se odezvy. Vypočítá se účinnost odezvy v procentech za použití výrazu:

rss-rwrs-rw.100 ,

v němž značí:

rw - COU voda,

rs - porovnávací roztok,

rss - roztok pro způsobilost systému.

Systém je způsobilý, jestliže účinnost odezvy je 85 % až 115 % teoretické odezvy.

Pracovní postup. Provede se měření se zkoušeným roztokem a zaznamená se odezva (ru). Zkoušený roztok vyhovuje zkoušce, jestliže ru není větší než rs - rw.

Tato metoda může být použita také u přímo spojeného přístrojového systému, který byl patřičně kalibrován a u něhož byla ověřena způsobilost systému. Umístění přístroje musí být zvoleno tak, aby bylo zajištěno, že odezvy jsou charakteristické pro použitou vodu.

^1) Pharmeuropa 11, 1, 49 (1999). Závazné od 1. 7. 1999

“

1. V příloze části 2 Zkušební metody, kapitola 2.4 Limitní zkoušky, se kapitola 2.4.20 Antioxidanty v mastných olejích zrušuje.

1. V příloze části 2 Zkušební metody, kapitola 2.4 Limitní zkoušky, kapitola 2.4.22 zní:

„

2.4.22 Cizí oleje v mastných olejích plynovou chromatografií [image omitted]

Cizí oleje se stanoví jako methylestery mastných kyselin přítomných ve zkoušených olejích. Pokud není v příslušném článku uvedeno jinak, použije se metoda A.

Metoda A

Tato metoda není použitelná pro oleje obsahující acylglyceroly mastných kyselin epoxy-, hydroepoxy-, cyklopropyl- nebo cyklopropenylovými skupinami nebo oleje s velkým podílem mastných kyselin s kratším řetězcem než 8 uhlíkových atomů nebo pro oleje s vyšším číslem kyselosti než 2,0.

Provede se plynová chromatografie (2.2.28).

Zkoušený roztok. Je-li v článku předepsáno, zkoušený olej se před methylací suší. Naváží se 1,0 g zkoušeného oleje do 25ml zabroušené baňky s kulatým dnem opatřené zpětným chladičem a upravené k zavádění plynu. Přidá se 10 ml methanolu bezvodého R, 0,2 ml roztoku hydroxidu draselného R (60 g/l) v methanolu R a za míchání se pod zpětným chladičem zahřívá k varu za současného probublávání dusíkem R rychlostí asi 50 ml/min. Když je roztok čirý (asi po 10 min), pokračuje se v zahřívání ještě 5 min. Baňka se ochladí pod tekoucí vodou a obsah se převede do dělicí nálevky. Vnitřek baňky se opláchne 5 ml heptanu R, který se přidá do dělicí nálevky a protřepe se. Přidá se 10 ml roztoku chloridu sodného R (200 g/l) a intenzivně se protřepe. Po rozdělení se organická vrstva převede do nádobky, vysuší se síranem sodným bezvodým R, nechá se stát a zfiltruje se.

Porovnávací roztok (a). Podle jedné z tabulek 2.4.22 se připraví 0,50 g směsi kalibračních látek tak, jak je předepsáno v příslušném článku (nezmiňuje-li se článek o určitém roztoku, použije se složení popsané v tab. 2.4.22-1). Rozpustí se v heptanu R a zředí se jím na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí heptanem R na 10,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

skleněné kolony nebo nerezové ocelové kolony délky 2 m až 3 m a vnitřního průměru 2 mm až 4 mm naplněné křemelinou pro plynovou chromatografii R (125 μm až 200 μm) impregnovanou 5 % až 15 % makrogolsukcinatu R nebo makrogoladipatu R,

dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu s průtokovou rychlostí 25 ml/min,

plamenoionizačního detektoru.

Teplota kolony se udržuje na 180 °C, teplota nástřikového prostoru a detektoru na 200 °C. Pokud je to nutné nebo předepsané, zvyšuje se teplota kolony rychlostí 5 °C/min ze 120 °C na 200 °C.

Chromatografický postup může být alternativně proveden za použití:

skleněné nebo křemenné kapilární kolony (je dávána přednost koloně se stěnami pokrytými kapalnou fází) délky 10 m až 30 m a vnitřního průměru 0,2 mm až 0,8 mm, jejíž vnitřní povrch je pokryt vrstvou poly[(kyanpropyl)(methyl)][(fenyl)(methyl)]siloxanu R nebo makrogolu 20 000 R (tloušťky 0,1 μm až 0,5 μm) nebo jinou vhodnou stacionární fází,

helia pro chromatografii R nebo vodíku pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové rychlosti 1,3 ml/min (pro kolonu o vnitřním průměru 0,32 mm),

plamenoionizačního detektoru,

dělicího poměru 1 : 100 nebo menšího, podle vnitřního průměru použité kolony (1 : 50 pro kolonu o vnitřním průměru 0,32 mm).

Teplota kolony se udržuje na 160 °C až 200 °C podle délky a typu použité kolony (pro kolonu délky 30 m pokrytou makrogolem 20 000 R, 200 °C), teplota nástřikového prostoru a detektoru se udržuje na 250 °C. Je-li nutno nebo předepsáno, zvyšuje se teplota kolony rychlostí 3 °C/min ze 170 °C na 230 °C (pro kolonu s makrogolem 20 000 R).

Nastříkne se 0,5 μl porovnávacího roztoku (a). Citlivost systému se nastaví tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu byla 50 % až 70 % celé stupnice zapisovače.

Určí se retenční časy jednotlivých mastných kyselin. Nastříkne se 1 μl porovnávacího roztoku (b) a zkontroluje se poměr signálu k šumu pro pík odpovídající methylmyristatu.

Nastříkne se 0,5 μl až 1,0 μl zkoušeného roztoku. Zaznamenávají se chromatogramy podobu odpovídající 2,5násobku retenčního času methyloleatu. Chromatogramy se vyhodnotí, jak je uvedeno níže.

Použije-li se kalibrační směs 1 nebo 3, zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je počet teoretických pater (n) (2.2.28), počítáno pro pík odpovídající methylstearatu, nejméně 2000 pro náplňové kolony a nejméně 30 000 pro kapilární kolony; na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je rozlišení (Rs) (2.2.28) mezi píky odpovídajícími methyloleatu a methylstearatu nejméně 1,25 pro náplňové a nejméně 1,8 pro kapilární kolony; na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je poměr signálu k šumu (2.2.28) pro pík odpovídající methylmyristatu nejméně 5.

Použije-li se kalibrační směs 2, zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je počet teoretických pater (n) (2.2.28), počítáno pro pík odpovídající methyldekanoatu, nejméně 1500 pro náplňové kolony a nejméně 15 000 pro kapilární kolony; na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je rozlišení (Rs) (2.2.28) mezi píky odpovídajícími methyloktanoatu a methyldekanoatu nejméně 2 pro náplňové a nejméně 4 pro kapilární kolony; na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je poměr signálu k šumu (2.2.28) pro pík odpovídající methylhexanoatu nejméně 5.

Vyhodnocení chromatogramu

Je třeba se vyvarovat pracovních podmínek, které umožňují vznik maskovaných píků (přítomnost složek s malými rozdíly v retenčních časech, jako u kyseliny linolenové a kyseliny arachidové).

Kvalitativní analýza. Sestrojí se kalibrační křivky za použití chromatogramu získaného s kalibračními roztoky a informací v tabulce 2.4.22-1:

a) za izotermických podmínek vynesením logaritmů redukovaných retenčních časů jako funkce počtu uhlíkových atomů mastné kyseliny; identifikují se píky pomocí takto získané přímky a „ekvivalentní délky řetězce“ pro různé píky. Kalibrační křivka nasycených kyselin je přímka. Logaritmy redukovaných retenčních časů nenasycených kyselin jsou umístěny na této přímce v bodech odpovídajících necelým číslům, která se nazývají „ekvivalentní délky řetězce“,

b) za podmínek lineárního teplotního programu vynesením retenčních časů jako funkce počtu uhlíkových atomů mastných kyselin; určení totožnosti se provede pomocí kalibrační křivky.

Kvantitativní analýza. Používá se obvyklý postup (metoda normalizace), při kterém součet ploch všech píků na chromatogramu, kromě píku rozpouštědla, je brán jako 100 %. Doporučuje se použití elektronického integrátoru. Obsah složky se vypočítá jako procentuální podíl plochy odpovídajícího píku z celkového součtu ploch všech píků. Nepřihlíží se k píkům, jejichž plocha je menší než 0,05 % celkové plochy.

V některých případech, např. v přítomnosti mastných kyselin s 12 nebo méně uhlíkovými atomy, mohou být v jednotlivém článku předepsány korekční faktory převodu ploch píků na procenta.

Metoda B

Tato metoda není použitelná pro oleje obsahující acylglyceroly mastných kyselin s epoxy-, hydroepoxy-, cyklopropyl- a cyklopropenylovými skupinami nebo oleje s číslem kyselosti vyšším než 2,0.

Zkoušený roztok. Naváží se 0,100 g zkoušeného oleje do 10ml centrifugační zkumavky se šroubovacím uzávěrem. Rozpustí se v 1 ml heptanu R a 1 ml dimethylkarbonatu R a opatrně se míchá za mírného zahřívání (50 °C až 60 °C). Ještě za tepla se přidá 1 ml roztoku sodíku R (12 g/l) v methanolu bezvodém R, který se připraví opatrně a intenzivně se míchá asi 5 min. Přidají se 3 ml vody destilované R a intenzivně se míchá asi 30 s. Zkumavka se odstřeďuje 15 min při 1500 gn. Nastříkne se 1 μl organické fáze.

