Προεδρικά Διατάγματα — ΦΕΚ A' 137/2007

Τις διατάξεις

Την υπ’ αριθμ. Υ 132/11.10.2004 (B΄ 1533) κοινή απόφαση του Πρωθυπουργού και του Υπουργού Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων «Ανάθεση αρμοδιοτήτων στον Υφυπουργό Αγροτικής Ανάπτυξης Αλέξανδρο Κοντό.»

Το γεγονός ότι από τις διατάξεις του παρόντος διατάγματος δεν προκαλείται δαπάνη σε βάρος του Κρατικού Προϋπολογισμού.

Την υπ’ αριθμ. 78/2007 γνωμοδότηση του Συμβουλίου της Επικρατείας μετά από πρόταση του Υπουργού Οικονομίας και Οικονομικών και του Υφυπουργού Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων, αποφασίζουμε:

Σχήμα ανίχνευσης για τη διάγνωση της καστανής σήψης και της βακτηριακής μάρανσης (Ralstonia solanacearum) σε κονδύλους πατάτας και φυτά πατάτας, τομάτας ή άλλα φυτά ξενιστές που παρουσιάζουν συμπτώματα καστανής σήψης ή βακτηριακής μάρανσης. Η διαδικασία εξέτασης προορίζεται για κονδύλους και φυτά πατάτας που παρουσιάζουν τυπικά ή ύποπτα συμπτώματα της καστανής σήψης ή μαρασμού των φυτών. Η διαδικασία περιλαμβάνει μία δοκιμή ταχείας διαλογής, απομόνωση του παθογόνου αιτίου από μολυσμένο αγγειώδη ιστό σε (εκλεκτικά) υλικά και, σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος, ταυτοποίηση της καλλιέργειας ως Ralstonia solanacearum. κονδύλων πατάτας Αρχή: Η διαδικασία εξέτασης αποσκοπεί στην ανίχνευση μολύνσεων σε λανθάνουσα μορφή σε κονδύλους πατάτας. Το θετικό αποτέλεσμα τουλάχιστον δύο δοκιμών διαλογής(3) που βασίζεται σε διαφορετικές βιολογικές αρχές, πρέπει να συμπληρώνεται με την απομόνωση του παθογόνου· ακολουθεί δε, στην περίπτωση απομόνωσης τυπικών αποικιών, επιβεβαίωση μιας καθαρής καλλιέργειας ως καλλιέργειας R. solanacearum. Το θετικό αποτέλεσμα μίας μόνον δοκιμής διαλογής δεν επαρκεί για να θεωρηθεί το δείγμα ύποπτο. Οι δοκιμές διαλογής και οι δοκιμές απομόνωσης πρέπει να επιτρέπουν την ανίχνευση 103 έως 104 κυττάρων/ ml αιωρήματος του ιζήματος, συμπεριλαμβανομένων ως θετικών μαρτύρων σε κάθε σειρά δοκιμών. 01001372206070036 1 ) ǺȜȑʌİ İȞȩIJȘIJĮ III.2.1. ȖȚĮ IJĮ ıȣȞȚıIJȫȝİȞĮ ȝİȖȑșȘ įİȚȖȝȐIJȦȞ. 2 ) ȅȚ ȝȑșȠįȠȚ İȟĮȖȦȖȒȢ țĮȚ ıȣȖțȑȞIJȡȦıȘȢ IJȠȣ ʌĮșȠȖȩȞȠȣ ʌİȡȚȖȡȐijȠȞIJĮȚ ıIJȘȞ İȞȩIJȘIJĮ III.2.1. 3 ) ȈIJȘȞ ʌİȡȓʌIJȦıȘ ʌȠȣ įȪȠ IJȠȣȜȐȤȚıIJȠȞ įȠțȚȝȑȢ ȝİ ȕȐıȘ įȚĮijȠȡİIJȚțȑȢ ȕȚȠȜȠȖȚțȑȢ ĮȡȤȑȢ İȓȞĮȚ șİIJȚțȑȢ, ʌȡȑʌİȚ ȞĮ įȚİȟĮȤșİȓ ĮʌȠȝȩȞȦıȘ țĮȚ İʌȚȕİȕĮȓȦıȘ. ȆȡĮȖȝĮIJȠʌȠȚİȓIJĮȚ IJȠȣȜȐȤȚıIJȠȞ ȝȓĮ įȠțȚȝȒ įȚĮȜȠȖȒȢ. ȈIJȘȞ ʌİȡȓʌIJȦıȘ ʌȠȣ Ș İȞ ȜȩȖȦ įȠțȚȝȒ İȓȞĮȚ ĮȡȞȘIJȚțȒ, IJȠ įİȓȖȝĮ șİȦȡİȓIJĮȚ ĮȡȞȘIJȚțȩ. ȈIJȘȞ ʌİȡȓʌIJȦıȘ ʌȠȣ Ș İȞ ȜȩȖȦ įȠțȚȝȒ İȓȞĮȚ șİIJȚțȒ, ĮʌĮȚIJİȓIJĮȚ Ș įȚİȞȑȡȖİȚĮ įİȪIJİȡȘȢ Ȓ ʌİȡȚııȠIJȑȡȦȞ įȠțȚȝȫȞ įȚĮȜȠȖȒȢ ȝİ ȕȐıȘ įȚĮijȠȡİIJȚțȑȢ ȕȚȠȜȠȖȚțȑȢ ĮȡȤȑȢ ȑIJıȚ ȫıIJİ ȞĮ İʌȚȕİȕĮȚȦșİȓ IJȠ ʌȡȫIJȠ șİIJȚțȩ ĮʌȠIJȑȜİıȝĮ. ǼȐȞ Ș įİȪIJİȡȘ Ȓ ȐȜȜİȢ įȠțȚȝȑȢ İȓȞĮȚ ĮȡȞȘIJȚțȑȢ, IJȠ įİȓȖȝĮ șİȦȡİȓIJĮȚ ĮȡȞȘIJȚțȩ. ǻİȞ İȓȞĮȚ ĮʌĮȡĮȓIJȘIJİȢ ʌİȡĮȚIJȑȡȦ įȠțȚȝȑȢ. 4 ) Ǿ įȠțȚȝȒ İțȜİțIJȚțȒȢ ĮʌȠȝȩȞȦıȘȢ ʌİȡȚȖȡȐijİIJĮȚ ıIJȘȞ İȞȩIJȘIJĮ VI.A.4. 5 ) Ǿ įȠțȚȝȒ IF ʌİȡȚȖȡȐijİIJĮȚ ıIJȘȞ İȞȩIJȘIJĮ VI.A.5. 6 ) ȅȚ įȠțȚȝȑȢ PCR ʌİȡȚȖȡȐijȠȞIJĮȚ ıIJȘȞ İȞȩIJȘIJĮ VI.A.6. 7 ) Ǿ įȠțȚȝȒ FISH ʌİȡȚȖȡȐijİIJĮȚ ıIJȘȞ İȞȩIJȘIJĮ VI.A.7. 8 ) ȅȚ įȠțȚȝȑȢ ELISA ʌİȡȚȖȡȐijȠȞIJĮȚ ıIJȘȞ İȞȩIJȘIJĮ VI.A.8. 9 ) Ǿ ȕȚȠįȠțȚȝȒ ʌİȡȚȖȡȐijİIJĮȚ ıIJȘȞ İȞȩIJȘIJĮ VI.A.9. 10) Ǿ IJȣʌȚțȒ ȝȠȡijȠȜȠȖȓĮ IJȦȞ ĮʌȠȚțȚȫȞ ʌİȡȚȖȡȐijİIJĮȚ ıIJȘȞ İȞȩIJȘIJĮ II.3.į. 11) Ǿ țĮȜȜȚȑȡȖİȚĮ Ȓ ȠȚ ȕȚȠįȠțȚȝȑȢ İȓȞĮȚ įȣȞĮIJȩȞ ȞĮ ĮʌȠIJȪȤȠȣȞ ȜȩȖȦ ĮȞIJĮȖȦȞȚıȝȠȪ Ȓ ʌĮȡİȝʌȩįȚıȘȢ Įʌȩ ıĮʌȡȠijȣIJȚțȐ ȕĮțIJȒȡȚĮ. ǼȐȞ ĮʌȠțIJȘșȠȪȞ șİIJȚțȐ ĮʌȠIJİȜȑıȝĮIJĮ ıIJȚȢ įȠțȚȝȑȢ įȚĮȜȠȖȒȢ ĮȜȜȐ IJĮ ĮʌȠIJİȜȑıȝĮIJĮ IJȦȞ įȠțȚȝȫȞ ĮʌȠȝȩȞȦıȘȢ İȓȞĮȚ ĮȡȞȘIJȚțȐ, ʌȡȑʌİȚ ȞĮ İʌĮȞĮȜȘijșȠȪȞ ȠȚ įȠțȚȝȑȢ ĮʌȠȝȩȞȦıȘȢ. 12) Ǿ ĮȟȚȩʌȚıIJȘ IJĮȣIJȠʌȠȓȘıȘ țĮșĮȡȫȞ ʌȚșĮȞȫȞ țĮȜȜȚİȡȖİȚȫȞ IJȠȣ R. solanacearum İʌȚIJȣȖȤȐȞİIJĮȚ ȝİ IJȘ ȤȡȒıȘ IJȦȞ įȠțȚȝȫȞ ʌȠȣ ʌİȡȚȖȡȐijȠȞIJĮȚ ıIJȘȞ İȞȩIJȘIJĮ VI.B. 13) Ǿ įȠțȚȝȒ ʌĮșȠȖȑȞİȚĮȢ ʌİȡȚȖȡȐijİIJĮȚ ıIJȘȞ İȞȩIJȘIJĮ VI.ī. ΦΕΚ 137 ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) 2997 solanacearum σε κονδύλους πατάτας και σε φυτά πατάτας, τομάτας Ή άλλα φυτά ξενιστές που παρουσιάζουν συμπτώματα καστανησ σήψης ή βακτηριακής μάρανσης

