Προεδρικά Διατάγματα — ΦΕΚ A' 137/2007

Η χρήση άλλων αντιδραστηρίων από αυτά που αναφέρονται παραπάνω ενδέχεται να επηρεάσει την ανάπτυξη του R. solanacearum.

Το Oxoid Agar #1 μπορεί να χρησιμοποιηθεί αντί για το Bacto−Agar (Difco). Στην περίπτωση αυτή, η ανάπτυξη του R. solanacearum θα είναι βραδύτερη, αν και ενδέχεται να μειωθεί επίσης η ανάπτυξη ανταγωνιστικών σαπροφύτων. Για το σχηματισμό των τυπικών αποικιών του R. solanacearum ενδέχεται να χρειαστούν 1−2 ημέρες παραπάνω και ο κόκκινος χρωματισμός ενδέχεται να είναι πιο απαλός και πιο διάχυτος απ’ ό,τι στο Bacto−Agar.

Η αύξηση της συγκέντρωσης βακιτρακίνης σε 2500 U ανά L ενδέχεται να μειώσει τους πληθυσμούς των ανταγωνιστικών βακτηρίων χωρίς να επηρεάσει την ανάπτυξη του Ralstonia solanacearum. Αποθηκεύουμε τα θρεπτικά υποστρώματα και τα πυκνά διαλύματα αντιβιοτικών στους 4 °C στο σκοτάδι και τα χρησιμοποιούμε εντός ενός μήνα. Τα τρυβλία πρέπει να είναι απαλλαγμένα από συμπύκνωση στην επιφάνεια πριν από τη χρήση. Αποφεύγουμε το υπερβολικό στέγνωμα των τρυβλίων. Πρέπει να πραγματοποιείται έλεγχος ποιότητας μετά την παρασκευή κάθε νέας παρτίδας υποστρώματος με την εξάπλωση σε τρυβλία του αιωρήματος της καλλιέργειας αναφοράς του R. solanacearum (βλέπε προσάρτημα 3) και την εξέταση ενδεχόμενου σχηματισμού τυπικών αποικιών μετά την επώαση στους 28 °C για 25 ημέρες.

National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, ΗΒ.

Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Κάτω Χώρες.

Collection Franηaise de Bactιries Phytopathogθnes (CFBP), INRA Station Phytobactιriologie, Angers, Γαλλία. Πίνακας 1: Κατάλογος αναφοράς SMT απομονώσεων του R. solanacearum Κωδικός NCPPB SMT # ΑΛΛΟΙ ΚΩΔΙΚΟΙ ΧΩΡΑ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ Βιοποικιλία NCPPB 4153 6 CFBP 4582, Pr 3020, EURS11 Αίγυπτος 2 NCPPB 4154 10 CFBP 4585, 550, EURS21 Τουρκία 2 NCPPB 3857 12 CFBP 4587, Pr 1140, EURS26 Αγγλία 2 NCPPB 1584 23 CFBP 4598, EURS49 Κύπρος 2 NCPPB 2505 24 CFBP 4599, EURS50 Σουηδία 2 NCPPB 4155 26 CFBP 4601, 502, EURS55 Βέλγιο 2 NCPPB 4156( ) 71( ) PD 2762, CFBP 3857 Κάτω Χώρες 2 NCPPB 4157 66 LNPV 15.59 Γαλλία 2 NCPPB 4158 39 CFBP 4608, Port 448, EURS80 Πορτογαλία 2 NCPPB 4160 69 IVIA−1632−2 Ισπανία 2 NCPPB 4161 76 B3B Γερμανία 2 NCPPB 325 41 CFBP 2047, KEL60−1, R842 ΗΠΑ 1 NCPPB 3967 42 CFBP 4610, R285, GONg7 Κόστα Ρίκα 1 NCPPB 4028 43 CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205 Κολομβία 2 NCPPB 3985 44 CFBP 4612, R578, CIP312 Περού 2T NCPPB 3989 45 CFBP 4613, R568, CIP226 Βραζιλία 2T NCPPB 3996 46 CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225 Περού 3 NCPPB 3997 47 CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a Αυστραλία 3 NCPPB 4029 48 CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861 Σρι Λάνκα 4 NCPPB 4005 49 CFBP 4616, R470 Φιλιππίνες 4 NCPPB 4011 50 CFBP 4617, R288, HEmps2 Κίνα 5 (*) Χρησιμοποιούμε ως τυποποιημένο στέλεχος αναφοράς του R. solanacearum βιοποικιλία 2 (φυλή 3). Σημείωση: Η αυθεντικότητα των ανωτέρω στελεχών μπορεί να είναι εγγυημένη μόνον εάν παρέχονται από αυθεντική συλλογή καλλιεργειών. Πίνακας 2: Κατάλογος αναφοράς SMT ορολογικά ή γενετικά σχετιζομένων βακτηρίων για χρήση στη βελτιστοποίηση των δοκιμών ανίχνευσης. Κωδικός NCPPB SMT # Άλλος κωδικός Ταυτοποίηση NCPPB 4162 51 CFBP 1954 Bacillus polymyxa(1 ) NCPPB 4163 52 CFBP 1538 Pseudomonas marginalis pv. marginalis(1 ) NCPPB 4164 – CFBP 2227 Burkholderia cepacia(2 ) NCPPB 4165 – CFBP 2459 Ralstonia pickettii(2 ) NCPPB 4166 58 CFBP 3567 CSL Pr1150 Ralstonia pickettii(1 ) NCPPB 4167 60 CFBP 4618 PD 2778 Ralstonia sp.(1 ) NCPPB 1127 53 CFBP 3575 Burkholderia andropogonis(1 ) NCPPB 353 54 CFBP 3572 Burkholderia caryophylli(1 ) NCPPB 945 55 CFBP 3569 Burkholderia cepacia(1 ) NCPPB 3708 56 CFBP 3574 Burkholderia glumae(1 ) NCPPB 3590 57 CFBP 3573 Burkholderia plantarii(1 ) NCPPB 3726 59 CFBP 3568 Banana Blood Disease Bacterium(1 ) ( 2 ) ( 3 ) NCPPB 4168 61 CFBP 4619 IPO S339 Enterobacter sp.(1 ) NCPPB 4169 62 IPO 1695 Enterobacter sp.(1 ) NCPPB 4170 63 CFBP 4621 IPO S306 Ochrobactrum anthropi(1 ) ( 2 ) NCPPB 4171 64 CFBP 4622 IPO 1693 Curtobacterium sp.(1 ) ( 2 ) NCPPB 4172 65 IPO 1696a Pseudomonas sp.(1 ) NCPPB 4173 – PD 2318 Aureobacterium sp.(2 ) NCPPB 4174 81 IVIA 1844,06 Flavobacterium sp.(1 ) ( 2 ) 1 ) Πιθανό διασταυρωτά αντιδρών στέλεχος σε ορολογικές δοκιμές (IF ή/και ELISA) με πολυκλωνικούς αντιορούς. 2 ) Στέλεχος από το οποίο το προϊόν PCR μπορεί να ενισχυθεί σε ορισμένα εργαστήρια σε όμοιο μέγεθος με αυτό που αναμένουμε όταν χρησιμοποιούμε τους εξειδικευμένους εκκινητές OLI−1 και Y−2 (βλέπε προσάρτημα 6). 3 ) Είναι σύνηθες να κάνει διασταυρωτή αντίδραση στις περισσότερες δοκιμές αλλά είναι γνωστό ότι υπάρχει μόνον στη μπανάνα στην Ινδονησία.