Porovnávací roztoky a vyhodnocení chromatogramu. Pokud není v článku uvedeno jinak, použije se postup uvedený v metodě A.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

křemenné kolony délky 30 m a vnitřního průměru 0,25 mm se stěnou pokrytou vrstvou makrogolu 20 000 R (tloušťka filmu 0,25 μm),

helia pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové rychlosti 0,9 ml/min,

plamenoionizačního detektoru,

injektorové smyčky (1/100),

s následujícím teplotním programem:

	Čas (min)	Teplota (°C)	Rychlost (°C/min)	Poznámky
kolona	0 - 15	100	-	izotermicky
	15 - 36	100 → 225	10	lineární gradient
	36 - 61	225	-	izotermicky
nástřikový prostor		250
detektor		250

Metoda C

Tato metoda není použitelná pro oleje obsahující acylglyceroly mastných kyselin s epoxy-, hydroperoxy-, aldehyd-, keton-, cyklopropyl- a cyklopropenylovými skupinami a konjugovanými polynenasycenými nebo acetylenovými skupinami, protože dochází k částečnému nebo celkovému rozpadu těchto skupin.

Zkoušený roztok. V 25ml kuželové baňce se rozpustí 0,10 g zkoušeného oleje ve 2 ml roztoku hydroxidu draselného R (20 g/l) v methanolu R a vaří se 30 min pod zpětným chladičem. Zpětným chladičem se přidají 2,0 ml fluoridu boritého v methanolu RS, vaří se 30 min a pak se přidají 4 ml heptanu R a vaří se 5 min. Baňka se ochladí, přidá se 10,0 ml nasyceného roztoku chloridu sodného R, míchá se asi 15 s a přidá se takové množství nasyceného roztoku chloridu sodného R, aby vrchní vrstva vystoupila k hrdlu baňky. Z vrchní vrstvy se odeberou 2 ml a promyjí se třikrát 2 ml vody R a vysuší se síranem sodným bezvodým R.

Porovnávací roztoky a vyhodnocení chromatogramů. Pokud není v článku uvedeno jinak, použije se postup uvedený v metodě A.

Tab. 2.4.22-1 Kalibrační látky*

| Směs následujících látek | Ekvivalentní délka řetězce** | Složení v % | | | | | (1) | (2) | Izotermické podmínky | Lineární teplotní program | | --- | --- | --- | --- | --- | | methyllaurat R | 12,0 | 12,0 | 5 | 10 | | methylmyristat R | 14,0 | 14,0 | 5 | 15 | | methylpalmitat R | 16,0 | 16,0 | 10 | 15 | | methylstearat R | 18,0 | 18,0 | 20 | 20 | | methylarachidat R | 20,0 | 20,0 | 40 | 20 | | methyloleat R | 18,6 | 18,3 | 20 | 20 |

Tab. 2.4.22-2 Kalibrační látky*

| Směs následujících látek | Ekvivalentní délka řetězce** | Složení v % | | | | | (1) | (2) | Izotermické podmínky | Lineární teplotní program | | --- | --- | --- | --- | --- | | methylhexanoat R | 6,0 | 6,0 | 5 | 10 | | methyloktanoat R | 8,0 | 8,0 | 5 | 35 | | methyldekanoat R | 10,0 | 10,0 | 10 | 35 | | methyllaurat R | 12,0 | 12,0 | 20 | 10 | | methylmyristat R | 14,0 | 14,0 | 40 | 10 |

Tab. 2.4.22-3 Kalibrační látky*

| Směs následujících látek | Ekvivalentní délka řetězce** | Složení v % | | | | | (1) | (2) | Izotermické podmínky | Lineární teplotní program | | --- | --- | --- | --- | --- | | methylmyristat R | 14,0 | 14,0 | 5 | 15 | | methylpalmitat R | 16,0 | 16,0 | 10 | 15 | | methylstearat R | 18,0 | 18,0 | 15 | 20 | | methylarachidat R | 20,0 | 20,0 | 20 | 15 | | methyloleat R | 18,6 | 18,3 | 20 | 15 | | methylikosenoat R | 20,2 | 20,2 | 10 | 10 | | methylbehenat R | 22,0 | 22,0 | 10 | 5 | | methyllignocerat R | 24,0 | 24,0 | 10 | 5 |

Pro GC s kapilární kolonou a s nástřikem s děličem se doporučuje, aby složka s nejdelším řetězcem ze zkoušené směsi byla přidána ke kalibrační směsi.

** Tato hodnota, která má být počítána pomocí kalibrační křivky, je uvedena jako příklad pro kolonu s makrogolsukcinatem R (1) a pro kolonu s makrogolem 20 000 R (2).

“

1. V příloze části 2 Zkušební metody, kapitola 2.4 Limitní zkoušky se za kapitolu 2.4.26 doplňují kapitoly 2.4.27 a 2.4.28, které znějí:

„

2.4.27 Nikl v hydrogenovaných rostlinných olejích [image omitted]

Stanoví se atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda I).

Upozornění: Při použití mikrovlnného rozkladu za zvýšeného tlaku v uzavřeném systému je třeba dodržovat návod a bezpečnostní předpisy výrobce.

Zkoušený roztok. 0,100 g (m) se naváží do nádobky pro vysokotlaký mikrovlnný rozklad (fluorpolymer nebo křemenné sklo), přidá se 6,0 ml kyseliny dusičné R a 2,0 ml peroxidu vodíku koncentrovaného R. Stejným způsobem se připraví roztok pro slepou zkoušku. Uzavřené nádobky se vloží do laboratorní mikrovlnné pícky. Pro rozklad se použije vhodný program, např. 250 W po dobu 10 min; 600 W po dobu 5 min; 400 W po dobu 5 min; 250 W po dobu 7 min. Před otevřením se digesční nádobky nechají ochladit. Obsah nádobek se kvantitativně převede do odměrných baněk, zředí se vodou R na 25,0 ml a promíchá se.

Porovnávací roztoky. K 10,0 ml základního roztoku niklu (10 μg Ni/ml) se přidá 1,0 ml kyseliny dusičné R, 2,0 ml peroxidu vodíku koncentrovaného R a zředí se vodou R na 20,0 ml. Do čtyř odměrných baněk se vnese 20 μl, 50 μl, 100 μl a 150 μl tohoto roztoku, do každé baňky se přidá 6,0 ml kyseliny dusičné R, zředí se vodou R na 25,0 ml a opět se promíchá. Získají se porovnávací roztoky obsahující: 4 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml a 30 ng/ml niklu.

Nulový roztok. 6,0 ml kyseliny dusičné R se přidá do vody R a zředí se jí na 25,0 ml.

Postup. Připraví se směsi objemových dílů roztoku dusičnanu hořečnatého R (5,0 g/l) a kontrolního roztoku získaného při slepé zkoušce (1+2); roztoku dusičnanu hořečnatého R (5,0 g/l) a zkoušeného roztoku (1 + 2); roztoku dusičnanu hořečnatého R (5,0 g/l) a porovnávacích roztoků (1 + 2); roztoku dusičnanu hořečnatého R (5,0 g/l) a nulového roztoku (1 + 2).

Stanoví se absorbance všech roztoků při 232,0 nm za použití vhodného atomového absorpčního spektrometru s grafitovým atomizátorem (pecí), vybaveného systémem kompenzace pozadí Zeemanovým jevem, pyrolyticky potaženou trubičkou s ploškou a niklovou lampou s dutou katodou. Teplota peci se 10 s udržuje na 100 °C, pak se 10 s zvyšuje na 1400 °C (spalovací teplotu), při níž se udržuje 10 s, potom se teplota 20 s zvyšuje na 2500 °C (teplota atomizace), při níž se udržuje 5 s. Pomocí nulového roztoku se nastaví nula přístroje. Z hodnot pro porovnávací roztoky se stanoví kalibrační křivka. Při použití vnější kalibrace se stanoví koncentrace zkoušeného roztoku a kontrolního roztoku získaného při slepé zkoušce z odpovídajících absorbancí. V případě potřeby se zředí nulovým roztokem tak, aby se získala hodnota v kalibrovaném rozsahu absorbance (zřeďovací faktor f).

Obsah niklu v μg/g se vypočítá podle vztahu:

c.fm.40,

v němž značí:

c - změřenou koncentraci v nanogramech v mililitru,

f - zřeďovací faktor,

m - navážku zkoušené látky v gramech.

2.4.28 Kyselina 2-ethylhexanová [image omitted]

Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28) za použití kyseliny 3-cyklohexylpropionové R jako vnitřního standardu.

Roztok vnitřního standardu. 100 mg kyseliny 3-cyklohexylpropionové R se rozpustí v cyklohexanu R a zředí se jím na 100 ml.

Zkoušený roztok. K 0,300 g zkoušené látky se přidají 4,0 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové R 33% (V/V) a silně se dvakrát 1 min třepe, vždy s 1,0 ml roztoku vnitřního standardu. Fáze se nechají oddělit (je-li nezbytné, použije se k lepšímu oddělení odstřeďování). Použijí se spojené horní vrstvy.

Porovnávací roztok. 75,0 mg kyseliny 2-ethylhexanové R se rozpustí v roztoku vnitřního standardu a zředí se jím na 50,0 ml. K 1,0 ml roztoku se přidají 4,0 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové R 33% (V/V) a 1 min se silně třepe. Fáze se nechají oddělit (je-li nezbytné, použije se k lepšímu oddělení odstřeďování). Ke spodní vrstvě se přidá 1,0 ml roztoku vnitřního standardu a silně se 1 min třepe. Fáze se nechají oddělit (je-li nezbytné, použije se k lepšímu oddělení odstřeďování). Použijí se spojené horní vrstvy.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

křemenné kapilární kolony délky 10 m a vnitřního průměru 0,53 mm s vnitřní stěnou pokrytou makrogolem 20 000 2-nitrotereftalatem R (tloušťka vrstvy je 1,0 μm),

helia pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové rychlosti 10 ml/min,

plamenoionizačního detektoru,

s následujícím teplotním programem:

	Čas (min)	Teplota (°C)	Rychlost (°C/min)	Poznámka
kolona	0 - 2	40		izotermicky
	2 - 7,3	40 → 200	30	lineární gradient
	7,3 - 10,3	200		izotermicky
nástřikový prostor		200
detektor		300

Nastříkne se 1 μl zkoušeného roztoku a 1 μl porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky odpovídajícími kyselině 2-ethylhexanové (první pík) a vnitřnímu standardu není menší než 2,0.