Συμπτώματα (βλέπε ιστοχώρο http://forum.europa. eu.int/Public/irc/sanco/Home/main) 1.1. Συμπτώματα στην πατάτα Στο φυτό πατάτας. Το αρχικό στάδιο της μόλυνσης στον αγρό αναγνωρίζεται από τον μαρασμό των φύλλων προς την κορυφή του φυτού σε υψηλές θερμοκρασίες κατά τη διάρκεια της ημέρας με ανάληψη κατά τη διάρκεια της νύχτας. Στα αρχικά στάδια της μάρανσης τα φύλλα παραμένουν πράσινα, αλλά αργότερα αναπτύσσεται κίτρινη και καστανή νέκρωση. Παρουσιάζεται επίσης επιναστία. Η μάρανση ενός βλαστού ή ολόκληρων των φυτών σύντομα καθίσταται μη αναστρέψιμη και έχει ως αποτέλεσμα την κατάρρευση και το θάνατο του φυτού. Ο αγγειώδης ιστός σε εγκαρσίως κομμένα στελέχη από μαραμένα φυτά συνήθως εμφανίζεται καστανός, και μία γαλακτώδης βακτηριακή εξίδρωση εκρέει από την κομμένη επιφάνεια, ή μπορεί να εξέλθει με συμπίεση. Όταν ένα κομμένο στέλεχος τοποθετηθεί κατακόρυφα μέσα σε νερό, από τις αγγειώδεις δέσμες εκρέουν κλωστές γλοιώδους υγρού. Στον κόνδυλο πατάτας. Οι κόνδυλοι πρέπει να κόβονται εγκαρσίως κοντά στο σημείο πρόσφυσης του στολονίου είτε κατά μήκος πάνω από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου. Το αρχικό στάδιο της ασθένειας αναγνωρίζεται από έναν υαλώδη κίτρινο προς ανοικτό καστανό, μεταχρωματισμό του αγγειώδους δακτυλίου από τον οποίο εκρέει αυθόρμητα μετά λίγα λεπτά ένα υπόλευκο βακτηριακό εξίδρωμα. Αργότερα, ο αγγειακός μεταχρωματισμός καθίσταται εντονότερα καστανός και η νέκρωση μπορεί να επεκταθεί στον παρεγχυματικό ιστό. Σε προχωρημένα στάδια της ασθένειας, η μόλυνση εκδηλώνεται εξωτερικά από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου και τους οφθαλμούς από τους οποίους μπορεί να εκρέει βακτηριακό γλοιώδες έκκριμα προκαλώντας την προσκόλληση σωματιδίων του εδάφους. Ενδέχεται να εμφανίζονται στην επιδερμίδα ερυθροκάστανες, ελαφρώς βυθισμένες κηλίδες λόγω της εσωτερικής κατάρρευσης των αγγειωδών ιστών. Η δευτερογενής ανάπτυξη μαλακών σήψεων από μύκητες ή βακτήρια είναι συχνή στα προχωρημένα στάδια της ασθένειας. 1.2. Συμπτώματα στην τομάτα Στο φυτό τομάτας. Το πρώτο ορατό σύμπτωμα είναι η έλλειψη σπαργής στα νεαρά φύλλα. Υπό περιβαλλοντικές συνθήκες που είναι ευνοϊκές για το παθογόνο (θερμοκρασία εδάφους περίπου 25°C, ατμόσφαιρα κορεσμένη σε υγρασία), μέσα σε λίγες μέρες εμφανίζεται επιναστία και μαρασμός της μιας πλευράς ή και ολόκληρου του φυτού, στη συνέχεια δε πλήρης κατάρρευση του φυτού. Υπό λιγότερο ευνοϊκές συνθήκες (θερμοκρασία εδάφους κάτω των 21°C), ο μαρασμός είναι λιγότερος αλλά μπορεί να αναπτύσσεται μεγάλος αριθμός τυχαίων ριζών επί του στελέχους. Είναι δυνατόν να παρατηρούνται βρεγμένες λωρίδες από τη βάση του στελέχους πράγμα που αποτελεί απόδειξη της νέκρωσης του αγγειακού συστήματος. Σε εγκάρσιες τομές του στελέχους, από τους καστανόχρωμα μεταχρωματισμένους αγγειακούς ιστούς εκρέει λευκή ή υποκίτρινη βακτηριακή εξίδρωση. 1.3. Συμπτώματα σε άλλους ξενιστές Φυτά Solanum dulcamara και S. nigrum. Σε φυσικές συνθήκες, σπανίως παρατηρούνται συμπτώματα μάρανσης στα εν λόγω ζιζάνια–ξενιστές, εκτός εάν οι θερμοκρασίες του εδάφους υπερβαίνουν τους 25°C ή τα επίπεδα του μολύσματος είναι εξαιρετικά υψηλά (π.χ. για το S. nigrum που αναπτύσσεται δίπλα σε προσβεβλημένα φυτά πατάτας ή τομάτας). Όταν εμφανίζεται μάρανση, τα συμπτώματα που παρατηρούνται είναι όμοια με αυτά που περιγράφονται για την τομάτα. Φυτά S. dulcamara που δεν έχουν υποστεί μαρασμό και τα οποία αναπτύσσονται με τα στελέχη και τις ρίζες σε νερό, ενδέχεται να εμφανίζουν απαλό καστανό εσωτερικό μεταχρωματισμό του αγγειώδους ιστού σε εγκάρσια τομή της βάσης του στελέχους ή τμημάτων του στελέχους κάτω από το νερό. Ενδέχεται να εκρέει βακτηριακή εξίδρωση από κομμένους αγγειώδεις ιστούς ή να εκρέουν κλωστές γλοιώδους υγρού εάν το κομμένο στέλεχος τοποθετηθεί κατακόρυφα μέσα σε νερό, ακόμη και εάν δεν υπάρχουν συμπτώματα μάρανσης.

Δοκιμές ταχείας διαλογής Οι δοκιμές ταχείας διαλογής είναι δυνατόν να διευκολύνουν την προκαταρκτική διάγνωση αλλά δεν είναι απόλυτα αναγκαίες. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί μία ή περισσότερες από τις ακόλουθες επικυρωμένες δοκιμές: 2.1. Δοκιμή εκκρίσεων από το στέλεχος (Βλέπε ενότητα VI.A.1.) 2.2. Ανίχνευση πολυ−β−υδροξυβουτυρικών (PHB) κοκκίων Τα χαρακτηριστικά κοκκία PHB στα κύτταρα του R. solanacearum καθίστανται ορατά διά χρώσεως λεπτών επιχρισμάτων (που έχουν προσηλωθεί με θερμότητα) βακτηριακού εξιδρώματος από προσβεβλημένο ιστό σε αντικειμενοφόρο πλάκα μικροσκοπίου με Nile Blue A ή Sudan Black (βλέπε ενότητα VI.A.2.). 2.3. Δοκιμές οροσυγκόλλησης (Βλέπε ενότητα VI.A.3.) 2.4. Άλλες δοκιμές Στις περαιτέρω κατάλληλες δοκιμές ταχείας διαλογής συμπεριλαμβάνεται η δοκιμή IF (βλέπε ενότητα VI.A.5.), η δοκιμή FISH (βλέπε ενότητα VI.A.7.), οι δοκιμές ELISA (βλέπε ενότητα VI.A.8.) και οι δοκιμές PCR (βλέπε ενότητα VI.A.6).

Διαδικασία απομόνωσης

Δοκιμές ταυτοποίησης του R. solanacearum Οι δοκιμές για την επιβεβαίωση της ταυτότητας των πιθανών απομονώσεων του R. solanacearum παρουσιάζονται στην ενότητα VI.B. ΕΝΟΤΗΤΑ ΙΙΙ

Λεπτομερείς μέθοδοι για την ανίχνευση και ταυτοποίηση του Ralstonia solanacearum σε δείγματα ασυμπτωματικών κονδύλων πατάτας 1.1. Προετοιμασία του δείγματος Σημείωση: ⎯ Το τυπικό μέγεθος δείγματος είναι 200 κόνδυλοι ανά δοκιμή. Για πιο εντατική δειγματοληψία απαιτούνται περισσότερες δοκιμές σε δείγματα του μεγέθους αυτού. Τυχόν μεγαλύτεροι αριθμοί κονδύλων στο δείγμα θα έχει ως αποτέλεσμα παρεμπόδιση ή δυσκολίες στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Η διαδικασία όμως μπορεί να εφαρμοσθεί και για δείγματα μικρότερα των 200 κονδύλων στην περίπτωση που είναι λιγότεροι οι διαθέσιμοι κόνδυλοι. ⎯ Η επικύρωση όλων των μεθόδων ανίχνευσης που περιγράφονται στη συνέχεια βασίζεται στη διενέργεια δοκιμών σε δείγματα 200 κονδύλων. ⎯ Το εκχύλισμα πατάτας που περιγράφεται παρακάτω μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση του βακτηρίου της δακτυλιωτής σήψης της πατάτας, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Προαιρετική προεπεξεργασία πριν από την προετοιμασία του δείγματος:

Λεπτομερείς μέθοδοι για την ανίχνευση και ταυτοποίηση του R. solanacearum σε δείγματα ασυμπτωματικών φυτών πατάτας, τομάτας ή άλλων φυτών ξενιστών 2.1. Προετοιμασία του δείγματος Σημείωση: Για την ανίχνευση των λανθανόντων πληθυσμών του R. solanacearum συνιστάται ο έλεγχος σύνθετων δειγμάτων. Η διαδικασία είναι δυνατόν να εφαρμοσθεί κατάλληλα και για σύνθετα δείγματα με έως 200 τμήματα στελεχών. Εάν πραγματοποιούνται επισκοπήσεις, αυτές πρέπει να βασίζονται σε στατιστικά αντιπροσωπευτικό δείγμα του πληθυσμού φυτών υπό εξέταση. 2.1.1. Τα τμήματα στελεχών 1−2 cm συλλέγονται σε κλειστό αποστειρωμένο περιέκτη σύμφωνα με τις ακόλουθες διαδικασίες δειγματοληψίας: Σπορόφυτα τομάτας φυτωρίου: Με ένα καθαρό και απολυμασμένο μαχαίρι, αφαιρείται τμήμα 1 cm από τη βάση κάθε στελέχους, πάνω ακριβώς από το έδαφος. Φυτά τομάτας που έχουν αναπτυχθεί στον αγρό ή σε θερμοκήπιο: Με ένα καθαρό και απολυμασμένο μαχαίρι, απομακρύνουμε το χαμηλότερο πλευρικό βλαστό από κάθε φυτό κόβοντας ακριβώς πάνω από το σημείο ένωσης με το κύριο στέλεχος. Απομακρύνουμε το χαμηλότερο τμήμα ενός εκατοστού από κάθε πλευρικό βλαστό. Άλλοι ξενιστές: Με ένα καθαρό και απολυμασμένο μαχαίρι ή κλαδευτική ψαλίδα, αφαιρείται τμήμα 1 cm από τη βάση κάθε στελέχους, πάνω ακριβώς από το έδαφος. Στην περίπτωση του S. dulcamara ή άλλων φυτών ξενιστών που αναπτύσσονται στο νερό, αφαιρούμε τμήματα (1−2 cm) από τα στελέχη ή στολόνια που βρίσκονται κάτω από το νερό και τα οποία έχουν αναπτύξει ρίζες μέσα στο νερό. Όταν πραγματοποιείται δειγματοληψία σε μια συγκεκριμένη τοποθεσία, συνιστάται η εξέταση στατιστικά αντιπροσωπευτικού δείγματος τουλάχιστον 10 φυτών ανά σημείο δειγματοληψίας κάθε πιθανού ζιζάνιου – ξενιστή. Η ανίχνευση του παθογόνου είναι περισσότερο αξιόπιστη κατά τα τέλη της άνοιξης, το καλοκαίρι και το φθινόπωρο, αν και οι φυσικές μολύνσεις είναι δυνατόν να ανιχνευθούν καθ’ όλη τη διάρκεια του έτους στο πολυετές φυτό Solanum dulcamara που αναπτύσσεται στα υδατορεύματα. Γνωστοί ξενιστές είναι τα φυτά εθελοντές της πατάτας, το Solanum dulcamara, το S. nigrum, το Datura stramonium και άλλα είδη της οικογένειας των σολανωδών (Solanaceae). Άλλοι ξενιστές είναι το Pelargonium spp. και το Portulaca oleracea. Ορισμένα ευρωπαϊκά είδη ζιζανίων, τα οποία δύνανται ενδεχομένως να φιλοξενούν πληθυσμούς R. solanacearum βιοποικιλίας 2, φυλής 3 στις ρίζες ή/και τις ριζόσφαιρες υπό ειδικές περιβαλλοντικές συνθήκες είναι τα Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra και Urtica dioica. Σημείωση: Στο στάδιο αυτό μπορεί να γίνει μακροσκοπική εξέταση για εσωτερικά συμπτώματα (χρώση του αγγειώδους ιστού ή βακτηριακό εξίδρωμα). Αφήνουμε παράμερα όλα τα τμήματα στελεχών που παρουσιάζουν συμπτώματα και τα εξετάζουμε ξεχωριστά (βλέπε ενότητα ΙΙ). 2.1.2. Τα τμήματα στελεχών απολυμαίνονται για σύντομο χρονικό διάστημα με αιθανόλη 70% και στεγνώνονται αμέσως με απορροφητικό χαρτί. Ακολούθως τα τμήματα στελεχών υποβάλλονται σε κατεργασία με μία από τις ακόλουθες διαδικασίες: είτε,

Δοκιμή εκκρίσεων από το στέλεχος Η παρουσία του R. solanacearum σε στελέχη μαραμένων φυτών πατάτας, τομάτας ή άλλων ξενιστών μπορεί να εκτιμηθεί με την ακόλουθη απλή προκαταρκτική δοκιμή: Κόβουμε το στέλεχος πάνω ακριβώς από το έδαφος. Αναρτάται η κομμένη επιφάνεια μέσα σε σωλήνα με καθαρό νερό. Παρατηρούμε εάν σε λίγα λεπτά παρουσιαστεί η χαρακτηριστική αυθόρμητη ροή βακτηριακού γλοιώδους εκκρίματος με τη μορφή κλωστών από τις κομμένες αγγειώδεις δέσμες.