Ρυθμιστικά διαλύματα για τη διαδικασία εξαγωγής 1.1. Ρυθμιστικό διάλυμα εξαγωγής (50 mM ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, pH 7.0) Το εν λόγω ρυθμιστικό διάλυμα χρησιμοποιείται για την εξαγωγή του βακτηρίου από ιστούς φυτών με ομοιογενοποίηση ή ανάδευση. Na2 HPO4 (άνυδρο) 4,26 g KH2 PO4 2,72 g Αποσταγμένο νερό 1,00 L Διαλύονται τα συστατικά, ελέγχεται η τιμή του pH και το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά. Πρόσθετα συστατικά μπορούν να είναι χρήσιμα ως ακολούθως: Σκοπός Ποσότητα (ανά L) Lubrol flakes Αντικροκιδωτικό( ) 0,5 g DC silicone antifoam Αντιαφριστικός παράγοντας( ) 1,0 ml Tetrasodium pyrophosphate Αντιοξειδωτικό 1,0 g Polyvinylpyrrolidone40000 (PVP−40) Δέσμευση παρεμποδιστών της PCR 50 g ____ * ) Για χρήση στο πλαίσιο της μεθόδου εξαγωγής με ομοιογενοποίηση. 1.2. Ρυθμιστικό διάλυμα ιζήματος (10 mM ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, pH 7.2) Το εν λόγω ρυθμιστικό διάλυμα χρησιμοποιείται για επανασχηματισμό αιωρήματος και αραίωση εκχυλισμάτων κώνων από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου κονδύλων πατάτας μετά τη συγκέντρωση σε ίζημα μέσω φυγοκέντρισης. Na2 HPO4 .12H2 O 2,7 g NaH2 PO4 .2H2 O 0,4 g Αποσταγμένο νερό 1,0 L Διαλύονται τα συστατικά, ελέγχεται η τιμή του pH και το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά.

Ρυθμιστικά διαλύματα για τη δοκιμή IF 2.1. Ρυθμιστικό διάλυμα IF (10 mM φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα άλατος (PBS), pH 7.2) Το εν λόγω ρυθμιστικό διάλυμα χρησιμοποιείται για την αραίωση των αντισωμάτων. Na2 HPO4 .12H2 O 2,7 g NaH2 PO4 .2H2 O 0,4 g NaCL 8,0 g Αποσταγμένο νερό 1,0 L Διαλύονται τα συστατικά, ελέγχεται η τιμή του pH και το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά. 2.2. Ρυθμιστικό διάλυμα IF−Tween Αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα χρησιμοποιείται για την πλύση των αντικειμενοφόρων πλακών. Προστίθεται 0,1% Tween 20 στο ρυθμιστικό διάλυμα IF. 2.3. Φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα γλυκερίνης, pH 7.6 Αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα χρησιμοποιείται ως ρευστό έγκλεισης στα φατνία των αντικειμενοφόρων πλακών της IF για την ενίσχυση του φθορισμού. Na2 HPO4 .12H2 O 3,2 g NaH2 PO4 .2H2 O 0,15 g Γλυκερίνη 50 ml Αποσταγμένο νερό 100 ml Τα διαλύματα αντιξεθωριαστικού υλικού έγκλεισης διατίθενται στο εμπόριο π.χ. Vectashield® (Vector Laboratories) ή Citifluor® (Leica).