Obsah kyseliny 2-ethylhexanové v procentech se vypočítá podle vzorce:

AT.IR.mR.2AR.IT.mT,

v němž značí:

AT - plochu píku kyseliny 2-ethylhexanové na chromatogramu zkoušeného roztoku,

AR - plochu píku kyseliny 2-ethylhexanové na chromatogramu porovnávacího roztoku,

IT - plochu píku vnitřního standardu na chromatogramu zkoušeného roztoku,

IR - plochu píku vnitřního standardu na chromatogramu porovnávacího roztoku,

mT - hmotnost zkoušené látky v gramech ve zkoušeném roztoku,

mR - hmotnost kyseliny 2-ethylhexanové v gramech v porovnávacím roztoku.

“

1. V příloze části 2 Zkušební metody, kapitola 2.5 Stanovení obsahu, kapitola 2.5.6 zní:

„

2.5.6 Číslo zmýdelnění [image omitted]

Číslo zmýdelnění Is udává množství hydroxidu draselného v miligramech, potřebné k neutralizaci volných kyselin a ke zmýdelnění esterů obsažených v 1 g látky.

Není-li uvedeno jinak, pro stanovení se použijí množství uvedená v tabulce 2.5.6-1.

Předpokládaná hodnota Is	Množství vzorku v gramech
3 - 10	12 - 15
10 - 40	8 - 12
40 - 60	5 - 8
60 - 100	3 - 5
100 - 200	2,5 - 3
200 - 300	1 - 2
300 - 400	0,5 - 1

Předepsané množství zkoušené látky (m g) se převede do 250ml baňky z borokřemičitého skla a přidá se 25,0 ml hydroxidu draselného v lihu 0,5 mol/l VS a několik skleněných kuliček. Připojí se zpětný chladič a vaří se 30 min, pokud není předepsáno jinak. Potom se přidá 1 ml fenolftaleinu RS1 a ihned se titruje kyselinou chlorovodíkovou 0,5 mol/l VS. Současně se za stejných podmínek provede slepá zkouška.

Číslo zmýdelnění se vypočte podle vzorce:

IS=28,05.n2-n1m,

v němž značí:

n1 - spotřebu kyseliny chlorovodíkové 0,5 mol/l VS při titraci v ml,

n2 - spotřebu kyseliny chlorovodíkové 0,5 mol/l VS při slepé zkoušce v ml,

m - navážku zkoušené látky v gramech.

“

1. V příloze části 2 Zkušební metody, kapitola 2.6 Biologické metody, kapitola 2.6.12 a kapitola 2.6.13 znějí:

„

2.6.12 Mikrobiologické zkoušení nesterilních výrobků (celkový počet živých mikroorganismů) [image omitted]

Dále popsaná zkouška umožňuje kvantitativně spočítat mezofilní bakterie a houby, které mohou růst v aerobních podmínkách.

Zkouška je určena především ke zjištění, zda látka, která je předmětem lékopisného článku, vyhovuje nebo nevyhovuje mikrobiologickým požadavkům uvedeným v tomto článku. Pokud se zkouška používá pro tyto účely, postupuje se podle následujících pokynů, včetně potřebného počtu odebraných vzorků a dále uvedené interpretace výsledků. Zkouška se může také použít ve stati Účinnost protimikrobních konzervačních látek (5.1.3), jak je popsána v lékopise. Dále se může užít pro monitorování kvality surovin a může se použít ve spojení s požadavky uvedenými ve stati Mikrobiologická jakost léčivých přípravků (5.1.4). Pokud ji výrobce použije v takových případech, jako je monitorování kvality surovin anebo konečných přípravků, nebo při validaci postupu, je provedení zkoušky, včetně počtu odebraných vzorků a interpretace výsledků, záležitostí dohody mezi výrobcem a oprávněnou autoritou.

Stanovení se provádí za podmínek vylučujících nahodilé znečištění zkoušeného výrobku. Opatření vylučující znečištění mají být taková, aby nepůsobila na prokazované mikroorganismy. Jestliže zkoušený výrobek má protimikrobní účinky, neutralizují se přiměřeným způsobem. Používají-li se k tomuto účelu inaktivující látky, prokáže se jejich účinnost a také že nejsou toxické pro mikroorganismy.

Celkový počet živých mikroorganismů se stanoví metodou membránové filtrace nebo počítáním na pevných půdách, jak je předepsáno v lékopisném článku.

Metoda nejpravděpodobnějšího počtu je vyhrazena pro stanovení počtu bakterií v případech, kdy se nedá provést žádná jiná metoda. Výběr metody může být založen na různých faktorech, jako jsou např. povaha výrobku a očekávaný počet mikroorganismů. Kterákoliv vybraná metoda se dostatečně validuje.

Ve spojení se statí (5.1.3) nebo (5.1.4) se může použít metoda zalévání do agaru, metoda očkování na povrch agarové půdy nebo metoda membránové filtrace.

Příprava vzorku

Plán vzorkování. Vzorkování výrobku se provede podle dobře definovaného plánu odběru vzorků. Tento plán závisí na faktorech, jako jsou velikost šarže, zdravotní riziko spojené s nepřijatelně vysokou kontaminací přípravku, na jeho charakteru a na očekávaném stupni kontaminace. Jestliže není předepsáno jinak, použije se 10 g nebo 10 ml zkoušené látky nebo přípravku odebraných za shora uvedených podmínek. Vzorky se vyberou náhodně z nerozplněného materiálu nebo z dostupných obalů přípravku. K získání potřebného množství se smíchá, je-li třeba, obsah dostatečného počtu obalů, které postačují k vytvoření vzorku podle povahy zkoušené látky nebo přípravku.

Trojúrovňový vzorkovací plán je příkladem vzorkovacího plánu vhodného pro výrobky, jejichž homogenita může být problémem ve vztahu k rozložení mikroorganismů. V tom případě se z každé šarže odebere a vyzkouší odděleně pět vzorků. Tři uznané úrovně jsou: (i) přijatelné vzorky, tj. obsahující méně než m jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru, kde m je limit určený v příslušném článku; (ii) kritické vzorky, tj. které obsahují více než m jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru, ale méně než 10 m jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru; (iii) vadné vzorky, tj. obsahující více než 10 m jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru.

Výrobky rozpustné ve vodě. 10 g nebo 10 ml zkoušeného výrobku se rozpustí nebo zředí v tlumivém roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 nebo v jiné vhodné tekutině. Obecně se připraví ředění 1 : 10, ale vlastnosti výrobku nebo požadovaná citlivost mohou vyžadovat použití jiných poměrů. Jestliže je známa protimikrobní účinnost výrobku, může se do rozpouštědla přidat inaktivující látka. Pokud je třeba, upraví se pH na hodnotu asi 7 a připraví se řada desetinásobných ředění za použití stejného rozpouštědla.

Nelipofilní výrobky nerozpustné ve vodě. 10 g nebo 10 ml zkoušeného výrobku se suspenduje v tlumivém roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 nebo jiné vhodné tekutině. Obecně se připraví suspenze ředěním 1 : 10, ale vlastnosti některých výrobků mohou vyžadovat použití větších objemů. Je možné přidat vhodnou povrchově aktivní látku, např. polysorbát 80 (1 g/l) k usnadnění tvorby suspenze špatně smáčitelných látek. Jestliže je známa protimikrobní účinnost výrobku, může se do rozpouštědla přidat inaktivující látka. Pokud je třeba, upraví se pH na hodnotu asi 7 a připraví se řada desetinásobných ředění za použití stejného rozpouštědla.

Výrobky lipofilní. 10 g nebo 10 ml zkoušeného výrobku se zhomogenizuje s nejvýše polovinou jeho hmotnosti sterilního polysorbátu 80 nebo jiné vhodné povrchově aktivní látky, kterou je možno v případě potřeby zahřát nejvýše na 40 °C, ve výjimečných případech nejvýše na 45 °C. Dobře se promíchá a je-li třeba, udržuje se při této teplotě na vodní lázni nebo v termostatu. K přípravě ředění 1 : 10 původního výrobku se přidá dostatečné množství předehřátého tlumivého roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0. Zatímco se udržuje teplota, míchá se pečlivě co nejkratší dobu nezbytnou k vytvoření emulze, nejdéle však 30 min. Další řada desetinásobných ředění se může připravit za použití tlumivého roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 obsahujícího vhodnou koncentraci sterilního polysorbátu 80 nebo jiné povrchově aktivní látky.

Transdermální náplasti. Sterilní pinzetou se z deseti transdermálních náplastí odstraní ochranná fólie a náplasti se položí na sterilní sklo nebo podnos z plastu tak, aby adhezivní vrstva byla nahoře. Lepivý povrch se pokryje sterilní gázou (nebo tkaným filtrem typu mřížky z polymerního monofilu), je-li to nutné, a deset náplastí se přenese do nejméně 500 ml tlumivého roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 obsahujícího vhodné inaktivační látky, jako je polysorbát 80 a/nebo lecitin. Nejméně 30 min se silně protřepává (přípravek A). Stejným způsobem se připraví deset náplastí, vloží se do nejméně 500 ml tekuté půdy D a silně se protřepává 30 min (přípravek B).

Zkoušení vzorku

Membránová filtrace

Použijí se membránové filtry s nominální velikostí pórů nejvýše 0,45 μm a jejichž účinnost zadržet bakterie byla ověřena. Typ materiálu filtru se vybere tak, aby tato účinnost nebyla ovlivněna složkami zkoušeného vzorku. Filtry z dusičnanů celulosy se např. používají pro vodné, olejové a slabé lihové roztoky a filtry z octanu celulosy se např. používají pro silné lihové roztoky. Přístroj je navržen tak, aby umožnil přenést filtr na agarovou půdu.