Ανίχνευση πολυ−β−υδροξυβουτυρικών κοκκίων

Παρασκευάζουμε επίχρισμα της βακτηριακής εξίδρωσης από τους μολυσμένους ιστούς ή από 48ωρη καλλιέργεια σε υλικό YPGA ή SPA (προσάρτημα 2) σε αντικειμενοφόρο πλάκα μικροσκοπίου.

Παρασκευάζουμε επίσης επιχρίσματα θετικού μάρτυρα από στέλεχος του R. solanacearum βιοποικιλίας 2 και, αν θεωρηθεί χρήσιμο, ένα επίχρισμα αρνητικού μάρτυρα ενός είδους γνωστού ως αρνητικού στην παραγωγή PHB.

Αφήνουμε να ξηρανθούν και περνούμε την κατώτερη επιφάνεια κάθε αντικειμενοφόρου γρήγορα πάνω από φλόγα για να προσηλωθούν τα επιχρίσματα.

Ακολουθεί χρώση του παρασκευάσματος με Nile Blue ή Sudan Black και εξετάζονται στο μικροσκόπιο ως εξής: Δοκιμή Nile Blue

Δοκιμές οροσυγκόλλησης Η συγκόλληση των κυττάρων του R. solanacearum σε βακτηριακή εξίδρωση ή εκχυλίσματα ιστών που παρουσιάζουν συμπτώματα παρατηρείται καλύτερα με τη χρήση επικυρωμένων αντισωμάτων (βλέπε παράρτημα 3) επισημασμένων με τους κατάλληλους χρωματικούς δείκτες, όπως κόκκινα κύτταρα Staphylococcus aureus ή χρωσμένα σωματίδια latex. Εάν χρησιμοποιείται συσκευασία που διατίθεται στο εμπόριο (βλέπε προσάρτημα 3), ακολουθούμε τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σε διαφορετική περίπτωση, ακολουθείται η εξής διαδικασία:

Εκλεκτική απομόνωση 4.1. Εκλεκτική απομόνωση επί στερεού υποστρώματος Σημείωση: Προτού χρησιμοποιήσετε για πρώτη φορά τη μέθοδο αυτή, πρέπει να πραγματοποιήσετε προκαταρκτικές δοκιμές έτσι ώστε να εξασφαλισθεί η αναπαραγώγιμη ανίχνευση 103 έως 104 μονάδων που σχηματίζουν αποικίες του R. solanacearum ανά ml που προστίθεται σε εκχυλίσματα από δείγματα που προηγουμένως έδειξαν αρνητικά αποτελέσματα. Χρησιμοποιείστε ένα κατάλληλο επικυρωμένο εκλεκτικό θρεπτικό υπόστρωμα όπως το SMSA (όπως τροποποιήθηκε από τον Elphinstone et al., 1996· βλέπε προσάρτημα 2). Χρειάζεται επίσης προσοχή ώστε το R. solanacearum να διαφοροποιείται από τυχόν άλλα βακτήρια που μπορεί να αναπτύξουν αποικίες στο θρεπτικό υπόστρωμα. Επιπροσθέτως, οι αποικίες του R. solanacearum ενδέχεται να παρουσιάζουν μη τυπική μορφολογία εάν τα τρυβλία έχουν υπερβολικούς πληθυσμούς του βακτηρίου ή υπάρχουν επίσης ανταγωνιστικά βακτήρια. Στις περιπτώσεις που υπάρχουν υπόνοιες για φαινόμενα ανταγωνισμού, το δείγμα πρέπει να επανεξετάζεται με διαφορετική δοκιμή. Είναι δυνατόν να αναμένεται η ύψιστη ευαισθησία ανίχνευσης με τη μέθοδο αυτή όταν χρησιμοποιούνται εκχυλίσματα δειγμάτων που έχουν μόλις παρασκευασθεί. Ωστόσο, η μέθοδος εφαρμόζεται επίσης για εκχυλίσματα που έχουν αποθηκευθεί σε γλυκερίνη στους − 68 έως −86 °C. Ως θετικοί μάρτυρες, παρασκευάζονται δεκαδικές αραιώσεις από αιώρημα 106 cfu ανά ml παθογόνου στελέχους του R. solanacearum βιοποικιλίας 2 (π.χ. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Για την αποφυγή ενδεχόμενης μόλυνσης, παρασκευάζονται θετικοί μάρτυρες πλήρως διαχωρισμένοι από τα δείγματα προς δοκιμή. Η καταλληλότητα κάθε νέας παρτίδας εκλεκτικού υποστρώματος όσον αφορά την ανάπτυξη του παθογόνου πρέπει να ελέγχεται πριν χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο των συνήθων δειγμάτων. Η δοκιμή του υλικού των μαρτύρων γίνεται με τον ίδιο τρόπο όπως αυτή του ή των δειγμάτων. 4.1.1. Πραγματοποιείται η κατάλληλη τεχνική αραιώσεων επί στερεού υποστρώματος με στόχο να εξασφαλισθεί ότι αραιώνονται οποιοιδήποτε πληθυσμοί σαπροφύτων που σχηματίζουν αποικίες. Απλώνονται 50 − 100 µl ανά τρυβλίο εκχυλίσματος δείγματος και κάθε αραίωση. 4.1.2. Τα τρυβλία επωάζονται στους 28 °C. Γίνεται ανάγνωση των τρυβλίων μετά από 48 ώρες και στη συνέχεια κάθε μέρα για 6 ημέρες. Οι τυπικές αποικίες του R. solanacearum σε θρεπτικό υπόστρωμα SMSA είναι γαλακτώδους χροιάς λευκές, επίπεδες, ακανόνιστες και ρευστώδεις και μετά από επώαση 3 ημερών αναπτύσσουν ρόδινο έως αιματέρυθρο χρώμα στο κέντρο με εσωτερικές ραβδώσεις ή ελικώσεις. (βλέπε http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/ main). Σημείωση: Ορισμένες φορές στο εν λόγω θρεπτικό υπόστρωμα σχηματίζονται μη τυπικές αποικίες του R. solanacearum. Οι αποικίες αυτές ενδέχεται να είναι μικρές, στρογγυλές, εντελώς κόκκινες στο χρώμα και μη ρευστώδεις ή μόνον μερικώς ρευστώδεις και, για το λόγο αυτό, είναι δύσκολο να τις ξεχωρίσει κανείς από σαπροφυτικά βακτήρια που σχηματίζουν αποικίες. 4.1.3. Καθαρίζονται οι πιθανές αποικίες του R. solanacearum ύστερα από γραμμωτή εξάπλωση ή εξάπλωση διαδοχικών αραιώσεων σε τρυβλία σε γενικής χρήσης θρεπτικό υλικό για την επίτευξη απομονωμένων αποικιών (βλέπε προσάρτημα 2). 4.1.4. Οι καλλιέργειες αποθηκεύονται για βραχέα διαστήματα σε αποστειρωμένο νερό (pH 6−8, χωρίς χλώριο) σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι ή για μακρά διαστήματα σε κατάλληλο κρυοπροστατευτικό υλικό στους −68 έως −86 °C ή λυοφιλιωμένες. 4.1.5. Ταυτοποιούνται οι πιθανές καλλιέργειες (βλέπε ενότητα VI.B.) και πραγματοποιείται δοκιμή παθογένειας (βλέπε ενότητα VI.Γ). Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμής εκλεκτικής απομόνωσης επί στερεού θρεπτικού υποστρώματος Η δοκιμή αυτή είναι αρνητική εάν δεν παρατηρηθούν βακτηριακές αποικίες μετά από 6 ημέρες ή δεν εντοπισθούν πιθανές τυπικές αποικίες του R. solanacearum, υπό την προϋπόθεση ότι δεν υπάρχουν υπόνοιες για παρεμπόδιση λόγω ανταγωνισμού από άλλα βακτήρια και ότι στους θετικούς μάρτυρες έχουν βρεθεί τυπικές αποικίες R. solanacearum. Η δοκιμή είναι θετική εάν απομονωθούν πιθανές αποικίες του R. solanacearum. 4.2. Διαδικασία εμπλουτισμού Χρησιμοποιούμε ένα επικυρωμένο υπόστρωμα εμπλουτισμού όπως ο τροποποιημένος ζωμός Wilbrink (βλέπε προσάρτημα 2). σε εκχυλίσματα δειγμάτων και για την ενίσχυση της ευαισθησίας ανίχνευσης. Η εν λόγω διαδικασία, αραιώνει επίσης αποτελεσματικά παρεμποδιστές της αντίδρασης PCR (1:100). Θα πρέπει, ωστόσο, να σημειωθεί ότι ο εμπλουτισμός του R. solanacearum μπορεί να αποτύχει λόγω ανταγωνισμού από σαπροφυτικούς οργανισμούς οι οποίοι επίσης εμπλουτίζονται ταυτόχρονα. Για το λόγο αυτό, η απομόνωση του R. solanacearum από εμπλουτισμένες καλλιέργειες ζωμού ενδέχεται να είναι δύσκολη. Επιπροσθέτως, καθώς μπορεί να αυξηθούν οι πληθυσμοί ορολογικά σχετιζομένων βακτηρίων, συνιστάται η χρήση εξειδικευμένων μονοκλωνικών αντισωμάτων αντί πολυκλωνικών αντισωμάτων όσον αφορά τις περιπτώσεις που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί η δοκιμή ELISA. 4.2.1. Όσον αφορά την PCR εμπλουτισμού, μεταφέρουμε 100 µl εκχυλίσματος δείγματος σε 10 ml ζωμού εμπλουτισμού (προσάρτημα 2) που έχει προηγουμένως τοποθετηθεί σε επιμέρους ίσες ποσότητες σε σωλήνες ή φιάλες απαλλαγμένες από DNA. Για την ELISA εμπλουτισμού, είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν μεγαλύτερες αναλογίες εκχυλίσματος δείγματος σε σχέση με το ζωμό (π.χ. 100 µl σε 1,0 ml ζωμού εμπλουτισμού). 4.2.2. Επωάζουμε για 72 ώρες στους 27 έως 30 °C σε ανακινούμενη ή στατική καλλιέργεια διατηρώντας το καπάκι προσαρμοσμένο χαλαρά έτσι ώστε να είναι δυνατός ο αερισμός. 4.2.3. Αναμειγνύουμε καλά πριν από τη διεξαγωγή των δοκιμών ELISA ή PCR. 4.2.4. Επεξεργαζόμαστε τον εμπλουτισμένο ζωμό με τον ίδιο τρόπο όπως το (τα) δείγμα(−τα) στις ανωτέρω δοκιμές. Σημείωση: Εάν αναμένουμε παρεμπόδιση του εμπλουτισμού του R. solanacearum λόγω των υψηλών πληθυσμών ορισμένων ανταγωνιστικών σαπροφυτικών βακτηρίων, είναι δυνατόν να παραχθούν καλύτερα αποτελέσματα εάν εμπλουτισθούν τα εκχυλίσματα δείγματος πριν από οιαδήποτε φυγοκέντριση ή άλλες ενέργειες συγκέντρωσης.