Ρυθμιστικά διαλύματα για την έμμεση δοκιμή ELISA 3.1. Ρυθμιστικό διάλυμα επικάλυψης, διπλής ισχύος, pH 9.6. Na2 CO3 6,36 g NaHCO3 11,72 g Αποσταγμένο νερό 1,00 L Διαλύονται τα συστατικά, ελέγχεται η τιμή του pH και το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά. Μπορεί να προστεθεί, ως αντιοξειδωτικό, θειώδες νάτριο (0,2%) εάν πρέπει να αποφευχθεί ο σχηματισμός οξειδωμένων αρωματικών ενώσεων. NaCl 80,0 g KH2 PO4 2,0 g Na2 HPO4 .12H2 O 29,0 g KCl 2,0 g Αποσταγμένο νερό 1,0 L 3.3. PBS−Tween 10X PBS 100 ml 10% Tween 20 5 ml Αποσταγμένο νερό 895 ml 3.4. Ρυθμιστικό διάλυμα φραγμού (αντισωμάτων) (πρέπει να έχει παρασκευαστεί πρόσφατα) 10X PBS 10,0 ml Polyvinylpyrrolidone−44000 (PVP−44) 2,0 g 10% Tween 20 0,5 ml Σκόνη γάλακτος 0,5 g Αποσταγμένο νερό συμπληρώνεται μέχρι τελικού όγκου 100 ml. 3.5. Διάλυμα υποστρώματος αλκαλικής φωσφατάσης, pH 9.8 Diethanolamine (Διαιθανολαμίνη) 97 ml Αποσταγμένο νερό 800 ml Αναμειγνύονται και ρυθμίζεται η τιμή σε pH 9.8 με πυκνό HCl. Συμπληρώνεται με αποσταγμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 1 λίτρου. Προστίθενται 0,2 g MgCl2 Διαλύονται 2 δισκία υποστρώματος φωσφατάσης των 5 mg (Sigma) ανά 15 ml διαλύματος.

Ρυθμιστικά διαλύματα για τη δοκιμή DASI ELISA 4.1. Ρυθμιστικό διάλυμα επικάλυψης, pH 9.6. Na2 CO3 1,59 g NaHCO3 2,93 g Αποσταγμένο νερό 1.000 ml Διαλύονται τα συστατικά και ελέγχεται το pH 9.6. 4.2. 10X φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα άλατος (PBS), pH 7.2− 7.4 NaCl 80,0 g NaH2 PO4 .2 H2 O 4,0 g Na2 HPO4 .12H2 O 27,0 g Αποσταγμένο νερό 1 000 ml 4.3. PBS−Tween 10X PBS 50 ml 10% Tween 20 5 ml Αποσταγμένο νερό 950 ml 4.4. Ρυθμιστικό διάλυμα υποστρώματος, pH 9.8. Diethanolamine (Διαιθανολαμίνη) 100 ml Αποσταγμένο νερό 900 ml Αναμειγνύονται και ρυθμίζεται η τιμή του pH 9.8 με πυκνό HCl. Προσάρτημα 5 Προσδιορισμός του επιπέδου μόλυνσης στις δοκιμές IF και FISH

Μετράται ο μέσος αριθμός των τυπικών φθοριζόντων κυττάρων ανά οπτικό πεδίο (c).

Υπολογίζεται ο αριθμός των τυπικών φθοριζόντων κυττάρων ανά φατνίο αντικειμενοφόρου πλάκας μικροσκοπίου (C). C = c x S/s όπου S = εμβαδόν του φατνίου μιας πολυφατνιακής αντικειμενοφόρου και s = εμβαδόν του οπτικού πεδίου του αντικειμενικού s = πi2 /4G2 K2 όπου i = συντελεστής πεδίου (κυμαίνεται από 8 έως 24 ανάλογα με τον τύπο του προσοφθαλμίου) K = συντελεστής σωλήνα (1 ή 1,25) G = μεγεθυντική ισχύς του αντικειμενικού φακού (100x, 40x κ.τ.λ.)

Υπολογίζεται ο αριθμός τυπικών φθοριζόντων κυττάρων ανά ml αναδιαλυμένου ιζήματος (N) N = C x 1000/y x F όπου y = όγκος του αναδιαλυμένου ιζήματος σε κάθε φατνίο και F = συντελεστής αραίωσης του αναδιαλυμένου ιζήματος Προσάρτημα 6 Επικυρωμένα πρωτόκολλα και αντιδραστήρια PCR Σημείωση: Οι προκαταρκτικές δοκιμές πρέπει να επιτρέπουν την αναπαραγώγιμη ανίχνευση 10 3 έως 10 4 κυττάρων του R. solanacearum ανά ml εκχυλίσματος δείγματος. Οι προκαταρκτικές δοκιμές πρέπει επίσης να μην δείχνουν οιαδήποτε λανθασμένα θετικά αποτελέσματα με ένα σύνολο επιλεγμένων στελεχών βακτηρίων (βλέπε προσάρτημα 3).

Πρωτόκολλο PCR των Seal et al. ,(1993) 1.1. Εκκινητές ολιγονουκλεοτιδίων Πρόσθιος εκκινητής OLI−1 5΄−GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC−3΄ Αντίστροφος εκκινητής Y−2 5΄−CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT−3΄ DNA του R. solanacearum = 288 bp 1.2. Μείγμα αντίδρασης PCR Αντιδραστήριο Ποσότητα ανά αντίδραση Τελική συγκέντρωση Αποστειρωμένο UPW 17,65 µl 10x ρυθμιστικό διάλυμα PCR(1 ) (15 mM MgCl2 ) 2,5 µl 1x (1,5 mM MgCl2 ) μείγμα dNTP (20mM) 0,25 µl 0,2 mM Εκκινητής OLI−1 (20 µM) 1,25 µl 1µM Εκκινητής Y−2 (20 µM) 1,25 µl 1µM Taq πολυμεράση (5U/µl) 1 0,1 µl 0,5 U Όγκος δείγματος 2,0 µl Συνολικός όγκος 25 µl 1 ) Η μέθοδος έχει επικυρωθεί με τη χρήση τηςTaq πολυμεράσης των Perkin Elmer (AmpliTaq) και Gibco BRL. 1.3. Συνθήκες αντίδρασης PCR Ακολουθείται το εξής πρόγραμμα: 1 κύκλος από: i) 2 λεπτά στους 96 °C (μετουσίωση του πρότυπου DNA)