Vhodné množství vzorku, připraveného jak je popsáno v odstavci Příprava vzorku (přednostně představující 1 g výrobku nebo méně, jestliže se očekává větší množství jednotek vytvářejících kolonie), přenese se na každý ze dvou membránových filtrů a ihned se zfiltruje. Každý filtr se promyje třemi dávkami, z nichž každou tvoří asi 100 ml vhodné tekutiny, jako např. tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0. K tomuto roztoku je možné přidat povrchově aktivní látky, jako je polysorbát 80, nebo látky inaktivující protimikrobní účinky. Je-li postup validován, může se na promytí použít méně než tři dávky. Membránový filtr určený především pro počítání bakterií se přenese na povrch vhodné agarové půdy, jako je agarová půda B, a druhý určený především pro počítání hub se přenese na povrch vhodné půdy, jako je agarová půda C. Misky s agarem B se inkubují při 30 °C až 35 °C a misky s agarem C při 20 °C až 25 °C po dobu 5 dní, pokud se nezíská spolehlivý počet dříve. Vyberou se misky s nejvyšším počtem kolonií, který však nepřesahuje 100, a vypočítá se počet jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru výrobku.

Při zkoušce transdermálních náplastí se odděleně filtruje po 50 ml přípravku A přes dva sterilní membránové filtry. Jeden filtr se přenese na agarovou půdu B ke stanovení celkového počtu aerobních mikroorganismů, druhý filtr na agarovou půdu C ke stanovení počtu hub.

Počítání na pevných půdách

a) Metoda zalévání do agaru

Použijí se Petriho misky o průměru 9 cm, do každé se přidá 1 ml vzorku připraveného, jak je popsáno v odstavci Příprava vzorku, a 15 ml až 20 ml rozehřáté agarové půdy vhodné pro kultivaci bakterií (jako např. agarová půda B) nebo rozehřáté agarové půdy vhodné pro kultivaci hub (jako např. agarová půda C). Půdy se rozehřívají při teplotě, která nepřesahuje 45 °C. Použijí-li se větší Petriho misky, zvětší se příslušně i množství agaru. S každou živnou půdou a s každým zředěním se připraví nejméně dvě Petriho misky. Misky s půdou pro bakterie se inkubují při 30 °C až 35 °C (pro houby při 20 °C až 25 °C) po dobu 5 dní, pokud se nezíská spolehlivý počet dříve. Vyberou se misky odpovídající jednomu ředění a ukazující nejvyšší počet kolonií, který však nepřesahuje 300 (100 kolonií pro houby). Z aritmetického průměru počtů se vypočítá množství jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru.

b) Metoda očkování na povrch agarové půdy

Použijí se Petriho misky o průměru 9 cm, do každé se přidá 15 ml až 20 ml agarové půdy vhodné pro kultivaci bakterií (jako je agarová půda B) nebo agarové půdy vhodné pro kultivaci hub (jako je agarová půda C) rozehřáté při asi 45 °C a nechá se ztuhnout. Používají-li se větší Petriho misky, použije se přiměřeně větší množství živné půdy. Povrch půd se nechá zaschnout, např. ve skříni s laminárním prouděním vzduchu nebo v termostatu. Odměřený objem, nejméně však 0,1 ml vzorku připraveného, jak je popsáno v odstavci Příprava vzorku, se rozetře na povrch půdy. Pro každou půdu a každé ředění se použijí nejméně dvě Petriho misky. Při inkubaci a počítání jednotek vytvářejících kolonie se postupuje stejně, jak je popsáno v metodě zalévání do agaru.

Metoda nejpravděpodobnějšího počtu

Správnost a přesnost této metody (MPN) je menší než u metody membránové filtrace nebo počítání na pevných půdách. Nespolehlivé výsledky jsou získávány obzvláště při počítání plísní. Z těchto důvodů se metoda MPN používá pro počítání bakterií v případě, kdy se žádná jiná metoda nedá provést. Je-li použití této metody oprávněné, postupuje se následujícím způsobem.

Připraví se řada nejméně tří následujících desetinásobných ředění výrobku, jak je popsáno v odstavci Příprava vzorku. Z každého ředění se použijí tři stejné dávky (1 g nebo 1 ml) k očkování tří zkumavek s 9 ml až 10 ml vhodné tekuté půdy (jako je půda A). Je-li třeba, může se k půdě přidat povrchově aktivní látka, jako je polysorbát 80, nebo látka inaktivující protimikrobní účinky. Jestliže jsou připraveny tři stupně ředění, naočkuje se devět zkumavek a všechny se 5 dnů inkubují při 30 °C až 35 °C. Pro každý stupeň ředění se zaznamenává počet zkumavek, které vykazují mikrobiální růst. Jestliže odečítání výsledků je obtížné nebo nejisté vzhledem k povaze zkoušeného výrobku, vyočkuje se do stejné půdy nebo na vhodnou pevnou půdu (jako je agarová půda B) a inkubuje se 18 h až 24 h při stejné teplotě a použijí se tyto výsledky. Nejpravděpodobnější počet bakterií v gramu nebo mililitru zkoušeného výrobku se stanoví z tabulky 2.6.12-1.

Tab. 2.6.12-1 Hodnoty nejpravděpodobnějšího počtu bakterií

| Tři zkumavky pro každé ředění | | | | | | | | | Počet zkumavek s pozitivním růstem | Nejpravděpodobnější počet v 1 g | Kategorie* | 95% meze spolehlivosti | | | | | | 0,1 g | 0,01 g | 0,001 g | 1 | 2 | | | | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | 0 | 0 | 0 | < 3 | | | - | - | | 0 | 1 | 0 | 3 | | x | < 1 | 17 | | 1 | 0 | 0 | 3 | x | | 1 | 21 | | 1 | 0 | 1 | 7 | | x | 2 | 27 | | 1 | 1 | 0 | 7 | x | | 2 | 28 | | 1 | 2 | 0 | 11 | | x | 4 | 35 | | 2 | 0 | 0 | 9 | x | | 2 | 38 | | 2 | 0 | 1 | 14 | | x | 5 | 48 | | 2 | 1 | 0 | 15 | x | | 5 | 50 | | 2 | 1 | 1 | 20 | | x | 8 | 61 | | 2 | 2 | 0 | 21 | x | | 8 | 63 | | 3 | 0 | 0 | 23 | x | | 7 | 129 | | 3 | 0 | 1 | 38 | x | | 10 | 180 | | 3 | 1 | 0 | 43 | x | | 20 | 210 | | 3 | 1 | 1 | 75 | x | | 20 | 280 | | 3 | 2 | 0 | 93 | x | | 30 | 390 | | 3 | 2 | 1 | 150 | x | | 50 | 510 | | 3 | 2 | 2 | 210 | | x | 80 | 640 | | 3 | 3 | 0 | 240 | x | | 100 | 1400 | | 3 | 3 | 1 | 460 | x | | 200 | 2400 | | 3 | 3 | 2 | 1100 | x | | 300 | 4800 | | 3 | 3 | 3 | > 1100 | | | - | - |

*Kategorie 1: normální výsledky obdržené v 95 % případů. Kategorie 2: méně pravděpodobné výsledky obdržené pouze ve 4 % případů. Tyto se nemohou použít pro důležitá rozhodnutí. Výsledky, které jsou ještě menší než tyto v kategorii 2, nejsou uvedeny a jsou vždy nepřijatelné.

Účinnost kultivačních půd a validita metody na stanovení počtu

Bakteriální kmeny se 18 h až 24 h kultivují odděleně v nádobách obsahujících vhodnou tekutou půdu (jako je půda A) při 30 °C až 35 °C. Kmeny hub se kultivují odděleně na vhodné agarové půdě (jako je půda C bez antibiotik) při 20 °C až 25 °C 48 h (Candida albicans) nebo 7 dní (Aspergillus niger).

Staphylococcus aureus	ATCC 6538 (NCIMB 9518, CIP 4.83, CCM 4516, CNCTC Mau 29/58)
Escherichia coli	ATCC 8739 (NCIMB 8545, CIP 53.126, CCM 4517)
Bacillus subtilis	ATCC 6633 (NCIMB 8054, CIP 52.62, CCM 1999, CNCTC Bs 8/58)
Candida albicans	ATCC 10231 (NCPF 3179, IP 48.72, CCM 8215, CNCTC 59/91)
Aspergillus niger	ATCC 16404 (IMI 149007, IP 1431.83, CCM 8222)

K přípravě referenční suspenze, obsahující asi 100 jednotek vytvářejících kolonie, se použije tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0. Suspenze každého z mikroorganismů se použije samostatně jako kontrola metod na stanovení počtu, v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného výrobku. Pokud se zkouška provádí pomocí membránové filtrace nebo počítáním na pevných půdách, počty kolonií všech zkoušených mikroorganismů by se neměly lišit od hodnot vypočítaných z inokula o více než faktor 5. Pokud se zkouška provádí metodou nejpravděpodobnějšího počtu, pak vypočítaný výsledek je v 95% mezích spolehlivosti. Pro zkoušku sterility agarové půdy a ředicího roztoku a aseptického provedení zkoušky se místo zkoušeného přípravku použije sterilní roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0. Nezjistí se růst mikroorganismů.

Interpretace výsledků

Za počet bakterií se považuje průměrné množství jednotek vytvářejících kolonie, které byly nalezeny na agarové půdě B. Za počet hub se považuje průměrné množství jednotek vytvářejících kolonie, které byly nalezeny na agarové půdě C. Celkový počet živých mikroorganismů je součtem počtu bakterií a počtu hub, jak byly popsány výše. Jestliže je prokázáno, že stejné typy mikroorganismů rostou na obou agarových půdách, může se provést oprava. Jestliže se použila metoda nejpravděpodobnějšího počtu, tak vypočítaná hodnota je počet bakterií.

Je-li v článku uveden limit počtu mikroorganismů, interpretuje se takto:

10^2 mikroorganismů - nejvyšší přijatelná hodnota je 5 × 10^2,

10^3 mikroorganismů - nejvyšší přijatelná hodnota je 5 × 10^3 atd.