Δοκιμή IF Αρχή Η χρήση της δοκιμής IF ως αρχικής δοκιμής διαλογής συνιστάται λόγω της αποδεδειγμένης ευρωστίας της για την επίτευξη των απαιτούμενων ορίων. Όταν η δοκιμή IF χρησιμοποιείται ως αρχική δοκιμή διαλογής και η ανάγνωση IF είναι θετική, πρέπει να πραγματοποιηθεί η δοκιμή απομόνωσης, PCR ή FISH ως δεύτερη δοκιμή διαλογής. Όταν η δοκιμή IF χρησιμοποιείται ως δεύτερη δοκιμή διαλογής και η ανάγνωση IF είναι θετική, απαιτείται διεξαγωγή περαιτέρω δοκιμών σύμφωνα με το διάγραμμα ροής για την ολοκλήρωση της ανάλυσης. Σημείωση: Χρησιμοποιούμε επικυρωμένη πηγή αντισωμάτων του R. solanacearum (βλέπε Ιστοχώρο http://forum. europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Συνιστάται ο προσδιορισμός του τίτλου για κάθε νέα παρτίδα αντισωμάτων. Ως τίτλος ορίζεται η μεγαλύτερη αραίωση στην οποία λαμβάνει χώρα η βέλτιστη αντίδραση όταν υποβάλλεται σε δοκιμή αιώρημα που περιέχει 105 έως 106 κύτταρα ανά ml του ομόλογου στελέχους του R. solanacearum και χρησιμοποιείται κατάλληλο σύμπλοκο ισοθειοκυανικής φθορεϊσίνης (FITC) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Οι επικυρωμένοι πολυκλωνικοί αντιορροί πρέπει να έχουν τίτλο IF τουλάχιστον 1:2000. Κατά τη διάρκεια της δοκιμής, τα αντισώματα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε αραίωση(−εις) εργασίας (WD) στον τίτλο ή κοντά στον τίτλο. Η δοκιμή πρέπει να πραγματοποιείται σε εκχυλίσματα δειγμάτων που έχουν μόλις παρασκευασθεί. Εάν είναι απαραίτητο, μπορεί να πραγματοποιηθεί με επιτυχία σε εκχυλίσματα που έχουν αποθηκευθεί σε θερμοκρασία −68 έως −86 °C σε γλυκερίνη. Η γλυκερίνη είναι δυνατόν να αφαιρεθεί από το δείγμα με την προσθήκη 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος ιζήματος (προσάρτημα 4), εκ νέου φυγοκέντριση για 15 λεπτά σε 7000 g και επανασχηματισμό αιωρήματος σε ίσο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος ιζήματος. Συχνά αυτό δεν είναι αναγκαίο, ιδιαίτερα εάν τα δείγματα αντικειμενοφόρου έχουν προσηλωθεί στις αντικειμενοφόρους με διέλευση από φλόγα. Παρασκευάζονται ξεχωριστά ως θετικοί μάρτυρες αντικειμενοφόροι από ομόλογο στέλεχος ή άλλο στέλεχος αναφοράς του R. solanacearum, που είναι αιώρημα σε εκχύλισμα πατάτας, όπως περιγράφεται στο προσάρτημα 3 Β, και προαιρετικά σε ρυθμιστικό διάλυμα. Ως παρόμοιοι μάρτυρες πρέπει να χρησιμοποιούνται, όποτε είναι δυνατόν, στην ίδια αντικειμενοφόρο, φυσικώς μολυσμένοι ιστοί (που διατηρούνται με λυοφιλίωση ή κατάψυξη στους –16 έως –24°C). Ως αρνητικοί μάρτυρες είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν κατάλληλες ποσότητες εκχυλίσματος δείγματος που προηγουμένως είχε δοκιμαστεί και ήταν αρνητικό όσον αφορά το R. solanacearum. Στο προσάρτημα 3 παρατίθενται τυποποιημένα υλικά θετικών και αρνητικών μαρτύρων που διατίθενται προς χρήση στο πλαίσιο της εν λόγω δοκιμής. Χρησιμοποιούνται πολυφατνιακές αντικειμενοφόροι πλάκες μικροσκοπίου με 10 κατά προτίμηση φατνία διαμέτρου τουλάχιστον 6 mm. Η δοκιμή του υλικού των μαρτύρων γίνεται με τον ίδιο τρόπο όπως αυτή του ή των δειγμάτων. 5.1. Οι αντικειμενοφόροι πλάκες δοκιμής προετοιμάζονται με μία από τις ακόλουθες διαδικασίες: i) Για ιζήματα με μικρή σχετικά ποσότητα ιζήματος αμύλου: Στο πρώτο φατνίο, φέρεται μετρημένος με σιφώνιο συγκεκριμένος όγκος (15 µl είναι αρκετός για φατνία με διάμετρο 6 mm − ο όγκος κλιμακώνεται προς τα άνω για μεγαλύτερα φατνία) αραίωσης 1/100 του αιωρήματος του ιζήματος πατάτας. Στη συνέχεια, φέρεται με σιφώνιο όμοιος όγκος μη αραιωμένου ιζήματος (1/1) στα υπόλοιπα φατνία διαδοχικά. Η δεύτερη σειρά μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείγμα εις διπλούν ή για ένα δεύτερο δείγμα όπως φαίνεται στην εικόνα 1. ii) Για άλλα ιζήματα: Παρασκευάζονται δεκαδικές αραιώσεις (1/10 και 1/100) του αιωρήματος του ιζήματος σε ρυθμιστικό διάλυμα ιζήματος. Σε μία σειρά φατνίων, φέρεται μετρημένος με σιφώνιο συγκεκριμένος όγκος (15 µl είναι αρκετός για φατνία με διάμετρο 6 mm − ο όγκος κλιμακώνεται προς τα άνω για μεγαλύτερα φατνία) του αιωρήματος του ιζήματος και κάθε αραίωση. Η δεύτερη σειρά μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως επανάληψη του δείγματος ή για ένα δεύτερο δείγμα όπως φαίνεται στην εικόνα 2. 5.2. Τα σταγονίδια στεγνώνονται σε θερμοκρασία εργαστηρίου ή με θέρμανση σε θερμοκρασίες 40 έως 45 °C. Τα βακτηριακά κύτταρα προσηλώνονται στην αντικειμενοφόρο με θέρμανση (15 λεπτά στους 60 °C), Εάν είναι απαραίτητο, οι προσηλωμένες αντικειμενοφόροι είναι δυνατόν να φυλαχθούν στη συνέχεια στην κατάψυξη σε αφυδατωμένο δοχείο για όσο το δυνατόν μικρότερο χρονικό διάστημα (το μέγιστο για 3 μήνες) προτού υποβληθούν σε περαιτέρω δοκιμές. 5.3. Διαδικασία IF i) Σύμφωνα με την προετοιμασία της αντικειμενοφόρου δοκιμής στο σημείο 5.1.i): Παρασκευάζεται μία σειρά αραιώσεων στο διπλάσιο. Το πρώτο φατνίο πρέπει να έχει ½ του τίτλου (T/2), τα υπόλοιπα Ό του τίτλου (T/4), ½ του τίτλου (T/2), τον τίτλο (T) και το διπλάσιο του τίτλου (2T). ii) Σύμφωνα με την ετοιμασία της αντικειμενοφόρου προς δοκιμή στο σημείο 5.1.ii): Παρασκευάζεται η αραίωση εργασίας (WD) του αντισώματος σε ρυθμιστικό διάλυμα για IF. Η αραίωση εργασίας επηρεάζει την εξειδίκευση. καλύπτεται πλήρως με την ή τις αραιώσεις αντισώματος. Ο όγκος του αντισώματος που εφαρμόζεται σε κάθε φατνίο πρέπει να είναι τουλάχιστον ίσος με τον όγκο του εφαρμοσθέντος εκχυλίσματος. Η ακόλουθη διαδικασία πρέπει να εφαρμόζεται στην περίπτωση που δεν υπάρχουν συγκεκριμένες οδηγίες από τους προμηθευτές των αντισωμάτων: 5.3.2. Οι αντικειμενοφόροι πλάκες επωάζονται σε ένυγρο χαρτί κάτω από ένα κάλυμμα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία εργαστηρίου (18−25 °C). 5.3.3. Τα σταγονίδια απομακρύνονται με ένα ελαφρό τίναγμα από την αντικειμενοφόρο και ακολουθεί προσεκτικό ξέπλυμα με ρυθμιστικό διάλυμα IF. Πλένονται με βύθισμα για 5 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα IF−Tween (προσάρτημα 4) και στη συνέχεια σε ρυθμιστικό διάλυμα IF. Πρέπει να αποφεύγεται η δημιουργία αερολυμάτων ή η μεταφορά σταγονιδίων που θα μπορούσαν να έχουν ως αποτέλεσμα την επιμόλυνση. Η περίσσεια υγρασίας αφαιρείται προσεκτικά χρησιμοποιώντας με απαλές κινήσεις ένα στυπόχαρτο. 5.3.4. Οι αντικειμενοφόροι πλάκες διευθετούνται πάνω σε ένυγρο χαρτί. Τα φατνία δοκιμής καλύπτονται με την αραίωση του συμπλόκου FITC που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του τίτλου. Ο όγκος του χρησιμοποιούμενου στα φατνία συμπλόκου πρέπει να είναι ίδιος με τον όγκο του εφαρμοσθέντος αντισώματος. 5.3.5. Οι αντικειμενοφόροι επωάζονται σε ένυγρο χαρτί κάτω από ένα κάλυμμα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία εργαστηρίου (18−25 °C). 5.3.6. Τα σταγονίδια του συμπλόκου απομακρύνονται με ελαφρό τίναγμα από την αντικειμενοφόρο. Οι αντικειμενοφόροι ξεπλένονται και πλένονται όπως προηγουμένως (5.3.3). Η περίσσεια υγρασίας αφαιρείται προσεκτικά. 5.3.7. Σε κάθε φατνίο φέρονται με σιφώνιο 5−10 µl 0,1Μ φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος γλυκερίνης (προσάρτημα 4) ή εμπορικού αντιξεθωριαστικού υλικού έγκλεισης και τα φατνία καλύπτονται με μία καλυπτρίδα. 5.4. Ανάγνωση της δοκιμής IF 5.4.1. Οι αντικειμενοφόροι πλάκες δοκιμής εξετάζονται σε μικροσκόπιο επιφθορισμού με φίλτρα κατάλληλα για τη διέγερση του FITC, με ελαιο− ή υδατοκαταδυτικό φακό σε μεγέθυνση 500−1000 x. Τα φατνία εξετάζονται κατά δύο κάθετες διαμέτρους και κατά την περίμετρό τους. Όσον αφορά τα δείγματα που δεν δείχνουν καθόλου κύτταρα ή δείχνουν μικρό αριθμό κυττάρων, πρέπει να παρατηρηθούν τουλάχιστον 40 πεδία μικροσκοπίου. Πρώτα ελέγχεται η αντικειμενοφόρος του θετικού μάρτυρα. Τα κύτταρα πρέπει να είναι πλήρως χρωσμένα με λαμπρό φθορισμό στον προσδιορισμένο τίτλο αντισώματος ή την αραίωση εργασίας. Σε περίπτωση παρέκκλισης της χρώσης, η δοκιμή IF (ενότητα VI.A.5.) επαναλαμβάνεται. 5.4.2. Εξετάζεται εάν υπάρχουν λαμπρώς φθορίζοντα κύτταρα με τη χαρακτηριστική μορφολογία του R. solanacearum στα φατνία δοκιμής των αντικειμενοφόρων πλακών δοκιμής (βλ. ιστοχώρο http://forum.europa. eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Η ένταση του φθορισμού πρέπει να είναι ισοδύναμη με εκείνη του θετικού μάρτυρα με ίδια αραίωση αντισώματος. Κύτταρα με ατελή χρώση ή με ασθενή φθορισμό δεν πρέπει να λαμβάνονται υπόψη. Εάν υπάρχει υποψία μόλυνσης, η δοκιμή πρέπει να επαναληφθεί. Κάτι τέτοιο υπάρχει περίπτωση να συμβεί εάν όλες οι αντικειμενοφόροι μιας παρτίδας δείχνουν θετικά κύτταρα λόγω μόλυνσης του ρυθμιστικού διαλύματος ή εάν βρεθούν θετικά κύτταρα (εκτός των φατνίων της αντικειμενοφόρου) στην επικάλυψη της αντικειμενοφόρου. 5.4.3. Υπάρχουν διάφορα προβλήματα σύμφυτα με την εξειδίκευση της δοκιμής ανοσοφθορισμού. Τα ιζήματα των κώνων από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου και των τμημάτων των στελεχών περιέχουν συχνά πληθυσμούς φθοριζόντων κυττάρων μη τυπικής μορφολογίας καθώς και μη ειδικώς αντιδρώντα σαπροφυτικά βακτήρια όμοιου μεγέθους και μορφολογίας με το R. solanacearum. 5.4.4. Λαμβάνονται υπόψη μόνον τα φθορίζοντα κύτταρα με τυπικό μέγεθος και μορφολογία στον τίτλο ή την αραίωση εργασίας των αντισωμάτων όπως στο σημείο 5.3. 5.4.5. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων IF: i) Εάν βρίσκονται λαμπρώς φθορίζοντα κύτταρα με χαρακτηριστική μορφολογία, εκτιμάται ο μέσος αριθμός τυπικών κυττάρων ανά πεδίο μικροσκοπίου και υπολογίζεται ο αριθμός των τυπικών κυττάρων ανά ml του αναδιαλυμένου ιζήματος (προσάρτημα 5). Η ανάγνωση IF είναι θετική για δείγματα με τουλάχιστον 5x103 τυπικά κύτταρα ανά ml του αναδιαλυμένου ιζήματος. Το δείγμα θεωρείται ενδεχομένως μολυσμένο και απαιτείται η διενέργεια περαιτέρω δοκιμών. ii) Η ανάγνωση IF είναι αρνητική για δείγματα με λιγότερα από 5x103 κύτταρα ανά ml αναδιαλυμένου ιζήματος και το δείγμα θεωρείται αρνητικό. Δεν απαιτείται η διεξαγωγή περαιτέρω δοκιμών.