Πρωτόκολλο PCR των Pastrik και Maiss, (2000) 2.1. Εκκινητές ολιγονουκλεοτιδίων Πρόσθιος εκκινητής Ps−1 5΄− AGT CGA ACG GCA GCG GGG G −3΄ Αντίστροφος εκκινητής Ps−2 5΄− GGG GAT TTC ACA TCG GTC TTG CA −3΄ DNA του R. solanacearum = 553 bp 2.2. Μείγμα αντίδρασης PCR Αντιδραστήριο Ποσότητα ανά αντίδραση Τελική συγκέντρωση Αποστειρωμένο UPW 16,025 µl 10x ρυθμιστικό διάλυμα PCR(1 ) 2,5 µl 1x (1,5 mM MgCl2 ) BSA (κλάσμα V) (10%) 0,25 µl 0,1% μείγμα d−ΝTP (20mM) 0,125 µl 0,1 mM Εκκινητής Ps−1 (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM Εκκινητής Ps−2 (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM Taq πολυμεράση (5U/ µl)(1 ) 0,1 µl 0,5 U Όγκος δείγματος 5,0 µl Συνολικός όγκος 25,0 µl 1 ) Οι μέθοδοι έχουν επικυρωθεί με τη χρήση της Taq πολυμεράσης των Perkin Elmer (AmpliTaq) και Gibco BRL. Σημείωση: Βελτιστοποιήθηκε αρχικά για τον θερμικό κυκλοποιητή MJ Research PTC 200 με Gibco Taq πολυμεράση. Μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν στις ίδιες συγκεντρώσεις η Perkin Elmer AmpliTaq καθώς και ρυθμιστικό διάλυμα. 2.3. Συνθήκες για την αντίδραση PCR Ακολουθείται το εξής πρόγραμμα: 1 κύκλος από: i) 5 λεπτά στους 95 °C (μετουσίωση του πρότυπουDNA) 35 κύκλοι από: ii) 30 δευτερόλεπτα στους 95 °C (μετουσίωση του πρότυπου DNA) iii) 30 δευτερόλεπτα στους 68 °C (προσκόλληση εκκινητών) iv) 45 δευτερόλεπτα στους 72 °C (επέκταση αντιγράφου) 1 κύκλος από: v) 5 λεπτά στους 72 °C (τελική επέκταση) vi) διατήρηση στους 4 °C Σημείωση: Το πρόγραμμα αυτό βελτιστοποιείται για χρήση με θερμικό κυκλοποιητή MJ Research PTC 200. Ενδέχεται να απαιτηθεί τροποποίηση της διάρκειας των βημάτων των κύκλων ii), iii) και iv) για χρήση με άλλα μοντέλα. 2.4. Ανάλυση του αμπλικονίου με ένζυμο περιορισμού Τα προϊόντα PCR που έχουν ενισχυθεί από το DNA του R. solanacearum παράγουν έναν χαρακτηριστικό πολυμορφισμό μήκους θραυσμάτων εκ περιορισμού με το ένζυμο Taq I μετά από επώαση στους 65 °C για 30 λεπτά. Τα θραύσματα εκ περιορισμού που αποκτώνται από το ειδικό για το R. solanacearum θραύσμα έχουν μέγεθος 457 bp και 96 bp.

Πρωτόκολλο πολλαπλής PCR με εσωτερικό μάρτυρα PCR (Pastrik et al., 2002) 3.1. Εκκινητές ολιγονουκλεοτιδίων Πρόσθιος εκκινητής RS−1−F 5΄− ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA −3΄ Αντίστροφος εκκινητής RS−1−R 5΄− CCC AGT CAC GGC AGA GAC T −3΄ Πρόσθιος εκκινητής NS−5−F 5΄− AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G −3΄ Αντίστροφος εκκινητής NS−6−R 5΄− GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC −3΄ μάρτυρα της PCR 18S rRNA = 310 bp (σετ εκκινητών NS) 3.2. Μείγμα αντίδρασης PCR Αντιδραστήριο Ποσότητα ανά αντίδραση Τελική συγκέντρωση Αποστειρωμένο UPW 12,625 µl 10x ρυθμιστικό διάλυμα PCR(1 ) (15 mM MgCl2 ) 2,5 µl 1x (1,5 mM MgCl2 ) BSA (κλάσμα V) (10%) 0,25 µl 0,1% μείγμα d−ΝTP (20mM) 0,125 µl 0,1 mM Εκκινητής RS−1−F (10µM) 2,0 µl 0,8 µM Εκκινητής RS−1−R (10µM) 2,0 µl 0,8 µM Εκκινητής NS−5−F (10µM)(2 ) 0,15 µl 0,06 µM Εκκινητής NS−6−R (10µM)(2 ) 0,15 µl 0,06 µM Taq πολυμεράση (5U/ µl)(1 ) 0,2 µl 1,0 U Όγκος δείγματος 5,0 µl Συνολικός όγκος 25,0 µl 1 ) Οι μέθοδοι έχουν επικυρωθεί με τη χρήση της Taq πολυμεράσης των Perkin Elmer (AmpliTaq) και Gibco BRL. 2 ) Η συγκέντρωση των εκκινητών NS−5−F και NS−6−R βελτιστοποιήθηκε για το εκχύλισμα κώνου από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου πατάτας χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ομοιογενοποίησης και τον καθαρισμό DNA σύμφωνα με τον Pastrik (2000) (βλέπε ενότητα VI.A.6.1.α.). Η επαναβελτιστοποίηση των συγκεντρώσεων αντιδραστηρίων απαιτείται εάν χρησιμοποιηθεί η εξαγωγή με ανάδευση ή άλλη μέθοδο απομόνωσης του DNA. 3.3. Συνθήκες για την αντίδραση PCR Ακολουθείται το εξής πρόγραμμα: 1 κύκλος από: i) 5 λεπτά στους 95 °C (μετουσίωση του προτύπου DNA) 35 κύκλοι από: ii) 30 δευτερόλεπτα στους 95 που DNA) iii) 30 δευτερόλεπτα στους 58 °C (προσκόλληση εκκινητών) iv) 45 δευτερόλεπτα στους 72 °C (επέκταση αντιγράφου) 1 κύκλος από: v) 5 λεπτά στους 72 °C (τελική επέκταση) vi) διατήρηση στους 4 °C Σημείωση: Το πρόγραμμα αυτό βελτιστοποιείται για χρήση με θερμικό κυκλοποιητή MJ Research PTC