Jestliže je např. použit trojúrovňový vzorkovací plán, postupuje se následovně:

Pro každý z pěti vzorků se vypočítá samostatně celkový počet živých mikroorganismů. Látka nebo přípravek vyhovují zkoušce, jestliže jsou splněny následující podmínky: (i) žádný z jednotlivých výsledků celkového počtu živých mikroorganismů nepřesahuje desetinásobek předepsaného limitu (tj. žádné nepřijatelné vzorky) a (ii) nejvýše dva z jednotlivých výsledků celkového počtu živých mikroorganismů jsou mezi předepsaným limitem a desetinásobkem tohoto limitu (tj. nejvýše dva kritické vzorky).

Doporučené roztoky a agarové půdy jsou popsány ve stati 2.6.13.

2.6.13 Mikrobiologické zkoušení nesterilních výrobků (zkoušky na specifické mikroorganismy) [image omitted]

V těchto obecných metodách se předpokládá použití určitých selektivních půd. Vlastností společnou pro všechny selektivní půdy je, že nezachytí subletálně poškozené mikroorganismy. Jelikož subletálně poškozené mikroorganismy jsou důležité pro kvalitu výrobku, je jejich resuscitace zahrnuta do zkušebních postupů, které používají selektivní půdy.

Jestliže zkoušený výrobek má protimikrobní účinky, neutralizují se tyto účinky odpovídajícím způsobem.

Enterobakterie a určité jiné gramnegativní bakterie

Přestože zkouška byla určena pro zjištění bakterií patřících do čeledi Enterobacteriaceae, je známo, že mohou být nalezeny i jiné typy mikroorganismů (např. Aeromonas, Pseudomonas).

Důkaz bakterií. Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno ve stati 2.6.12, ale místo tlumivého roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 se použije tekutá půda D. Zhomogenizuje se a inkubuje při 35 °C až 37 °C po dobu postačující k oživení bakterií, ale nepostačující k jejich pomnožení (obvykle 2 h, ale nejvýše 5 h). Obal se protřepe a množství homogenizátu A odpovídající 1 g nebo 1 ml zkoušeného výrobku se kvantitativně přenese do 100 ml pomnožovací půdy E a inkubuje 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Potom se vyočkuje na misky s agarovou půdou F a inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Výrobek vyhovuje, jestliže na žádné misce nevyrostou kolonie gramnegativních bakterií.

Kvantitativní stanovení. Do vhodných množství obohacené tekuté půdy E se přidají z homogenizátu A a nebo z jeho ředění množství, odpovídající 0,1 g, 0,01 g a 0,001 g (nebo 0,1 ml, 0,01 ml a 0,001 ml) zkoušeného výrobku. Inkubuje se 24 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Z každé kultury se pro dosažení selektivní izolace provede vyočkování na agarovou půdu F. Inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Růst dobře vyvinutých, červených nebo načervenalých kolonií gramnegativních bakterií se hodnotí jako pozitivní výsledek. Zaznamená se nejmenší množství zkoušeného výrobku, které dává pozitivní výsledek a největší množství zkoušeného výrobku, které dává negativní výsledek. Z tabulky 2.6.13-1 se stanoví pravděpodobný počet bakterií.

Tab. 2.6.13-1

| Výsledky pro množství přípravku | Pravděpodobný počet bakterií v 1 g přípravku | | | | 0,1 g nebo 0,1 ml | 0,01 g nebo 0,01 ml | 0,001 g nebo 0,001 ml | | | --- | --- | --- | --- | | + | + | + | více než 103 | | + | + | - | méně než 103 a více než 102 | | + | - | - | méně než 102 a více než 10 | | - | - | - | méně než 10 |

Při zkoušení transdermálních náplastí se filtruje 50 ml přípravku B, který je popsán ve stati 2.6.12 sterilním membránovým filtrem. Filtr se vloží do 100 ml obohacené tekuté půdy E a inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Po inkubaci se vyočkuje na agarovou půdu F k důkazu enterobakterií a jiných gramnegativních mikroorganismů.

Escherichia coli

Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno ve stati 2.6.12 a použije se 10 ml nebo množství odpovídající 1 g nebo 1 ml k naočkování do 100 ml tekuté půdy A, zhomogenizuje se a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Obsah nádoby se protřepe a 1 ml se přenese do 100 ml půdy G a inkubuje se 18 h až 24 h při 43 °C až 45 °C. Vyočkuje se na agarovu půdu H a inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Nárůst červených nemukózních kolonií gramnegativních tyčinek indikuje možnou přítomnost Escherichia coli. Ta se potvrdí vhodnými biochemickými zkouškami, jako je tvorba indolu. Výrobek vyhovuje zkoušce, jestliže žádné takovéto kolonie nejsou pozorovány nebo když ověřovací biochemické zkoušky jsou negativní.

Salmonella

Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno ve stati 2.6.12, ale místo tlumivého roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 se použije tekutá půda A, zhomogenizuje se a inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. 1 ml obohacené kultury se přenese do 10 ml tekuté půdy I a inkubuje se 18 h až 24 h při 41 °C až 43 °C. Potom se vyočkuje na nejméně dvě různé pevné půdy, vybrané z agarové půdy J, agarové půdy K a agarové půdy L. Inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Pravděpodobná přítomnost salmonel je indikována růstem kolonií tohoto vzhledu:

na půdě J: dobře rozvinuté bezbarvé kolonie,

na půdě K: dobře rozvinuté červené kolonie s černým středem nebo bez něho,

na půdě L: malé průsvitné bezbarvé nebo růžové až matně bílé kolonie, často obklopené růžovou nebo červenou zónou.

K potvrzení nálezu se samostatně naočkuje několik podezřelých kolonií na povrch a vpichem do agarové půdy M. Přítomnost salmonel je předběžně potvrzena, jestliže uvnitř půdy, ale nikoliv na jejím povrchu dojde ke změně barvy z červené na žlutou a obvykle též ke tvorbě plynu v agaru. Tvoří se nebo též netvoří sirovodík. Potvrzení se může zpřesnit vhodnými biochemickými a sérologickými zkouškami. Výrobek vyhovuje zkoušce, jestliže se nenajdou kolonie popsaného typu nebo jestliže ověřující biochemické a sérologické zkoušky jsou negativní.

Pseudomonas aeruginosa

Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno ve stati 2.6.12 a použije se 10 ml nebo množství odpovídající 1 g nebo 1 ml k naočkování do 100 ml tekuté půdy A, zhomogenizuje se a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Potom se vyočkuje na misku s agarovou půdou N a inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Není-li zjištěn růst mikroorganismů, výrobek vyhovuje. Jestliže se objeví růst gramnegativních tyčinek, vhodné množství z morfologicky odlišných izolovaných kolonií se přenese do tekuté půdy A a inkubuje se 18 h až 24 h při 41 °C až 43 °C. Výrobek vyhovuje, jestliže při 41 °C až 43 °C není pozorován žádný růst.

Při zkoušení transdermálních náplastí se filtruje 50 ml přípravku A, který je popsán ve stati 2.6.12, sterilním membránovým filtrem. Filtr se vloží do 100 ml tekuté půdy A a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Po inkubaci se vyočkuje na agarovou půdu N.

Staphylococcus aureus

Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno ve stati 2.6.12 a použije se 10 ml nebo množství odpovídající 1 g nebo 1 ml k naočkování do 100 ml tekuté půdy A, zhomogenizuje se a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Vyočkuje se na misku s agarovou půdou O a inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Černé kolonie grampozitivních koků obklopené jasnou zónou indikují přítomnost S. aureus. Výsledek je možno potvrdit vhodnými biochemickými zkouškami, jako jsou koagulasová a deoxyribonukleasová zkouška. Výrobek vyhovuje zkoušce, jestliže se na agarové půdě O neobjeví popsaný typ kolonií nebo jestliže ověřovací biochemické zkoušky jsou negativní.

Růstové a selektivní vlastnosti půd a validita zkoušky

Dále uvedené zkoušky se provedou nejméně u každé šarže dehydrované živné půdy.

Postupuje se následujícím způsobem. Dále uvedené zkušební kmeny se 18 h až 24 h kultivují samostatně ve zkumavkách obsahujících vhodné tekuté půdy při 30 °C až 35 °C:

Staphylococcus aureus	např. ATCC 6538 (NCIMB 9518, CIP 4.83, CCM 4516, CNCTC Mau 29/58): tekutá půda A,
Pseudomonas aeruginosa	např. ATCC 9027 (NCIMB 8626, CIP 82.118, CCM 1961, CNCTC Ps 37/65): tekutá půda A,
Escherichia coli	např. ATCC 8739 (NCIMB 8545, CIP 53.126, CCM 4517): tekutá půda A,
Salmonella typhimurium	nedoporučuje se žádný určitý kmen (může se použít nějaká pro člověka nepatogenní salmonela, např. Salmonella abony (NCTC 6017, CIP 80.39, CCM 4518): tekutá půda A.

Část každé kultury se zředí tlumivým roztokem s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 tak, aby suspenze obsahovala asi 1000 živých mikroorganismů v 1 ml. Smíchají se stejné díly od všech suspenzí a použije se 0,4 ml (přibližně 100 mikroorganismů od každého kmene) jako inokulum ve zkouškách na S. aureus, Ps. aeruginosa, E. coli a na Salmonelly, a to za přítomnosti i nepřítomnosti zkoušeného výrobku. Pro příslušné mikroorganismy se dosáhne pozitivního výsledku.

Klostridie

Dále popsané zkoušky jsou určeny pro vymezené účely. První metoda je určena pro výrobky, u nichž je nezbytné vyloučit přítomnost patogenních klostridií, a které je proto nutno zkoušet na jejich nepřítomnost. Tyto výrobky mají obecně nízký celkový počet mikroorganismů. Druhá metoda je semikvantitativním stanovením Clostridium perfringens a je určena pro výrobky, kde množství tohoto druhu je kritériem jejich kvality.