Δοκιμές PCR Αρχές Όταν η δοκιμή PCR χρησιμοποιείται ως αρχική δοκιμή διαλογής και έχει θετικά αποτελέσματα, πρέπει να πραγματοποιηθεί η απομόνωση ή IF ως δεύτερη υποχρεωτική δοκιμή διαλογής. Όταν η δοκιμή PCR χρησιμοποιείται ως δεύτερη δοκιμή διαλογής και έχει θετικά αποτελέσματα, απαιτείται διεξαγωγή περαιτέρω δοκιμών σύμφωνα με το διάγραμμα ροής για την ολοκλήρωση της διάγνωσης. Η πλήρης αξιοποίηση της μεθόδου αυτής ως αρχικής δοκιμής διαλογής συνιστάται μόνον όταν έχει αποκτηθεί εξειδικευμένη εμπειρία. Σημείωση: Οι προκαταρκτικές δοκιμές με τη μέθοδο αυτή πρέπει να επιτρέπουν την αναπαραγώγιμη ανίχνευση τουλάχιστον 103 έως 104 κυττάρων του R. solanacearum ανά ml που προστίθεται σε εκχυλίσματα δειγμάτων που προηγούμενως έδειξαν αρνητικά αποτελέσματα. Μπορεί να χρειασθούν πειράματα αριστοποίησης για την επίτευξη των μέγιστων επιπέδων ευαισθησίας και εξειδίκευσης σε όλα τα εργαστήρια. Χρησιμοποιούνται επικυρωμένα αντιδραστήρια και πρωτόκολλα PCR (βλέπε προσάρτημα 6). Επιλέγεται κατά προτίμηση μέθοδος με εσωτερικό μάρτυρα. Λαμβάνονται οι κατάλληλες προφυλάξεις ώστε να αποφευχθεί η μόλυνση του δείγματος με DNA στόχο. Η δοκιμή PCR θα πρέπει να πραγματοποιείται από πε Οι αρνητικοί μάρτυρες πρέπει πάντοτε (εξαγωγή DNA και PCR) να χειρίζονται ως τελικό δείγμα στη διαδικασία, έτσι ώστε να καθίσταται φανερή ενδεχόμενη μεταφορά DNA. Στη δοκιμή PCR πρέπει να περιλαμβάνονται οι ακόλουθοι αρνητικοί μάρτυρες: – εκχύλισμα δείγματος που προηγουμένως ήταν αρνητικό στη δοκιμή για το R. solanacearum, – μάρτυρες ρυθμιστικών διαλυμάτων που χρησιμοποιούνται για την εξαγωγή του βακτηρίου και του DNA από το δείγμα, – μείγμα αντίδρασης PCR. Πρέπει να περιλαμβάνονται οι ακόλουθοι θετικοί μάρτυρες: – κατάλληλες ποσότητες αναδιαλυμένων ιζημάτων στις οποίες έχει προστεθεί το R. solanacearum (για την παρασκευή βλέπε προσάρτημα 3 Β), – αιώρημα 106 κυττάρων ανά ml νερού παθογόνου απομόνωσης του R. solanacearum (π.χ. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857· βλέπε προσάρτημα 3 Β), – εάν είναι δυνατόν, χρησιμοποιείται επίσης DNA από δείγματα θετικών μαρτύρων κατά τη διενέργεια της PCR. Για την αποφυγή πιθανής μόλυνσης παρασκευάζονται θετικοί μάρτυρες σε ξεχωριστό περιβάλλον από τα δείγματα προς δοκιμή. Τα εκχυλίσματα δείγματος πρέπει να έχουν απαλλαγεί στο μέγιστο δυνατό βαθμό από χώματα. Για το λόγο αυτό, συστήνεται σε ορισμένες περιπτώσεις να προετοιμάζονται οι εξαγωγές από πλυμένες πατάτες εάν πρόκειται να χρησιμοποιηθούν πρωτόκολλα PCR. Στο προσάρτημα 3 παρατίθενται τυποποιημένα υλικά θετικών και αρνητικών μαρτύρων που διατίθενται προς χρήση στο πλαίσιο της εν λόγω δοκιμής. 6.1. Μέθοδοι καθαρισμού DNA Χρησιμοποιούνται δείγματα θετικών και αρνητικών μαρτύρων όπως περιγράφηκε παραπάνω (βλέπε προσάρτημα 3). Η δοκιμή του υλικού των μαρτύρων γίνεται με τον ίδιο τρόπο όπως αυτή του ή των δειγμάτων. Υπάρχουν διάφορες διαθέσιμες μέθοδοι για τον καθαρισμό του DNA στόχου από σύνθετα υποστρώματα δειγμάτων, απομακρύνοντας κατ’ αυτόν τον τρόπο τους παρεμποδιστές της PCR και άλλων ενζυματικών αντιδράσεων και συγκεντρώνοντας το DNA στόχο στο εκχύλισμα δείγματος. Η ακόλουθη μέθοδος έχει βελτιστοποιηθεί με σκοπό τη χρήση με τις επικυρωμένες μεθόδους PCR που περιγράφονται στο προσάρτημα 6.

Προστίθενται με σιφώνιο 220 µl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (100 mM NaCl, 10 mM Tris−HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA [pH 8.0]) σε σωλήνα Eppendorf 1,5 ml.

Προστίθενται 100 µl εκχυλίσματος δείγματος και τοποθετούνται σε θερμικό μπλοκ ή υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 95 °C για 10 λεπτά.

Ο σωλήνας τοποθετείται σε πάγο για 5 λεπτά.

Προστίθενται 80 µl πυκνού διαλύματος λυσοζύμης (50 mg λυσοζύμη ανά ml σε 10 mM Tris HCl, pH 8.0) και επωάζονται στους 37 °C για 30 λεπτά.

Προστίθενται 220 µl διαλύματος Α Easy DNA® (Invitrogen), αναμειγνύονται καλά σε συσκευή vortex και επωάζονται στους 65 °C για 30 λεπτά.

Προστίθενται 100 µl διαλύματος Β Easy DNA® (Invitrogen), αναμειγνύονται με ένταση σε συσκευή vortex έως ότου το ίζημα να ρέει ελεύθερα στο σωλήνα και το δείγμα να είναι ομοιόμορφα ιξώδες.

Προστίθενται 500 µl χλωροφορμίου και αναμειγνύουμε με στροβιλισμό (vortex) έως ότου μειωθεί το ιξώδες και το μείγμα είναι ομοιογενές.

Ακολουθεί φυγοκέντριση σε 15.000 g για 20 λεπτά σε θερμοκρασία 4 °C για το διαχωρισμό των φάσεων και τη δημιουργία της ενδιάμεσης φάσης.

Η άνω φάση μεταφέρεται σε νέο σωλήνα Eppendorf.

Προστίθεται 1 ml από 100% αιθανόλη (−20 °C), αναμειγνύεται με στροβιλισμό (vortex) για σύντομο χρονικό διάστημα και επωάζεται σε πάγο για 10 λεπτά.

Φυγοκεντρείται σε 15000 g για 20 λεπτά στους 4°C και απομακρύνεται η αιθανόλη από το ίζημα.

Προστίθενται 500 µl 80% αιθανόλης (−20 °C) και αναμειγνύουμε αναποδογυρίζοντας το σωλήνα.

Ακολουθεί φυγοκέντριση σε 15000 g για 10 λεπτά στους 4 °C, διατηρείται το ίζημα και απομακρύνεται η αιθανόλη.

Αφήνουμε το ίζημα να στεγνώσει στον αέρα ή σε DNA Speed Vac.

Το ίζημα αναδιαλύεται σε 100 µl αποστειρωμένου UPW και αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου για τουλάχιστον 20 λεπτά.

Αποθηκεύεται στους −20 °C έως ότου χρειασθεί να χρησιμοποιηθεί για την PCR.

Καθιζάνεται με φυγοκέντριση οιοδήποτε λευκό ίζημα και χρησιμοποιούνται 5 µl του υπερκείμενου υγρού που περιέχει DNA για την PCR.