Ενδέχεται να απαιτηθεί τροποποίηση της διάρκειας των βημάτων των κύκλων ii), iii) και iv) για χρήση με άλλα μοντέλα. 3.4. Ανάλυση του αμπλικονίου με ένζυμο περιορισμού Τα προϊόντα PCR που έχουν ενισχυθεί από το DNA του R. solanacearum παράγουν έναν χαρακτηριστικό πολυμορφισμό μήκους θραυσμάτων εκ περιορισμού με το ένζυμο Bsm I ή ένα ισοσχιζομερές (π.χ. Mva 1269 I) μετά από επώαση στους 65 °C για 30 λεπτά.

Πρωτόκολλο PCR εξειδικευμένο για βιοποικιλίες του R. solanacearum (Pastrik et al, 2001) 4.1. Εκκινητές ολιγονουκλεοτιδίων Πρόσθιος εκκινητής RS−1−F 5΄− ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA −3΄ Αντίστροφος εκκινητής RS−1−R 5΄− CCC AGT CAC GGC AGA GAC T −3΄ Αντίστροφος εκκινητής RS−3−R 5΄− TTC ACG GCA AGA TCG CTC −3΄ DNA του R. solanacearum: με RS−1−F/RS−1−R = 718 bp με RS−1−F/RS−3−R = 716 bp 4.2. Μείγμα αντίδρασης PCR

Παρασκευή του ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης 5.1. Bromophenol blue (10% πυκνό διάλυμα) Bromophenol blue 5 g Αποσταγμένο νερό (διπλά αποσταγμένο) 50 ml 5.2. Ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης Γλυκερίνη (86%) 3,5 ml Bromophenol blue (5.1) 300 µl Αποσταγμένο νερό (διπλά αποσταγμένο) 6,2 ml

10X Tris Acetate EDTA (TAE) ρυθμιστικό διάλυμα, pH 8.0 Ρυθμιστικό διάλυμα Tris 48,40 g Κρυσταλλικό οξικό οξύ 11,42 ml EDTA (disodium salt) 3,72 g Αποσταγμένο νερό 1,00 L Διαλύεται σε 1X πριν τη χρήση. Διατίθεται επίσης στο εμπόριο (π.χ. Invitrogen ή ισοδύναμο). Προσάρτημα 7 Επικυρωμένα αντιδραστήρια για τη δοκιμή FISH

Ολιγοανιχνευτές ανιχνευτής OLI−1−CY3 ειδικός για το R. solanacearum: 5΄− GGC AGG TAG CAA GCT ACC CCC−3΄ Μη εξειδικευμένος ανιχνευτής ευβακτηρίου EUB−338FITC: 5΄− GCT GCC TCC CGT AGG AGT −3΄

Προσηλωτικό διάλυμα [ΠΡΟΣΟΧΗ! ΤΟ ΠΡΟΣΗΛΩΤΙΚΟ ΥΓΡΟ ΠΕΡΙΕΧΕΙ ΠΑΡΑΦΟΡΜΑΛΔΕΫΔΗ Η ΟΠΟΙΑ ΕΙΝΑΙ ΤΟΞΙΚΗ. ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΦΟΡΟΥΝΤΑΙ ΓΑΝΤΙΑ ΚΑΙ ΝΑ ΜΗΝ ΓΙΝΟΝΤΑΙ ΕΙΣΠΝΟΕΣ. ΣΥΝΙΣΤΑΤΑΙ Η ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΕ ΑΠΑΓΩΓΟ] i) Θερμαίνονται 9 ml ύδατος μοριακού βαθμού καθαρότητας [π.χ. υπέρ καθαρό νερό (UPW)] σε περίπου 60 °C και προστίθενται 0,4 g παραφορμαλδεΰδης. Η παραφορμαλδεΰδη διαλύεται μετά την προσθήκη 5 σταγόνων 1N NaOH και ανάδευση με μαγνητικό αναδευτήρα. ii) Το pH ρυθμίζεται στην τιμή 7.0 με την προσθήκη 1ml 0,1M ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (PB· pH 7.0) και 5 σταγόνων 1N HCl. Ελέγχεται το pH με ταινίες δεικτών και προσαρμόζεται εάν είναι απαραίτητο με HCl ή NaOH. [ΠΡΟΣΟΧΗ! ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΑΙ ΠΕΧΑΜΕΤΡΟ ΣΕ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΜΕ ΠΑΡΑΦΟΡΜΑΛΔΕΫΔΗ] iii) Το διάλυμα φιλτράρεται μέσω φίλτρου μεμβράνης 0,22 µm και διατηρείται απαλλαγμένο από σκόνη στους 4 °C έως ότου ξαναχρησιμοποιηθεί.