1. Zkouška na klostridie.

Zkoušený výrobek se zpracuje tak, jak je popsáno ve stati 2.6.72. Připraví se dvě stejné dávky, odpovídající 1 g nebo 1 ml zkoušeného výrobku. Jedna dávka se zahřívá 10 min při 80 °C a potom se rychle ochladí. Druhá dávka se nezahřívá. Po protřepání se z obou dávek naočkuje po 10 ml do dvou zkumavek (38 mm × 200 mm) nebo do jiných vhodných nádob obsahujících 100 ml živné půdy P. Inkubuje se za anaerobních podmínek 48 h při 35 °C až 37 °C. Po inkubaci se obě zkumavky vyočkují na tekutou půdu Q, do níž byl přidán gentamicin a inkubují se opět za anaerobních podmínek 48 h při 35 °C až 37 °C. Výrobek vyhovuje, jestliže není pozorován růst mikroorganismů.

Je-li pozorován růst, přeočkuje se každá odlišná kolonie na tekutou půdu Q bez gentamicinu a inkubuje se za aerobních a anaerobních podmínek. Dojde-li jenom k anaerobnímu růstu grampozitivních tyčinek (s endosporami nebo bez nich) s negativní katalasovou reakcí, indikuje to přítomnost rodu Clostridium. Je-li to nutné, porovná se růst kolonií na obou plotnách a použije se katalasová zkouška k vyloučení aerobních a fakultativně anaerobních druhů rodu Bacillus, které dávají pozitivní katalasovou reakci. Tato zkouška může být provedena na rozlišení stejných kolonií na agarové půdě nebo nepřímo po přenesení kolonie na podložní sklíčko přidáním kapky peroxidu vodíku zředěného RS. Tvorba bublinek plynu indikuje pozitivní katalasovou reakci.

1. Stanovení počtu Clostridium perfringens

Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno ve stati 2.6.12 a připraví se ještě stonásobné a tisícinásobné zředění v tlumivém roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0. Stanoví se nejpravděpodobnější počet bakterií, jak je uvedeno při stanovení celkového počtu živých aerobních mikroorganismů (2.6.12) za použití živné půdy R ve zkumavkách nebo jiných vhodných nádobách s malou Durhamovou zkumavkou. Opatrně se promíchá a inkubuje se 24 h až 48 h při 45,5 °C až 46,5 °C. Zkumavky, které zčernají od sirníku železitého a v nichž je Durhamova zkumavka naplněna plynem (nejméně v jedné desetině objemu), indikují přítomnost Clostridium perfringens. Nejpravděpodobnější počet Cl. perfringens se odečte z tabulky 2.6.12-1.

Ke kontrole se použijí tyto kmeny:

pro 1. metodu: Clostridium sporogenes,	např. ATCC 19404 (NCTC 532, CIP 79.3, CCM 4409, CNCTC Cl 66/79),
pro 2. metodu: Clostridium perfringens,	např. ATCC 13124 (NCIMB 6125, NCTC 8237, CIP 103 409, CCM 4435, CNCTC Cl 68/83).

Je-li to nutné, použije se Clostridium sporogenes ke kontrole selektivity a anaerobních podmínek.

Následující část se uvádí pro informaci a jako vodítko, ale netvoří závaznou část lékopisu.

Doporučené živné půdy a roztoky

Následující roztok a živné půdy byly shledány dostatečnými pro účely, pro které jsou v lékopise předepsány pro zkoušku na mikrobiální znečištění. Mohou se použít jiné půdy, mají-li podobné výživné a selektivní vlastnosti pro mikroorganismy, na které se má zkoušet.

Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0

dihydrogenfosforečnan draselný	3,6 g
hydrogenfosforečnan sodný dihydrát	7,2 g, odpovídá 0,067 mol/l fosforečnanu
chlorid sodný	4,3 g
pepton (z masa nebo kaseinu)	1,0 g
voda 1000 ml

Mohou se přidat povrchově aktivní látky nebo látky inaktivující protimikrobní účinek, jako např.:

polysorbát 80	1 g/l až 10 g/l.

Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)

pankreatický hydrolyzát kaseinu	17,0 g
papainový hydrolyzát sóji	3,0 g
chlorid sodný	5,0 g
hydrogenfosforečnan draselný	2,5 g
glukosa monohydrát	2,5 g
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)

pankreatický hydrolyzát kaseinu	15,0 g
papainový hydrolyzát sóji	5,0 g
chlorid sodný	5,0 g
agar	15,0 g
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky)

pepton (z masa a kaseinu)	10,0 g
glukosa monohydrát	40,0 g
agar	15,0 g
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 5,6 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C. Bezprostředně před použitím se přidá 0,10 g sodné soli benzylpenicillinu a 0,10 g tetracyklinu na 1 l půdy ve formě sterilního roztoku, nebo se přidá 50 mg chloramfenikolu na 1 l půdy před sterilizací.

Tekutá půda D (laktosová půda)

masový výtažek	3,0 g
pankreatický hydrolyzát želatiny	5,0 g
laktosa monohydrát	5,0 g
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,9 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C a ihned se ochladí.

Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae)

pankreatický hydrolyzát želatiny	10,0 g
glukosa monohydrát	5,0 g
sušená hovězí žluč	20,0 g
dihydrogenfosforečnan draselný	3,0 g
hydrogenfosforečnan sodný dihydrát	8,0 g
zeleň brilantní	15 mg
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,2 ± 0,2. Zahřívá se 30 min při 100 °C a ihned se ochladí.

Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, violetí krystalovou a červení neutrální)

kvasničný výtažek	3,0 g
pankreatický hydrolyzát želatiny	7,0 g
žlučové soli	1,5 g
laktosa monohydrát	10,0 g
chlorid sodný	5,0 g
glukosa monohydrát	10,0 g
agar	15,0 g
červeň neutrální	30 mg
violeť krystalová	2 mg
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,4 ± 0,2. Zahřeje se k varu; nelze zahřívat v autoklávu.

Tekutá půda G (MacConkeyova půda)

pankreatický hydrolyzát želatiny	20,0 g
laktosa monohydrát	10,0 g
sušená hovězí žluč	5,0 g
červeň bromkresolová	10 g
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda H (MacConkeyův agar)

pankreatický hydrolyzát želatiny	17,0 g
pepton (z masa a kaseinu)	3,0 g
laktosa monohydrát	10,0 g
chlorid sodný	5,0 g
žlučové soli	1,5 g
agar	13,5 g
červeň neutrální	30,0 mg
violeť krystalová	1 mg
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,1 ± 0,2. Za stálého třepání se povaří 1 min a pak se sterilizuje 15 min v autoklávu při 121 °C.

Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a zelení brilantní)

pepton	8,6 g
sušená hovězí žluč	8,0 g
chlorid sodný	6,4 g
uhličitan vápenatý	20,0 g
tetrathionan draselný	20,0 g
zeleň brilantní	70 mg
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby bylo po zahřátí 7,0 ± 0,2. Zahřeje se právě k varu. Nelze opakovaně zahřívat.

Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar)

masový výtažek	10,0 g
pepton z masa	10,0 g
laktosa monohydrát	10,0 g
citronan sodný	20,0 g
citronan železitý	1.0 g
deoxycholan sodný	5,0 g
agar	13,5 g
červeň neutrální	20 mg
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,3 ± 0,2. Zahřívá se opatrně k varu a povaří se 1 min. Ochladí se na 50 °C a rozplní do Petriho misek. Nelze zahřívat v autoklávu.

Agarová půda K (deoxycholanový agar s xylosou a lysinem)

xylosa	3,5 g
1-lysin	5,0 g
laktosa monohydrát	7,5 g
sacharosa	7,5 g
chlorid sodný	5,0 g
kvasničný výtažek	3,0 g
červeň fenolová	80 mg
agar	13,5 g
desoxycholan sodný	2,5 g
thiosíran sodný	6,8 g
citronan amonno-železitý	0,8 g
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,4 ± 0,2. Zahřeje se k varu, ochladí na 50 °C a rozplní se do Petriho misek. Nelze zahřívat v autoklávu.

Agarová půda L (agar se zelení brilantní, červení fenolovou, laktosou a sacharosou)

pepton (z masa a kaseinu)	10,0 g
kvasničný výtažek	3,0 g
chlorid sodný	5,0 g
laktosa monohydrát	10,0 g
sacharosa	10,0 g
agar	20,0 g
červeň fenolová	80 mg
zeleň brilantní	12,5 mg
voda	1000 ml

Povaří se 1 min. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,9 ± 0,2. Bezprostředně před použitím se sterilizuje 15 min v autoklávu při 121 °C, ochladí se na 50 °C a rozplní se do Petriho misek.

Agarová půda M (agarová půda se třemi cukry a železem)

masový výtažek	3,0 g
kvasničný výtažek	3,0 g
pepton (z masa a kaseinu)	20,0 g
chlorid sodný	5,0 g
laktosa monohydrát	10,0 g
sacharosa	10,0 g
glukosa monohydrát	1,0 g
citronan amonno-železitý	0,3 g
thiosíran sodný	0,3 g
červeň fenolová	25 mg
agar	12,0 g
voda	1000 ml

Za stálého třepáni se zahřeje a 1 min se povaří. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,4 ± 0,2. Rozplní se do zkumavek do 1/3 jejich výšky, sterilizuje se v autoklávu 15 min při 121 °C a ochladí se v takové poloze, při které má půda dostatečnou hloubku a šikmý povrch.

Agarová půda N (cetrimidový agar)

pankreatický hydrolyzát želatiny	20,0 g
chlorid hořečnatý	1,4 g
síran draselný	10,0 g
cetrimid	0,3 g
agar	13,6 g
voda	1000 ml
glycerol	10,0 ml

Za stálého třepáni se zahřeje a 1 min se povaří. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,2 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda O (Baird-Parkerův agar)

pankreatický hydrolyzát kaseinu	10,0 g
masový výtažek	5,0 g
kvasničný výtažek	1,0 g
chlorid lithný	5,0 g
agar	20,0 g
glycin	12,0 g
pyruvan sodný	10,0 g
voda	950 ml

Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,8 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C, ochladí na 45 °C až 50 °C a přidá 10 ml sterilního roztoku teluričitanu draselného (10 g/l) a 50 ml emulze vaječného žloutku.