Δοκιμή FISH Αρχή Όταν η δοκιμή FISH χρησιμοποιείται ως αρχική δοκιμή διαλογής και τα αποτελέσματα είναι θετικά, πρέπει να πραγματοποιηθεί η δοκιμή απομόνωσης ή IF ως δεύτερη υποχρεωτική δοκιμή διαλογής. Όταν η δοκιμή FISH χρησιμοποιείται ως δεύτερη δοκιμή διαλογής και έχει θετικά αποτελέσματα, απαιτείται διεξαγωγή περαιτέρω δοκιμών σύμφωνα με το διάγραμμα ροής για την ολοκλήρωση της διάγνωσης. Σημείωση: Χρησιμοποιούνται επικυρωμένοι ολιγοανιχνευτές ειδικοί για το R. solanacearum (βλέπε προσάρτημα 7). Οι προκαταρκτικές δοκιμές με τη μέθοδο αυτή θα πρέπει να επιτρέπουν την αναπαραγώγιμη ανίχνευση τουλάχιστον 103 −104 κυττάρων R. solanacearum ανά ml που προστίθενται σε εκχυλίσματα δειγμάτων που προηγούμενως ήταν αρνητικά στη δοκιμή. Η ακόλουθη διαδικασία είναι προτιμότερο να πραγματοποιείται σε εκχύλισμα δείγματος που έχει μόλις παρασκευασθεί αλλά είναι επίσης δυνατόν να πραγματοποιηθεί με επιτυχία σε εκχύλισμα δείγματος που έχει αποθηκευθεί με γλυκερίνη στους −16 έως −24 °C ή τους −68 έως −86 °C. Ως αρνητικοί μάρτυρες, χρησιμοποιούνται κατάλληλες ποσότητες εκχυλίσματος δείγματος που προηγουμένως ήταν αρνητικό στις δοκιμές όσον αφορά το R. solanacearum. Ως θετικοί μάρτυρες, παρασκευάζονται αιωρήματα που περιέχουν 105 έως 106 κύτταρα ανά ml του R. solanacearum βιοποικιλία 2 (π.χ. στέλεχος NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, βλέπε προσάρτημα 3) σε 0,01M ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PB) από καλλιέργεια 3−5 ημερών. Παρασκευάζονται ξεχωριστά ως θετικοί μάρτυρες αντικειμενοφόροι πλάκες από ομόλογο στέλεχος ή άλλο στέλεχος αναφοράς του R. solanacearum, που έχει γίνει αιώρημα σε εκχύλισμα πατάτας, όπως περιγράφεται στο προσάρτημα 3. Η χρήση ολιγοανιχνευτή ευβακτηρίων σημασμένου με FITC παρέχει μάρτυρα για τη διαδικασία υβριδισμού, καθώς χρωματίζει όλα τα ευβακτήρια που βρίσκονται στο δείγμα. Στο προσάρτημα 3 Α παρατίθενται τυποποιημένα υλικά θετικών και αρνητικών μαρτύρων που διατίθενται προς χρήση με αυτή τη δοκιμή. Το υλικό των μαρτύρων δοκιμάζεται με τρόπο ταυτόσημο με εκείνο του ή των δειγμάτων. 7.1. Προσήλωση του εκχυλίσματος πατάτας Το ακόλουθο πρωτόκολλο βασίζεται στον Wullings et al., (1998): 7.1.1. Παρασκευάζεται το προσηλωτικό διάλυμα (βλέπε προσάρτημα 7). 7.1.2. Φέρονται με σιφώνιο 100 µl κάθε εκχυλίσματος δείγματος σε σωλήνα Eppendorf και φυγοκεντρούνται για 7 λεπτά σε 7000 g. 7.1.3. Αφαιρείται το υπερκείμενο υγρό και το ίζημα διαλύεται σε 200 µl προσηλωτικού υγρού που έχει παρασκευασθεί λιγότερο από 24 ώρες πριν. Αναταράσσουμε με στροβιλισμό (vortex) και επωάζουμε για 1 ώρα στο ψυγείο. 7.1.4. Φυγοκεντρείται για 7 λεπτά σε 7000 g, αφαιρείται το υπερκείμενο υγρό και το ίζημα αναδιαλύεται σε 75 µl 0,01M ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (PB) (βλέπε προσάρτημα 7). πολλαπλών δοκιμών όπως φαίνεται στην Εικόνα 7.1. Εφαρμόζονται 2 διαφορετικά, μη αραιωμένα, δείγματα ανά αντικειμενοφόρο και χρησιμοποιούνται 10 µl για τη δημιουργία αραίωσης 1:100 (σε 0,01 M ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών). Το εναπομείναν διάλυμα δείγματος (49 µl) μπορεί να αποθηκευθεί στους − 20°C μετά την προσθήκη 1 όγκου 96% αιθανόλης. Στην περίπτωση που η δοκιμή FISH πρέπει να επαναληφθεί, αφαιρείται η αιθανόλη με φυγοκέντριση και προστίθεται ίσος όγκος 0,01 M ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών [αναμειγνύουμε με στροβιλισμό (vortex)]. 7.1.6. Οι αντικειμενοφόροι στεγνώνουν στον αέρα (ή σε στεγνωτήρα αντικειμενοφόρου στους 37 °C) και προσηλώνονται με διέλευση από φλόγα. Στο στάδιο αυτό, η διαδικασία είναι δυνατόν να διακοπεί και να συνεχισθεί ο υβριδισμός την επόμενη ημέρα. Οι αντικειμενοφόροι πρέπει να αποθηκεύονται απαλλαγμένες από σκόνη και στεγνές σε θερμοκρασία δωματίου. 7.2. Υβριδισμός 7.2.1. Τα κύτταρα αφυδατώνονται σε διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης των 50%, 80% και 96% για ένα λεπτό σε κάθε μία. Οι αντικειμενοφόροι στεγνώνονται στον αέρα σε υποδοχέα αντικειμενοφόρων. 7.2.2. Παρασκευάζεται ένας υγρός θάλαμος επώασης με κάλυψη του πυθμένα ενός αεροστεγούς δοχείου με απορροφητικό ή διηθητικό χαρτί που έχει εμβαπτισθεί σε 1x μείγμα υβριδισμού (hybmix) (προσάρτημα 7). Το δοχείο προεπωάζεται στον κλίβανο υβριδισμού στους 45 °C για τουλάχιστον 10 λεπτά. 7.2.3. Εφαρμόζουμε 10 µl διαλύματος υβριδισμού (προσάρτημα 7) σε 8 φατνία (φατνία 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 και 10·βλέπε Εικόνα 7.1) κάθε αντικειμενοφόρου αφήνοντας τα δύο φατνία στο κέντρο (3 και 8) κενά. 7.2.4. Εφαρμόζουμε καλυπτρίδες (24 x 24 mm) στα πρώτα και στα 4 τελευταία φατνία χωρίς να εγκλωβιστεί αέρας. Οι αντικειμενοφόροι τοποθετούνται σε προθερμασμένο υγρό θάλαμο και ο υβριδισμός πραγματοποιείται για 5 ώρες στον κλίβανο σε θερμοκρασία 45 °C στο σκοτάδι. 7.2.5. Παρασκευάζονται 3 ποτήρια ζέσεως που περιέχουν αντίστοιχα 1 l νερό Milli Q (νερό μοριακού βαθμού καθαρότητας), 1 l από 1x hybmix (334 ml 3x hybmix και 666 ml νερό Milli Q) και 1 l από 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix και 958 ml νερό Milli Q). Έκαστο προεπωάζεται σε υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 45 °C. 7.2.6. Απομακρύνονται οι καλυπτρίδες από τις αντικειμενοφόρους πλάκες και οι αντικειμενοφόροι τοποθετούνται στον υποδοχέα αντικειμενοφόρων. 7.2.7. Ξεπλένεται η περίσσεια ανιχνευτού με επώαση για 15 λεπτά σε ποτήρι ζέσεως με 1x hybmix στους 45 °C. 7.2.8. Ο υποδοχέας αντικειμενοφόρων πλακών μεταφέρεται σε διάλυμα πλυσίματος 1/8 hybmix και επωάζουμε για 15 λεπτά ακόμη. 7.2.9. Οι αντικειμενοφόροι πλάκες βυθίζονται για σύντομο χρονικό διάστημα σε νερό Milli Q και τοποθετούνται σε διηθητικό χαρτί. Η περίσσεια υγρασίας απομακρύνεται καλύπτοντας την επιφάνεια απαλά με διηθητικό χαρτί. Προστίθενται με σιφώνιο 5−10 µl αντιξεθωριαστικού διαλύματος έγκλεισης (e.g. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA ή ισοδύναμα) σε κάθε φατνίο και εφαρμόζεται μεγάλη καλυπτρίδα (24 x 60 mm) σε ολόκληρη την αντικειμενοφόρο πλάκα. 7.3. Ανάγνωση της δοκιμής FISH 7.3.1. Εξετάζονται οι αντικειμενοφόροι πλάκες αμέσως με μικροσκόπιο προσαρμοσμένο για μικροσκοπία επιφθορισμού σε μεγέθυνση 630 ή 1000x με έλαιο κατάδυσης. Με φίλτρο κατάλληλο για ισοθειοκυανική φθορεϊσίνη (FITC), τα ευβακτηριακά κύτταρα (συμπεριλαμβανομένων των περισσοτέρων αρνητικών κατά Gram κυττάρων) στο δείγμα είναι χρωσμένα πράσινα φθορίζοντα. Εάν χρησιμοποιηθεί φίλτρο 5−ισοθειοκυανικής τετραμεθυλοροδαμίνης, τα κύτταρα του R. solanacearum που έχουν χρωσθεί με Cy3 εμφανίζονται φθορίζοντα κόκκινα. Συγκρίνεται η μορφολογία των κυττάρων με αυτή των θετικών μαρτύρων. Τα κύτταρα πρέπει να είναι πλήρως χρωσμένα με λαμπρό φθορισμό. Η δοκιμή FISH (ενότητα VI.A.7.) πρέπει να επαναληφθεί αν η χρώση παρεκκλίνει. Τα φατνία εξετάζονται κατά δύο κάθετες διαμέτρους και στην περίμετρό τους. Όσον αφορά τα δείγματα που δεν δείχνουν καθόλου κύτταρα ή δείχνουν μικρό αριθμό κυττάρων, πρέπει να παρατηρηθούν τουλάχιστον 40 πεδία μικροσκοπίου. 7.3.2. Εξετάζεται εάν υπάρχουν λαμπρώς φθορίζοντα κύτταρα με τη χαρακτηριστική μορφολογία του R. solanacearum στα φατνία δοκιμής των αντικειμε σμού πρέπει να είναι ισοδύναμη ή καλύτερη από αυτήν της χρώσης των θετικών μαρτύρων. Κύτταρα με ατελή χρώση ή με ασθενή φθορισμό δεν πρέπει να λαμβάνονται υπόψη. 7.3.3. Εάν υπάρχει υπόνοια μόλυνσης, η δοκιμή πρέπει να επαναληφθεί. Αυτό μπορεί να ισχύει εάν όλες οι αντικειμενοφόροι μιας παρτίδας δείχνουν θετικά κύτταρα λόγω μόλυνσης του ρυθμιστικού διαλύματος ή εάν βρεθούν θετικά κύτταρα (εκτός των φατνίων της αντικειμενοφόρου) στην επικάλυψη της αντικειμενοφόρου. 7.3.4. Υπάρχουν διάφορα προβλήματα σύμφυτα με την εξειδίκευση της δοκιμής FISH. Τα ιζήματα των κώνων από τα σημεία πρόσφυσης του στολονίου και των τμημάτων των στελεχών ενδέχεται να περιέχουν, αν και πολύ λιγότερο συχνά από τη δοκιμή IF, πληθυσμούς φθοριζόντων κυττάρων μη τυπικής μορφολογίας καθώς και μη ειδικώς αντιδρώντα σαπροφυτικά βακτήρια όμοιου μεγέθους και μορφολογίας με το R. solanacearum. 7.3.5. Λαμβάνονται υπόψη μόνον τα φθορίζοντα κύτταρα με τυπικό μέγεθος και μορφολογία. 7.3.6. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμής FISH: i) Έγκυρα αποτελέσματα από τη δοκιμή FISH παρέχονται όταν, χρησιμοποιώντας φίλτρο FITC, παρατηρούνται κύτταρα που είναι χρωσμένα με λαμπρό φθορίζον πράσινο χρώμα και διαθέτουν το τυπικό μέγεθος και μορφολογία του R. solanacearum και, όταν, χρησιμοποιώντας φίλτρο ροδαμίνης, παρατηρούνται κύτταρα χρωσμένα με λαμπρό φθορίζον κόκκινο χρώμα σε όλους τους θετικούς μάρτυρες και σε κανέναν αρνητικό μάρτυρα. Εάν σε ένα δείγμα εντοπίζονται λαμπρώς φθορίζοντα κύτταρα με χαρακτηριστική μορφολογία, εκτιμάται ο μέσος αριθμός τυπικών κυττάρων ανά πεδίο μικροσκοπίου και υπολογίζεται ο αριθμός των τυπικών κυττάρων ανά ml του αναδιαλυμένου ιζήματος (προσάρτημα 4). Τα δείγματα με τουλάχιστον 5x103 τυπικά κύτταρα ανά ml αναδιαλυμένου ιζήματος θεωρούνται ενδεχομένως μολυσμένα. Απαιτείται η διεξαγωγή περαιτέρω δοκιμών. Τα δείγματα με λιγότερα από 5x103 τυπικά κύτταρα ανά ml αναδιαλυμένου ιζήματος θεωρούνται αρνητικά. ii) Η δοκιμή FISH είναι αρνητική εάν κύτταρα χρωσμένα με λαμπρό φθορίζον κόκκινο χρώμα, τα οποία έχουν το τυπικό μέγεθος και μορφολογία του R. solanacearum, δεν παρατηρούνται με φίλτρο ροδαμίνης, υπό την προϋπόθεση ότι τυπικά κύτταρα χρωσμένα με λαμπρό φθορίζον κόκκινο χρώμα παρατηρούνται στα παρασκευάσματα θετικών μαρτύρων όταν χρησιμοποιείται φίλτρο ροδαμίνης.