3X Hybmix NaCl 2,7 M Tris−HCl 60 mM (pH 7.4) EDTA (αποστειρωμένο με διήθηση από 15 mM φίλτρο και σε αυτόκαυστο) Αραιώνεται σε 1X όπως απαιτείται.

Διάλυμα υβριδισμού 1X Hybmix Sodium dodecyl sulphate (SDS) 0,01% Formamide (φορμαμίδη) 30% ανιχνευτής EUB 338 5 ng/µl ανιχνευτής OLI−1 ή OLI−2 5 ng/µl Παρασκευάζονται ποσότητες διαλύματος υβριδισμού σύμφωνα με τους υπολογισμούς του πίνακα 1. Για κάθε αντικειμενοφόρο (που περιλαμβάνει 2 διαφορετικά δείγματα εις διπλούν) απαιτούνται 90 µl διαλύματος υβριδισμού. ΠΡΟΣΟΧΗ: Η ΦΟΡΜΑΜΙΔΗ ΕΙΝΑΙ ΠΟΛΥ ΤΟΞΙΚΗ ΚΑΙ ΓΙΑ ΤΟ ΛΟΓΟ ΑΥΤΟ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΓΑΝΤΙΑ ΚΑΙ ΝΑ ΛΑΜΒΑΝΟΝΤΑΙ ΟΙ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΕΣ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ! Πίνακας 1: Συνιστώμενες ποσότητες για την παρασκευή του μείγματος υβριδισμού Αριθμός αντικειμενοφόρων: 1 4 6 8 10 Αποστειρωμένο UPW 23,1 92,4 138,6 184,8 231,0 3x hybmix 30,0 120,0 180,0 240,0 300,0 1% SDS 0,9 3,6 5,4 7,2 9,0 Formamide (φορμαμίδη) 27,0 108,0 162,0 216,0 270,0 Ανιχνευτής EUB 338 (100 ng/µl) 4,5 18,0 27,0 36,0 45,0 Ανιχνευτής OLI−1 ή OLI−2 (100 ng/µl) 4,5 18,0 27,0 36,0 45,0 Συνολικός όγκος (µl) 90,0 360,0 540,0 720,0 900,0 Σημείωση: Όλα τα διαλύματα που περιέχουν φωτοευαίσθητους ολιγοανιχνευτές αποθηκεύονται στο σκοτάδι στους −20 °C. Προστατεύονται από το άμεσο φως του ηλίου ή το ηλεκτρικό φως κατά τη χρήση.

0,1M ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, pH 7.0 Na2 HPO4 8,52 g KH2 PO4 5,44 g Αποσταγμένο νερό 1,00 L Διαλύονται τα συστατικά, ελέγχεται η τιμή του pH και το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά. Προσάρτημα 8 Καλλιέργεια μελιτζάνας και τομάτας Σπόροι τομάτας (Lycopersicon esculentum) ή μελιτζάνας (Solanum melongena) σπέρνονται σε παστεριωμένο υπόστρωμα. Μετά την πλήρη έκπτυξη των κοτυληδόνων (10−14 ημέρες), τα σπορόφυτα μεταφυτεύονται σε γλάστρες με παστεριωμένο υπόστρωμα. Τα φυτά μελιτζάνας ή τομάτας πρέπει να καλλιεργούνται σε θερμοκήπιο με τις ακόλουθες περιβαλλοντικές συνθήκες πριν από την τεχνητή μόλυνση: Μήκος ημέρας: 14 ώρες ή φυσικό μήκος ημέρας, αν είναι μεγαλύτερο Θερμοκρασία: ημέρα: 21 έως 24 °C, νύχτα: 14 έως 18 °C. Ευπαθής ποικιλία τομάτας: «Moneymaker» Ευπαθής ποικιλία μελιτζάνας:«Black Beauty» Προμηθευτές: βλέπε ιστοχώρο http://forum.europa. eu.int/Public/irc/sanco/Home/main ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent−oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762−770.

Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105: 373−380.

Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J. L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double−Antibody Sandwich Indirect Enzyme−Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology 68: 3634−3638.

Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant−Microbe Interactions 1: 113−121.

Elphinstone, J. G., Hennessy, J., Wilson, J. K. and Stead, D. E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26: 663−678.

Englebrecht, M. C. (1994) Modification of a semiselective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A. C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3−5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia.

Hayward, A.C., 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27: 265277.

Hayward, A.C., El−Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69: 269−280.

Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya−Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi−selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146: 379384.

Janse, J. D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18: 343−351.

Janse, J.D. 1991. Infra− and intra−specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty−acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14: 335−345.

Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44: 693−695.

Klement Z.· Rudolph, K and D. C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadιmiai Kiadσ, Budapest, 568 pp.

Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.

Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117−121.

Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60: 2286−2295

Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep−PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85: 528−536.

Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.−F Wang, T.−H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A. C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N.Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain−specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5: 19−33.

Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148: 619−626.

Pastrik, K. H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R.

Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S−23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108: 831842.

Robinson−Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J. G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7: 6779.

Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. − 3. ed.· St. Paul, Minnesota:, 373 pp

Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W.Young, and M.J.Daniels.

Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587−1594.

Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61: 4262−4268.

Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty−acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42: 281−295.

Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46: 10−15.

Van Der Wolf, J. M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC−PFGE and rep−PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44−49.

Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66: 2853−2858.

Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L.Akkermans. 1998. Detection of Ralstonia solanacearum , which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA−targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546−4554.

Για κάθε πιθανολογούμενη παρουσία για την οποία υπάρχει θετικό αποτέλεσμα στη (στις) δοκιμή(−ές) διαλογής, σύμφωνα με τις σχετικές μεθόδους που ορί μένεται επιβεβαίωση ή διάψευση με την ολοκλήρωση των εν λόγω μεθόδων, παρακρατούνται και φυλάσσονται κατάλληλα: – όλοι οι κόνδυλοι του δείγματος και, όταν είναι εφικτό, όλα τα φυτά της δειγματοληψίας, – κάθε εναπομένον εκχύλισμα και πρόσθετο υλικό που παρασκευάσθηκε για την ή τις δοκιμές διαλογής, π.χ. αντικειμενοφόροι πλάκες ανοσοφθορισμού, και – όλη η σχετική τεκμηρίωση, μέχρι την ολοκλήρωση των εν λόγω μεθόδων. Η παρακράτηση των κονδύλων θα καταστήσει δυνατή τη διεξαγωγή δοκιμών ποικιλιών όπου αυτό ενδείκνυται.

Σε περίπτωση θετικής επιβεβαίωσης του οργανισμού, παρακρατείται και φυλάσσεται κατάλληλα: – το υλικό που αναφέρεται στην παράγραφο 1, και – δείγμα του μολυσμένου υλικού τομάτας ή μελιτζάνας το οποίο έχει μολυνθεί τεχνητά με εκχύλισμα κονδύλου ή φυτού, όπου αυτό ενδείκνυται, και – η απομονωμένη καλλιέργεια του οργανισμού για τουλάχιστον ένα μήνα μετά τη διαδικασία κοινοποίησης του άρθρου 5 παράγραφος 2 του παρόντος.

Τα στοιχεία που λαμβάνονται υπόψη στον προσδιορισμό της έκτασης της πιθανής μόλυνσης βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο iii) του παρόντος και του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο γ) σημείο iii) του παρόντος περιλαμβάνουν, κατά περίπτωση: – το καταχωρισμένο φυτικό υλικό που παράγεται σε τόπο παραγωγής χαρακτηρισμένο ως μολυσμένο βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο ii) του παρόντος, – τον (ή τους) τόπο(−ους) παραγωγής που έχει κάποιο δεσμό παραγωγής με το καταχωρισμένο φυτικό υλικό που έχει χαρακτηρισθεί ως μολυσμένο βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο ii) του παρόντος, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που μοιράζονται τον εξοπλισμό και εγκαταστάσεις παραγωγής απευθείας ή μέσω κοινού αναδόχου, – το καταχωρισμένο φυτικό υλικό που παράγεται στον ή τους τόπους παραγωγής που αναφέρονται στην προηγούμενη περίπτωση, ή που υπήρχε στον ή τους τόπους παραγωγής κατά την ίδια περίοδο κατά την οποία το καταχωρισμένο φυτικό υλικό που χαρακτηρίστηκε ως μολυσμένο βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο

Τα στοιχεία που λαμβάνονται υπόψη στον προσδιορισμό της πιθανής μετάδοσης που αναφέρεται στο άρθρο 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο iv) του παρόντος και το άρθρο 5 παράγραφος 1 στοιχείο γ) σημείο iii) του παρόντος περιλαμβάνουν: i) στις περιπτώσεις βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο iv) του παρόντος: – τη γειτνίαση άλλων τόπων παραγωγής όπου καλλιεργείται το καταχωρισμένο φυτικό υλικό, – τη συνήθη παραγωγή και χρησιμοποίηση του αποθέματος πατατόσπορου, σμένου φυτικού υλικού σε περιπτώσεις κατά τις οποίες υπάρχει ή υπήρξε κίνδυνος απορροών επιφανειακού νερού από καλλιεργήσιμα εδάφη που έχουν χαρακτηρισθεί ως μολυσμένα βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο ii) του παρόντος ή πλημμύρας των εδαφών αυτών από επιφανειακό νερό, ii) στις περιπτώσεις κατά τις οποίες το επιφανειακό νερό χαρακτηρίστηκε ως μολυσμένο βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο γ) σημείο ii) του παρόντος: – τον ή τους τόπους παραγωγής του καταχωρισμένου φυτικού υλικού που γειτνιάζουν ή που υπάρχει κίνδυνος να πλημμυρίσουν με επιφανειακό νερό χαρακτηρισμένο ως μολυσμένο, – οποιαδήποτε διακριτή λεκάνη άρδευσης που συνδέεται με το επιφανειακό νερό που έχει χαρακτηρισθεί ως μολυσμένο, – ύδατα που συνδέονται με το επιφανειακό νερό που έχει χαρακτηρισθεί ως μολυσμένο, λαμβάνοντας υπόψη: − την κατεύθυνση και το ρυθμό ροής του νερού που έχει χαρακτηρισθεί ως μολυσμένο, − την παρουσία άγριων σολανωδών φυτών ξενιστών.