Živná půda P (obohacená půda pro klostridia)

masový výtažek	10,0 g
pepton	10,0 g
kvasničný výtažek	3,0 g
rozpustný škrob	1,0 g
glukosa monohydrát	5,0 g
cysteiniumchlorid	0,5 g
chlorid sodný	5,0 g
octan sodný	3,0 g
agar	0,5 g
voda	1000 ml

Agar se nechá nabobtnat a rozpustí se zahřátím k varu za stálého míchání. Je-li třeba, upraví se pH tak, aby po sterilizaci bylo asi 6,8. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Půda Q (Columbia agar)

pankreatický hydrolyzát kaseinu	10,0 g
peptický hydrolyzát masa	5,0 g
pankreatický hydrolyzát srdce	3,0 g
kvasničný výtažek	5,0 g
kukuřičný škrob	1,0 g
chlorid sodný	5,0 g
agar podle schopnosti tvořit gel	10,0 až 15,0 g
voda	1000 ml

Agar se nechá nabobtnat a rozpustí se zahřátím k varu za stálého míchání. Je-li třeba, upraví se pH tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C. Ochladí se na 45 °C až 50 °C; je-li třeba, přidá se gentamiciniumsulfat v množství odpovídajícím 20 mg báze gentamicinu a rozplní se do Petriho misek.

Půda R (laktoso-siřičitanová půda)

pankreatický hydrolyzát kaseinu	5,0 g
kvasničný výtažek	2,5 g
chlorid sodný	2,5 g
laktosa monohydrát	10,0 g
cysteiniumchlorid	0,3 g
voda	1000 ml

Po rozpuštění se upraví pH na 7,1 ±0,1 a rozplní se po 8 ml do zkumavek délky 160 mm a průměru 16 mm a obsahujících malou Durhamovu zkumavku. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C a uchovává se při 4 °C. Před použitím se půda zahřívá 5 min ve vodní lázni a ochladí se. Do každé zkumavky se přidá 0,5 ml roztoku disiřičitanu sodného (12 g/l) a 0,5 ml roztoku citronanu amonno-železitého (10 g/l). Oba roztoky se připraví v čas potřeby a filtrují se přes membránový filtr (0,45 μm).

Neutralizační činidla

Neutralizační činidla se mohou použít k neutralizaci protimikrobních účinků. Mohou se přidat k tlumivému roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0, přednostně před sterilizací. Jestliže se používají, prokáže se jejich účinnost a že nejsou pro mikroorganismy toxické.

Typický neutralizační roztok má následující složení:

polysorbát 80	30 g
lecitin vaječný	3g
histidiniumchlorid	1g
pepton (z masa nebo kaseinu)	1g
chlorid sodný	4,3 g
dihydrogenfosforečnan draselný	3,6 g
hydrogenfosforečnan sodný dihydrát	7,2 g
voda	1000 ml

Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Pokud má roztok nedostatečnou neutralizační schopnost, může se zvýšit množství polysorbátu 80 nebo lecitinu. Jako alternativa se mohou přidat inaktivující látky uvedené v tabulce 2.6.13-2.

Tab. 2.6.13-2 Látky inaktivující protimikrobní účinky, které se mohou přidat k tlumivému roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0

Typ protimikrobní látky	Inaktivující látka	Koncentrace	Poznámka
fenoly	laurylsíran sodný	4 g/l	přidává se po sterilizaci tlumivého roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0
polysorbát 80 a lecitin	30 g/l a 3 g/l
vaječný žloutek	5 ml/l až 50 ml/l
organické sloučeniny rtuti	thioglykolan sodný	0,5 g/l až 5 g/l
halogeny	thiosíran sodný	5g/l
kvartérní amoniové sloučeniny	vaječný žloutek	5 ml/l až 50 ml/l	přidává se po sterilizaci tlumivého roztoku s chloridem sodným a s pepto- nem o pH 7,0

“

1. V příloze části 2 Zkušební metody, kapitola 2.8 Farmakognostické metody, se za kapitolu 2.8.13 doplňuje kapitola 2.8.14, která zní:

„

2.8.14 Stanovení tříslovin v rostlinných drogách [image omitted]

Všechny extrakční a ředicí postupy se provádějí za ochrany před světlem

Rostlinné drogy nebo suché extrakty. Předepsané množství práškované drogy (180) nebo extraktu se v 250ml baňce s kulatým dnem smíchá se 150 ml vody R a zahřívá se 30 min na vodní lázni. Ochladí se pod tekoucí vodou a směs se převede kvantitativně do 250ml odměrné baňky. Baňka s kulatým dnem se promyje vodou R, promývací tekutina se přidá k filtrátu v odměrné baňce a zředí se vodou R na 250,0 ml. Po usazení částic drogy se tekutina zfiltruje filtračním papírem o průměru 125 mm. Prvních 50 ml filtrátu se odstraní.

Tekuté extrakty nebo tinktury. Předepsané množství tekutého extraktu nebo tinktury se zředí vodou R na 250,0 ml. Směs se zfiltruje filtračním papírem o průměru 125 mm. Prvních 50 ml filtrátu se odstraní.

Celkové polyfenoly. 5,0 ml filtrátu se zředí vodou R na 25,0 ml. 2,0 ml tohoto roztoku se smíchají s 1,0 ml zkoumadla fosfomolybdenan-wolframového R, 10,0 ml vody R a zředí se roztokem uhličitanu sodného R (290 g/l) na 25,0 ml. Po 30 min po přidání posledního roztoku se měří absorbance (2.2.25) při 760 nm (A1) za použití vody R jako kontrolní tekutiny.

Polyfenoly neadsorbovatelné na kožní prášek K 10,0 ml filtrátu se přidá 0,10 g kožního prášku CRL a intenzivně se protřepává 60 min, pak se zfiltruje. 5,0 ml filtrátu se zředí vodou R na 25,0 ml. 2,0 ml tohoto filtrátu se smíchají s 1,0 ml zkoumadla fosfomolybdenan-wolframového R, 10,0 ml vody R a zředí se roztokem uhličitanu sodného R (290 g/l) na 25,0 ml. Po 30 min po přidání posledního roztoku se měří absorbance (2.2.25) při 760 nm (A2) za použití vody R jako kontrolní tekutiny.

Porovnávací roztok. 50,0 mg pyrogallolu R se bezprostředně před použitím rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100,0 ml. 5,0 ml filtrátu se zředí vodou R na 100,0 ml. 2,0 ml tohoto filtrátu se smíchají s 1,0 ml zkoumadla fosfomolybdenan-wolfranového R, 10,0 ml vody R a zředí se roztokem uhličitanu sodného R (290 g/l) na 25,0 ml. Po 30 min po přidání posledního roztoku se měří absorbance (2.2.25) při 760 nm (A3) za použití vody R jako kontrolní tekutiny.

Obsah tříslovin v procentech vyjádřený jako pyrogallol se vypočítá podle vzorce:

62,5.A1-A2.m2A3.m1,

němž značí:

m1 - hmotnost zkoušené látky v gramech,

m2 - hmotnost pyrogallolu v gramech.

“

1. V příloze části 2 Zkušební metody, kapitola 2.9 Metody farmaceutické technologie, kapitola 2.9.7 zní:

„

2.9.7 Oděr neobalených tablet [image omitted]

Podstata zkoušky. Oděrem se rozumí poškození neobalených tablet mechanickým namáháním za definovaných podmínek, při kterém jsou vystaveny vzájemnému odírání, nárazům a pádům, čímž dochází k narušování jejich povrchu, lámání nebo štěpení tablet.

Přístroj. Používá se bubínek, viz obr. 2.9.7-1, o vnitřním průměru v rozmezí 283 mm až 291 mm a hloubce v rozmezí 36 mm až 40 mm, zhotovený z průhledného plastu s hladkým vnitřním povrchem, který nevyvolává statickou elektřinu, a jedna strana bubínku je odnímatelná. Tablety klouzají a převalují se při každé otáčce bubínku po přepážce se zakřivením o vnitřním průměru 75,5 mm až 85,5 mm. Přepážka vede ze středu bubínku k jeho vnější stěně. Bubínek je ve středu připevněn k vodorovné hřídeli pohonu, který zabezpečuje otáčení bubínku 25 ±1 otáčka za min. Tablety pak při každé otáčce bubínku klouzají nebo se převalují po přepážce a padají na stěnu bubínku nebo narážejí navzájem na sebe.

Obr. 2.9.7-1

[image omitted]

Obr. 2.9.7-1 Otočný bubínek (rozměry v milimetrech)

Postup zkoušky. Pro tablety do hmotnosti 0,65 g/ks včetně se jako zkoušený vzorek bere 20 tablet, pro tablety o hmotnosti větší než 0,65 g/ks je zkoušený vzorek 10 tablet. Z tablet se na sítu č. 1000 odstraní volný prach třením jemným kartáčkem nebo profouknutím tlakovým vzduchem. Tablety se potom přesně zváží, umístí do bubínku a spustí se otáčení. Po 100 otáčkách bubínku se tablety vyjmou a odstraní se z nich volný prach stejným způsobem, jak je popsáno výše. Pokud není žádná tableta rozbita, rozlomena nebo její větší část odštípnuta, zváží se tablety s přesností na miligramy.

U tablet o průměru 13 mm a větším se může vyskytnout problém s reprodukovatelností výsledků díky častému nepravidelnému pohybu tablet. Některé tablety se mohou dotýkat a navzájem se chránit před volným pádem v bubínku. V těchto případech se vyhovujících reprodukovatelných výsledků dosáhne nakloněním bubínku. Obvykle dostatečné je takové nastavení, že osa tvoří úhel 10° se základnou.