Δοκιμες ELISA Αρχή Η δοκιμή ELISA είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί μόνον ως προαιρετική δοκιμή επιπροσθέτως προς τις δοκιμές IF, PCR ή FISH λόγω της σχετικά χαμηλής ευαισθησίας της δοκιμής αυτής. Όταν χρησιμοποιείται η DAS ELISA, είναι υποχρεωτικός ο εμπλουτισμός και η χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων (βλέπε ιστοχώρο http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Ο εμπλουτισμός των δειγμάτων πριν από τη χρήση της δοκιμής ELISA ενδέχεται να χρησιμεύσει για την ενίσχυση της ευαισθησίας της δοκιμής, αλλά μπορεί να αποτύχει λόγω ανταγωνισμού από άλλους οργανισμούς στο δείγμα. Σημείωση: Χρησιμοποιούμε επικυρωμένη πηγή αντισωμάτων του R. Solanacearum (βλέπε ιστοχώρο http:// forum.europa.eu.int/Public/ irc/sanco/Home/main). Συνιστάται ο προσδιορισμός του τίτλου για κάθε νέα παρτίδα αντισωμάτων. Ως τίτλος ορίζεται η μεγαλύτερη αραίωση στην οποία λαμβάνει χώρα η βέλτιστη αντίδραση όταν υποβάλλεται σε δοκιμή αιώρημα που περιέχει 105 έως 106 κύτταρα ανά ml του ομόλογου στελέχους του R. solanacearum και χρησιμοποιείται κατάλληλο δευτερεύον σύμπλοκο αντισωμάτων σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Κατά τη διάρκεια της δοκιμής, τα αντισώματα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε αραίωση εργασίας στον τίτλο ή κοντά στον τίτλο του εμπορικού σκευάσματος. Προσδιορίζουμε τον τίτλο των αντισωμάτων σε αιώρημα 105 έως 106 κυττάρων ανά ml ομόλογου στελέχους του R. solanacearum. Περιλαμβάνουμε εκχύλισμα δείγματος που προηγουμένως ήταν αρνητικό στις δοκιμές όσον αφορά το R. solanacearum και αιώρημα ενός μη ειδικώς αντιδρώντος βακτηρίου σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα άλατος (PBS) ως αρνητικούς μάρτυρες. Ως θετικό μάρτυρα χρησιμοποιούμε κατάλληλες ποσότητες εκχυλίσματος δείγματος που προηγουμένως ήταν αρνητικό στις δοκιμές, αναμεμειγμένες με 103 έως 104 κύτταρα ανά ml του R. solanacearum βιοποικιλία 2 (π.χ. στέλεχος NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, βλέπε προσάρτημα 2 A και B). Για τη σύγκριση των αποτελεσμάτων σε κάθε πλάκα χρησιμοποιούμε τυποποιημένο αιώρημα 105 έως 106 κυττάρων ανά ml σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα άλατος (PBS) του R. solanacearum. Εξασφαλίζουμε ότι οι θετικοί μάρτυρες είναι καλά διαχωρισμένοι στη μικρότιτλη πλάκα από το(−α) υπό εξέταση δείγμα(−τα). Στο προσάρτημα 3 Α παρατίθενται τυποποιημένα υλικά θετικών και αρνητικών μαρτύρων που διατίθενται προς χρήση με αυτή τη δοκιμή. Το υλικό των μαρτύρων δοκιμάζεται με τρόπο ταυτόσημο με εκείνο του ή των δειγμάτων. Έχουν επικυρωθεί δύο πρωτόκολλα ELISA.

Βιοδοκιμή Σημείωση: Οι προκαταρκτικές δοκιμές με τη μέθοδο αυτή θα πρέπει να καθιστούν δυνατή την αναπαραγώγιμη ανίχνευση 103 έως 104 μονάδων του R. solanacearum που σχηματίζουν αποικίες ανά ml που προστίθεται σε εκχυλίσματα δειγμάτων που προηγούμενως ήταν αρνητικά στις δοκιμές (για την παρασκευή βλέπε προσάρτημα 3). Η ύψιστη ευαισθησία της ανίχνευσης μπορεί να αναμένεται όταν χρησιμοποιείται εκχύλισμα δείγματος που έχει μόλις παρασκευασθεί και υπάρχουν οι βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης. Ωστόσο, η μέθοδος μπορεί να εφαρμοσθεί επιτυχώς σε εκχυλίσματα που έχουν αποθηκευθεί σε γλυκερίνη στους −68 έως −86 °C. Το ακόλουθο πρωτόκολλο βασίζεται στον Janse (1988): 9.1. Χρησιμοποιούνται 10 προς δοκιμή φυτά μιάς ευπαθούς ποικιλίας τομάτας (π.χ. Moneymaker ή ποικιλία με ισοδύναμη ευπάθεια όπως έχει προσδιορισθεί από το εργαστήριο δοκιμής) στο στάδιο του 3ου πραγματικού φύλλου για κάθε δείγμα. Για τις λεπτομέρειες καλλιέργειας, βλέπε προσάρτημα 8. Εναλλακτικά, χρησιμοποιούνται φυτά μελιτζάνας (π.χ. ποικιλίας Black Beauty ή ποικιλίες με ισοδύναμη ευπάθεια), χρησιμοποιούνται μόνον φυτά στο στάδιο των 2−3 φύλλων έως την πλήρη έκπτυξη του τρίτου πραγματικού φύλλου. Έχει δειχθεί ότι στα φυτά μελιτζάνας τα συμπτώματα είναι λιγότερο έντονα και αναπτύσσονται με πιο αργό ρυθμό. Στις περιπτώσεις που αυτό είναι δυνατόν, συνιστάται επομένως η χρήση σπορόφυτων τομάτας. 9.2. 100 µl του εκχυλίσματος δείγματος κατανέμονται μεταξύ των πειραματοφύτων. 9.2.1. Μόλυνση με σύριγγα Τα στελέχη των φυτών μολύνονται ακριβώς πάνω από τις κοτυληδόνες με μια σύριγγα με υποδερμική βελόνα (τουλάχιστον 23G). Το δείγμα κατανέμεται μεταξύ των πειραματοφύτων. 9.2.2. Μόλυνση σχισμής Το φυτό συγκρατείται μεταξύ δύο δακτύλων και μια σταγόνα (περίπου 5−10 µl) του αιωρήματος του ιζήματος τοποθετείται με σιφώνιο επί του στελέχους, μεταξύ των κοτυληδόνων και του πρώτου φύλλου. Με ένα αποστειρωμένο νυστέρι, πραγματοποιείται στο στέλεχος μια διαγώνια τομή, μήκους 1,0 cm και βάθους ίσου προς τα 2/3 περίπου της διαμέτρου του στελέχους, αρχίζοντας την τομή από τη σταγόνα του ιζήματος. Η τομή καλύπτεται με αποστειρωμένη βαζελίνη από μια σύριγγα. 9.3. Πέντε (5) σπορόφυτα μολύνονται με την ίδια τεχνική με υδατικό αιώρημα 105 έως 106 κυττάρων ανά ml που έχει παρασκευασθεί από 48ωρη καλλιέργεια παθογόνου στελέχους του R. solanacearum βιοποικιλίας 2 ως θετικοί μάρτυρες και με ρυθμιστικό διάλυμα ιζήματος (προσάρτημα 4) ως αρνητικοί μάρτυρες. Τα φυτά θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες, διαχωρίζονται από τα άλλα φυτά προς αποφυγή επιμολύνσεων. 9.4. Τα πειραματόφυτα αναπτύσσονται σε εγκαταστάσεις καραντίνας για χρονικό διάστημα έως 4 εβδομάδες στους 25−30°C και υψηλή σχετική υγρασία και κατάλληλο πότισμα για την αποφυγή υπεράρδευσης ή μάρανσης λόγω έλλειψης νερού. Για την αποφυγή της μόλυνσης, επωάζουμε τα φυτά θετικούς μάρτυρες και αρνητικούς μάρτυρες σε σαφώς διαχωρισμένους πάγκους σε θερμοκήπιο ή θάλαμο ανάπτυξης ή, στην περίπτωση που ο χώρος είναι περιορισμένος, εξασφαλίζουμε τον αυστηρό ΦΕΚ 137 ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) 3013 στο άλλο, διαχωρίζονται με τα κατάλληλα παραπετάσματα. Κατά τη λίπανση, το πότισμα, την επιθεώρηση και οιουσδήποτε άλλους χειρισμούς δίδεται εξαιρετική προσοχή ώστε να αποφεύγεται τυχόν επιμόλυνση. Είναι σημαντικό να διατηρούνται τα θερμοκήπια και οι θάλαμοι ανάπτυξης απαλλαγμένα από όλα τα έντομα εχθρούς καθώς μπορεί αυτά να μεταδίδουν το βακτήριο από δείγμα σε δείγμα. Παρατηρούμε για συμπτώματα μαρασμού, επιναστίας, χλώρωσης ή/και νανισμού. 9.5. Απομονώνουμε από προσβεβλημένα φυτά (ενότητα II.3.) και ταυτοποιούμε καθαρές καλλιέργειες πιθανού R. solanacearum (ενότητα VI.B.). 9.6. Εάν δεν παρατηρηθούν συμπτώματα μετά από 3 εβδομάδες, πραγματοποιείται δοκιμή IF/PCR/απομόνωση σε σύνθετο δείγμα τμημάτων στελεχών μήκους 1 cm από κάθε φυτό δοκιμής που έχουν ληφθεί πάνω από το σημείο μόλυνσης. Εάν η δοκιμή είναι θετική, πραγματοποιούμε εξάπλωση αραιώσεων σε στερεό υπόστρωμα (ενότητα 4.1). 9.7. Ταυτοποιούμε τυχόν καθαρές καλλιέργειες πιθανού R. solanacearum (ενότητα VI.B.). Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της βιοδοκιμής Τα αποτελέσματα της βιοδοκιμής είναι έγκυρα όταν τα φυτά του θετικού μάρτυρα εμφανίζουν τυπικά συμπτώματα, τα βακτήρια είναι δυνατόν να απομονωθούν εκ νέου από τα εν λόγω φυτά και δεν εντοπίζονται συμπτώματα στους αρνητικούς μάρτυρες. Η βιοδοκιμή είναι αρνητική αν τα φυτά δοκιμής δεν είναι προσβεβλημένα από R. solanacearum υπό τον όρο ότι το R. solanacearum ανιχνεύεται στους θετικούς μάρτυρες. Η βιοδοκιμή είνα θετική αν τα φυτά δοκιμής είναι προσβεβλημένα από R. solanacearum. Β. Δοκιμές ταυτοποίησης Ταυτοποιούνται οι καθαρές καλλιέργειες των πιθανών απομονώσεων του R. solanacearum χρησιμοποιώντας τουλάχιστον δύο από τις ακόλουθες δοκιμές που βασίζονται σε διαφορετικές βιολογικές αρχές. Για κάθε δοκιμή που πραγματοποιείται (βλέπε προσάρτημα 3), συμπεριλαμβάνονται γνωστά στελέχη αναφοράς όπου ενδείκνυται.