Hodnocení. Oděr tablet se vyjadřuje jako procentuální úbytek výchozí hmotnosti tablet. Zaznamená se počet zkoušených tablet.

Obvykle se zkouška provádí jednou. Pokud nejsou výsledky jednoznačné nebo pokud je úbytek hmotnosti tablet větší než 1 %, opakuje se zkouška dvakrát a stanovuje se průměr ze všech tří zkoušek. Úbytek hmotnosti zkoušených tablet nejvýše do 1 % se pro většinu přípravků považuje za vyhovující výsledek.

“

1. V příloze části 2 Zkušební metody, kapitola 2.9 Metody farmaceutické technologie, kapitola 2.9.18 a kapitola 2.9.19 znějí:

„

2.9.18 Přípravky k inhalaci: aerodynamické stanovení jemných částic [image omitted]

Podstata zkoušky. Zkouškou se stanovují jemné částice charakterizující obláčky aerosolů vytvářené přípravky k inhalaci.

Pokud není uvedeno a schváleno jinak, použijí se ke zkoušce níže uvedené přístroje a zkušební postupy.

PŘÍSTROJ A (SKLENĚNÝ ODLUČOVAČ ČÁSTIC)

Přístroj je vyobrazen na obrázku 2.9.18-1 (viz také tabulka 2.9.18-1).

[image omitted]

Obr. 2.9.18-1 Přístroj A pro aerodynamické stanovení jemných částic. Rozměry v milimetrech (tolerance ±1 mm, není-li uvedeno jinak).

Tab. 2.9.18-1 Specifikace dílů k obrázkům 2.9.18-1/3

Označení	Předmět	Popis	Rozměry *)
A	nástavec pro aplikátor	tvarovaný gumový nástavec pro zasunutí aplikátoru s ventilem
B	vstupní hrdlo	upravená baňka s kulatým dnem	50 ml
vstupní otvor se zábrusem	29/32
kónická výpust se zábrusem	24/29
C	spojovací hrdlo	tvarovaný skleněný nástavec
vstupní otvor se zábrusem	24/29
kónická výpust se zábrusem	24/29
spodní část výpusti ve tvaru trubičky o vybrané světlosti
vnitřní průměr	14
tenkostěnná skleněná trubička
vnější průměr	17
D	horní odlučovací komora	upravená baňka s kulatým dnem	100 ml
vstupní otvor se zábrusem	24/29
kónická výpust se zábrusem	24/29
E	spojovací trubička	středně silná skleněná trubička
skleněný kónický zábrus	14/23
ohnutý a horní svislý díl
vnější průměr	13
spodní svislý díl
vnější průměr	8
F	šroubový uzávěr, postranní rameno s nástavcem	plastický šroubový uzávěr	28/13
silikonový gumový kroužek	28/11
podložka z PTFE	28/11
skleněný závit, velikost závitu	28
postranní výpust k odsávacímu zařízení
minimální průměr otvoru	5
G	soubor spodní trysky	upravený polypropylenový držák filtru spojený se spodní svislou částí spojovací trubice pomocí spojky z PTFE	viz obr. 2.9.18-1
acetalová kruhová destička s otvory pro 4 trysky sestavené v kruhu o průměru 5,3 mm okolo rozpěrné vložky
průměr vložky	10
výstupek vložky	2
	2
H	spodní odlučovací komora	kónická baňka	250 ml
vstupní otvor se zábrusem	24/29

*) Rozměry v milimetrech, není-li uvedeno jinak.

Postup pro rozprašovače

Do horní odlučovací komory se odměří 7 ml, do dolní 30 ml vhodného rozpouštědla.

Všechny součásti přístroje se spojí a ověří se, zda je řádně upevněný přístroj ve svislé poloze a zda se rozpěrná vložka trysky dolní tryskové soustavy právě dotýká dna spodní odlučovací komory. K výpusti přístroje se připojí vhodné odsávací zařízení opatřené filtrem o přiměřené velikosti pórů a průtok vzduchu přístrojem se upraví tak, aby na přívodu protékalo hrdlem (60 ± 5) l/min vzduchu.

Nádržka rozprašovače se naplní tekutým přípravkem k inhalaci a pomocí nástavce (adaptéru) se k přístroji připojí k tomu uzpůsobený aplikátor.

Pak se zapne odsávací zařízení a po 10 s i rozprašovač. Není-li uvedeno jinak, rozprašovač se po 60 s vypne, počká se asi 5 s a pak se vypne i odsávací zařízení přístroje. Potom se přístroj rozebere a po omytí vnitřního povrchu horní odlučovací komory se promývací tekutina převede do odměrné banky. Pak se omyje vnitřní povrch spodní odlučovací komory a promývací tekutina se převede do jiné odměrné baňky. Nakonec se promyje filtr před odsávacím zařízením a jeho spojení s dolní odlučovací komorou a takto získaná tekutina se připojí k promývací tekutině získané promytím spodní odlučovací komory. V každé z obou baněk s promývací tekutinou se stanoví obsah léčivé látky. Výsledky získané z obou částí přístroje se samostatně vyjádří v procentech vztažených na celkové množství léčivé látky.

Postup pro tlakové inhalátory

Nástavec (adaptér) pro připojení tlakového ventilu se posune ke konci hrdla, takže když se aplikátor ventilu zasune do hloubky asi 10 mm, má souhlasnou polohu s vodorovnou osou hrdla a konec ventilu s tlakovou nádobkou směřuje nahoru a shodně s celým přístrojem leží ve svislé rovině.

Do horní odlučovací komory se odměří 7 ml, do dolní 30 ml vhodného rozpouštědla.

Všechny součásti přístroje se spojí a ověří se, zda je řádně upevněný přístroj ve svislé poloze a zda se rozpěrná vložka trysky dolní tryskové soustavy právě dotýká dna spodní odlučovací komory. K výpusti přístroje se připojí vhodné odsávací zařízení a průtok vzduchu přístrojem se upraví tak, aby na přívodu protékalo hrdlem (60 ± 5) l/min vzduchu.

Dávkovací ventil se připraví k činnosti tak, že se tlakovým inhalátorem třepe 5 s a jedna dávka se odstříkne. Nejdříve po 5 s se inhalátorem znovu třepe a opět se odstříkne jedna dávka. To se opakuje ještě třikrát.

Pak se třepe asi 5 s, zapne se odsávací zařízení a po zasunutí aplikátoru nasazeného na ventil do nástavce (adaptéru) se hned vystříkne jedna dávka. Sestavený inhalátor se potom oddělí od nástavce, třepe se jím nejméně 5 s, znovu se zakončení aplikátoru spolu s ventilem vrátí do nástavce a opět se vystříkne jedna dávka. Postup při vystřikování jednotlivých dávek se zopakuje ještě osmkrát, přičemž se pokaždé před vystříknutím dávky třepe inhalátorem. Po vystříknutí desáté dávky se čeká nejméně 5 s a odsávací zařízení se vypne. Potom se přístroj rozebere.

Vnitřní povrch přívodní trubice do horní odlučovací komory a její vnější povrch zasahující do komory se omyjí vhodným rozpouštědlem a promývací tekutina se shromáždí v dolní odlučovací komoře. V tomto roztoku se stanoví obsah účinné složky. Vypočte se množství účinné složky shromážděné v dolní odlučovací komoře po uvedení ventilu v činnost a výsledky se vyjádří v procentech vztažených na dávku uvedenou na obalu.

Postup pro inhalátory prášku

Do horní odlučovací komory se odměří 7 ml, do dolní 30 ml vhodného rozpouštědla.

Všechny součásti přístroje se spojí a ověří se, zda je řádně upevněný přístroj ve svislé poloze a zda se rozpěrná vložka trysky dolní tryskové soustavy právě dotýká dna spodní odlučovací komory. Aniž by se na přístroj nasadil inhalátor, připojí se k výpusti přístroje vhodné odsávací zařízení a průtok vzduchu přístrojem se upraví tak, aby na přívodu protékalo hrdlem (60 ± 5) l/min vzduchu.

Inhalátor se připraví k použití a pomocí vhodného spojovacího nástavce se k přístroji připojí aplikátor inhalátoru. Pak se na 5 s zapne odsávací zařízení. Po vypnutí odsávacího zařízení se inhalátor vyjme. Vefouknutí se opakuje ještě devětkrát a potom se přístroj rozebere.

Vnitřní povrch přívodní trubice do dolní odlučovací komory a její vnější povrch zasahující do komory se omyjí vhodným rozpouštědlem, promývací tekutina se shromáždí v dolní odlučovací komoře a v roztoku se stanoví obsah léčivé látky. Vypočte se množství léčivé látky shromážděné po vystříknutí v dolní odlučovací komoře a výsledky se vyjádří v procentech vztažených na dávku uvedenou na obalu.

PŘÍSTROJ B (KOVOVÝ ODLUČOVAČ ČÁSTIC)

Přístroj je vyobrazen na obrázcích 2.9.18-2/3.

[image omitted]

Obr. 2.9.18-2 Přístroj B pro aerodynamické stanovení jemných částic (rozměry v milimetrech)

A - tlaková nádobka inhalátoru

B - aplikátor

C - spojovací nástavec (adaptér)

D -hrdlo

E - tryska

F - odlučovací komora

G - kotouč ze slinutého skla (BS porozita č. 1)

H - upevnění filtru z nerezavějící oceli

J - skleněná filtrační sestava

K - odsávací zařízení (vakuová vývěva)

Čtení tohoto dokumentu nenahrazuje čtení příslušného vydání Sbírky zákonů. Neneseme odpovědnost za případné nepřesnosti vyplývající z převodu originálu do tohoto formátu.

Tento text je zveřejněn za vlastních podmínek opětovného použití zdroje e-Sbírka, nikoli pod licencí Legalize ani pod licencí volného díla. e-Sbírka
volné dílo (úřední díla podle § 3 písm. a) zákona č. 121/2000 Sb., autorského zákona)