Θρεπτικές και ενζυματικές δοκιμές ταυτοποίησης Προσδιορίζονται οι ακόλουθες φαινοτυπικές ιδιότητες που παρουσιάζει ή όχι εν γένει το R. solanacearum, σύμφωνα με τις μεθόδους των Lelliott και Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001) Δοκιμή Αναμενόμενο αποτέλεσμα Παραγωγή φθορίζουσας χρωστικής – Έγκλειστα πολυ −β− υδροξυβουτυρικού + Δοκιμή οξείδωσης/ζύμωσης (O/F) O+/F– Δραστηριότητα καταλάσης + Δοκιμή οξειδάσης Kovac + Αναγωγή νιτρικών ιόντων + Χρησιμοποίηση κιτρικών ιόντων + Ανάπτυξη στους 40 °C – Ανάπτυξη σε 1% NaCl + Ανάπτυξη σε 2% NaCl – Δραστηριότητα διυδρολάσης της αργινίνης – Υγροποίηση ζελατίνης – Υδρόλυση αμύλου – Υδρόλυση αισκουλίνης – Παραγωγή levan –

Δοκιμή IF 2.1. Παρασκευάζεται αιώρημα περίπου 106 κυττάρων ανά ml σε ρυθμιστικό διάλυμα IF (προσάρτημα 4). 2.2. Παρασκευάζεται σειρά διπλών αραιώσεων κατάλληλου αντιορρού (βλέπε ιστοχώρο http://forum.europa. eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). 2.3. Εφαρμόζουμε τη διαδικασία IF (ενότητα VI.A.5.). 2.4. Επιτυγχάνεται θετική δοκιμή IF εάν ο τίτλος IF της καλλιέργειας είναι ισοδύναμος με αυτόν του θετικού μάρτυρα.

Δοκιμή ELISA Σημείωση: Εάν πραγματοποιούμε μόνον 2 δοκιμές ταυτοποίησης, δεν χρησιμοποιούμε άλλη ορρολογική δοκιμή επιπροσθέτως προς τη μέθοδο αυτή. 3.1. Παρασκευάζεται αιώρημα περίπου 108 κυττάρων ανά ml σε 1X PBS (προσάρτημα 4). 3.2. Πραγματοποιούμε την κατάλληλη διαδικασία ELISA με εξειδικευμένο μονοκλωνικό αντίσωμα του R. solanacearum. 3.3. Η δοκιμή ELISA είναι θετική εάν η ανάγνωση ELISA που προκύπτει από την καλλιέργεια είναι τουλάχιστον η μισή από αυτήν που προκύπτει από το θετικό μάρτυρα.

Δοκιμές PCR 4.1. Παρασκευάζεται αιώρημα περίπου 106 κυττάρων ανά ml σε αποστειρωμένο νερό μοριακού βαθμού καθαρότητας. 4.2. Θερμαίνονται 100 µl του αιωρήματος κυττάρων σε κλειστούς σωλήνες σε θερμικό μπλοκ ή αναβράζον υδατόλουτρο στους 100 °C για 4 λεπτά. Τα δείγματα μπορούν τότε να αποθηκευθούν σε θερμοκρασία −16 έως − 24 °C έως ότου χρειασθεί να χρησιμοποιηθούν. 4.3. Εφαρμόζονται οι κατάλληλες διαδικασίες PCR για την ενίσχυση των αμπλικονίων που είναι ειδικά για το R. solanacearum [π.χ. Seal et al. (1993)· Pastrik και Maiss, (2000)· Pastrik et al. (2002)· Boudazin et al. (1999)· Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)]. 4.4. Επιτυγχάνεται θετική ταυτοποίηση του R. solanacearum εάν τα αμπλικόνια της PCR έχουν το ίδιο μέγεθος και τους ίδιους πολυμορφισμούς μήκους θραυσμάτων εκ περιορισμού όπως το στέλεχος των θετικών μαρτύρων.

Δοκιμή FISH 5.1. Παρασκευάζεται αιώρημα περίπου 106 κυττάρων ανά ml σε UPW. 5.2. Εφαρμόζεται η διαδικασία FISH (ενότητα VI.A.7.) με τουλάχιστον 2 ολιγοανιχνευτές ειδικούς για το R. solanacearum (προσάρτημα 7). 5.3. Επιτυγχάνεται θετική δοκιμή FISH εάν επιτυγχάνονται οι ίδιες αντιδράσεις από την καλλιέργεια και το θετικό μάρτυρα.

Προφίλ σε λιπαρά οξέα (FAP) 6.1. Η καλλιέργεια αναπτύσσεται σε trypticase soy agar (Oxoid) για 48 ώρες στους 28 °C. 6.2. Εφαρμόζεται κατάλληλη διαδικασία FAP (Janse, 1991· Stead, 1992). 6.3. Επιτυγχάνεται θετική δοκιμή FAP εάν το προφίλ της πιθανής καλλιέργειας είναι το ίδιο με αυτό του θετικού μάρτυρα. Η παρουσία χαρακτηριστικών λιπαρών κτική ενός είδους του γένους Ralstonia.

Μέθοδοι χαρακτηρισμού στελέχους Ο χαρακτηρισμός στελέχους χρησιμοποιώντας μία από τις ακόλουθες μεθόδους συνιστάται για κάθε νέα περίπτωση απομόνωσης του R. solanacearum. Στις περιπτώσεις που κάτι τέτοιο ενδείκνυται, συμπεριλαμβάνονται γνωστά στελέχη αναφοράς για κάθε δοκιμή που πραγματοποιείται (βλέπε προσάρτημα 3). 7.1. Χαρακτηρισμός βιοποικιλίας Το R. solanacearum χωρίζεται σε βιοποικιλίες με βάση την ικανότητά τους να χρησιμοποιούν ή/και να οξειδώνουν τρεις δισακχαρίτες και τρεις εξοζοαλκοόλες (Hayward, 1964 και Hayward et al., 1990). Το υπόστρωμα ανάπτυξης για τη δοκιμή βιοποικιλίας περιγράφεται στο προσάρτημα 2. Η δοκιμή μπορεί να διεξαχθεί με επιτυχία με μόλυνση με βελόνα του υποστρώματος με καθαρές καλλιέργειες απομονώσεων του R. solanacearum και επώαση στους 28 ΊC. Εάν τα υποστρώματα κατανέμονται σε αποστειρωμένες πλάκες καλλιέργειας κυττάρων των 96 φατνίων (200 µl ανά φατνίο), είναι δυνατόν να παρατηρηθεί εντός 72 ωρών αλλαγή χρώματος από το πράσινο της ελιάς στο κίτρινο, πράγμα που αποτελεί ένδειξη θετικού αποτελέσματος της δοκιμής. Βιοποικιλία 1 2 345 Χρήση: Μαλτόζης – + +–+ Λακτόζης – + + – + D (+) Κελλοβιόζης – + +–+ Μαννιτόλης – – + + + Σορβιτόλης – – + + – Δουλκιτόλης – – + + – Επιπρόσθετες δοκιμές διαφοροποιούν τη βιοποικιλία 2 σε υπο−φαινότυπους. Βιοποικιλία 2Α (Παγκόσμια εξάπλωση) Βιοποικιλία 2Α (Στη Χιλή και την Κολομβία) Βιοποικιλία 2Τ (Σε τροπικές περιοχές) Χρησιμοποίηση τρεαλόζης – ++ Χρησιμοποίηση μεσοινoσιτόλης + –+ Χρησιμοποίηση D ριβόζης – –+ Πηκτινολυτική δραστηριότητα(1 ) χαμηλή χαμηλή υψηλή 1 ) Βλέπε Lelliott and Stead (1987). 7.2. Το γενωμικό αποτύπωμα Η μοριακή διαφοροποίηση των στελεχών στο σύμπλοκο R. solanacearum μπορεί να επιτευχθεί με διάφορες τεχνικές, συμπεριλαμβανομένων των εξής: 7.2.1. Ανάλυση πολυμορφισμού μήκους θραυσμάτων εκ περιορισμού (RFLP) (Cook et al., 1989). 7.2.2. Επαναληπτική αλληλουχία PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές REP, BOX και ERIC (Louws et al., 1995· Smith et al., 1995). 7.2.3. Ανάλυση πολυμορφισμού ενισχυμένου μήκους θραυσμάτων (AFLP) (Van der Wolf et al., 1998). 7.3. Μέθοδοι PCR Ειδικοί εκκινητές PCR (Pastrik et al, 2002· βλέπε προσάρτημα 6) είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν για τη διαφοροποίηση στελεχών που ανήκουν στην ομάδα 1 (βιοποικιλίες 3, 4 και 5) και στην ομάδα 2 (βιοποικιλίες 1, 2A και 2T) του R. solanacearum, όπως προσδιορίσθηκαν αρχικά από την ανάλυση RFLP (Cook et al., 1989) και την εύρεση της αλληλουχίας των 16S rDNA (Taghavi et al., 1996). Γ. ΔΟΚΙΜΗ ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗΣ Η δοκιμή παθογένειας πρέπει να πραγματοποιείται ως τελική επιβεβαίωση της διάγνωσης του R. solanacearum καθώς και για την εκτίμηση της παθογένειας των καλλιεργειών που ταυτοποιούνται ως R. solanacearum. 1) Παρασκευάζεται μόλυσμα περίπου 106 κυττάρων ανά ml από καλλιέργεια 24−48 ωρών της απομόνωσης προς εξέταση και κατάλληλο στέλεχος θετικού μάρτυρα του R. solanacearum (π.χ. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857· βλέπε προσάρτημα 3). 2) Μολύνουμε 5−10 ευπαθή σπορόφυτα τομάτας ή μελιτζάνας στο στάδιο του τρίτου πραγματικού φύλλου (βλέπε ενότητα VI.A.9). 3) Επωάζουμε για μέγιστο χρονικό διάστημα 2 εβδομάδων στους 25−28 °C και σε υψηλή σχετική υγρασία με κατάλληλο πότισμα έτσι ώστε να αποφευχθεί η υπεράρδευση ή η καταπόνηση από ξηρασία. Με καθαρές καλλιέργειες, η τυπική μάρανση θα πρέπει να εμφανιστεί εντός 14 ημερών. Εάν δεν εμφανιστούν συμπτώματα μετά το εν λόγω χρονικό διάστημα, η καλλιέργεια δεν μπορεί να επαληθευθεί ως παθογόνος μορφή του R. solanacearum. 4) Παρατηρούμε για συμπτώματα μαρασμού ή/και επιναστία, χλώρωση ή νανισμό. 5) Πραγματοποιείται απομόνωση από φυτά που παρουσιάζουν συμπτώματα με αφαίρεση τμήματος του στελέχους 2 cm πάνω από το σημείο μόλυνσης. Τεμαχίζουμε τους ιστούς και παρασκευάζουμε αιώρημα σε ένα μικρό όγκο αποστειρωμένου, αποσταγμένου νερού ή σε 50 mM ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (προσάρτημα 4). Απομονώνουμε από το αιώρημα με εξάπλωση αραιώσεων ή γραμμική εξάπλωση σε κατάλληλο υπόστρωμα, κατά προτίμηση σε εκλεκτικό υπόστρωμα (προσάρτημα 2), επωάζουμε για 48−72 ώρες στους 28 °C και παρατηρούμε το σχηματισμό τυπικών αποικιών του R. solanacearum. Προσάρτημα 1 Εμπλεκόμενα εργαστήρια στη βελτιστοποίηση και επικύρωση των πρωτοκόλλων Εργαστήριο(1 ) Θέση Χώρα Agentur fόr Gesundheit und Ernahrungssicherheit Βιέννη και Linz Αυστρία Departement Gewasbescherming Merelbeke Βέλγιο Plantedirektoratet Lyngby Δανία Central Science Laboratory York Αγγλία Scottish Agricultural Science Agency Εδιμβούργο Σκωτία Laboratoire National de la Protection des Vιgιtaux, Unitι Bactιriologie Angers Γαλλία Laboratoire National de la Protection des Vιgιtaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre Le Rheu Γαλλία Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Γερμανία Pflanzenschutzamt Hannover Αννόβερο Γερμανία State Laboratory Δουβλίνο Ιρλανδία