Η κοινοποίηση που αναφέρεται στο άρθρο 5 παράγραφος 2 πρώτο εδάφιο του παρόντος παρέχεται ως εξής: – αμέσως μετά την επιβεβαίωση της παρουσίας του οργανισμού μέσω εργαστηριακών δοκιμών, κάνοντας χρήση των μεθόδων που παρατίθενται στο παράρτημα ΙΙ, τουλάχιστον: – όσον αφορά τις πατάτες, (α) την ονομασία της ποικιλίας της παρτίδας, (β) τον τύπο [πατάτες εμπορίου (ware), πατατόσπορος, κ.τ.λ.] και, όπου ενδείκνυται, την κατηγορία του πατατόσπορου, – όσον αφορά τα φυτά τομάτας, την ονομασία της ποικιλίας της παρτίδας και, όπου είναι σκόπιμο, την κατηγορία, – με την επιφύλαξη των απαιτήσεων κοινοποίησης πιθανολογούμενης εμφάνισης του άρθρου 4 παράγραφος 3 του παρόντος, η Διεύθυνση Προστασίας Φυτικής Παραγωγής του Υπουργείου Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων, στην περίπτωση επιβεβαίωσης της εμφάνισης, κοινοποιεί αμέσως στο(−α) ενδιαφερόμενο(−α) κράτος(−η) μέλος(−η), όταν υπάρχει κίνδυνος μόλυνσης καταχωρισμένου φυτικού υλικού από άλλο(−α) κράτος(η) μέλος(−η) ή εντός αυτού(−ών), τις πληροφορίες που απαιτούνται για τη συμμόρφωσή του με το άρθρο 5 παράγραφος 3 του παρόντος, όπως:

Οι λεπτομέρειες της πρόσθετης κοινοποίησης που αναφέρεται στο άρθρο 5 παράγραφος 2 δεύτερο εδάφιο του παρόντος παρέχονται ως ακολούθως: μετά την ολοκλήρωση όλων των ερευνών, για κάθε περίπτωση:

Οι διατάξεις που αναφέρονται στο άρθρο 6 παράγραφος 1 του παρόντος, είναι οι εξής: – χρήση ως ζωοτροφή ύστερα από θερμική επεξεργασία ώστε να μην υπάρχει κίνδυνος επιβίωσης του οργανισμού, ή – διάθεση σε επισήμως εγκεκριμένη ειδική τοποθεσία διάθεσης αποβλήτων στην οποία δεν υπάρχει εμφανής κίνδυνος διαφυγής του οργανισμού στο περιβάλλον, μέσω π.χ. διήθησης σε γεωργικά εδάφη ή επαφής με πηγές νερού που μπορούν να χρησιμοποιούνται για άρδευση γεωργικών εδαφών ή – καύση, ή – βιομηχανική μεταποίηση μέσω απευθείας και άμεσης παράδοσης σε μεταποιητική μονάδα με επισήμως εγκεκριμένες εγκαταστάσεις διάθεσης αποβλήτων για τις οποίες έχει διαπιστωθεί ότι δεν υπάρχει εμφανής κίνδυνος μετάδοσης του οργανισμού και με σύστημα καθαρισμού και απολύμανσης τουλάχιστον των αναχωρούντων οχημάτων, ή – άλλα μέτρα, με την προϋπόθεση ότι έχει διαπιστωθεί ότι δεν υπάρχει εμφανής κίνδυνος μετάδοσης του οργανισμού· τα μέτρα αυτά και η αιτιολόγησή τους κοινοποιούνται αμέσως στην Επιτροπή και στις αρμόδιες αρχές των άλλων κρατών μελών από τη Διεύθυνση Προστασίας Φυτικής Παραγωγής του Υπουργείου Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων. Όλα τα εναπομείναντα απόβλητα που σχετίζονται και προκύπτουν από τις ανωτέρω επιλογές διατίθενται με επισήμως εγκεκριμένες μεθόδους σύμφωνα με το παράρτημα VII του παρόντος διατάγματος. φος 2 του παρόντος, υπό τον έλεγχο των αρμοδίων αρχών με την κατάλληλη επικοινωνία μεταξύ τους ώστε να εξασφαλίζεται πάντοτε ο έλεγχος αυτός και με την έγκριση τους στην περίπτωση που συσκευάζονται ή μεταποιούνται οι πατάτες όσον αφορά τις εγκαταστάσεις διάθεσης αποβλήτων που αναφέρονται στην πρώτη και τη δεύτερη περίπτωση, είναι η ακόλουθη: i) για κονδύλους πατάτας, – χρήση ως πατάτες εμπορίου (ware) με προορισμό την κατανάλωση, συσκευασμένες για άμεση παράδοση και χρήση χωρίς επανασυσκευασία, σε χώρο με κατάλληλες εγκαταστάσεις διάθεσης αποβλήτων. Οι πατάτες που προορίζονται για φύτευση μπορούν να υποβληθούν σε χερισμό στον ίδιο χώρο μόνον, εάν ο χειρισμός αυτός γίνει χωριστά ή μετά από καθαρισμό και απολύμανση, ή – χρήση ως πατάτες εμπορίου (ware) προοριζόμενες για βιομηχανική μεταποίηση, και που προορίζονται για απευθείας και άμεση παράδοση σε μεταποιητική μονάδα με κατάλληλες εγκαταστάσεις διάθεσης αποβλήτων και με σύστημα καθαρισμού και απολύμανσης τουλάχιστον των αναχωρούντων οχημάτων, ή – άλλη χρήση ή διάθεση, με την προϋποθεση ότι έχει διαπιστωθεί ότι δεν υπάρχει εμφανής κίνδυνος διάδοσης του οργανισμού και υπό την προϋπόθεση της έγκρισης από τις επίσημες αρχές, ii) για άλλα μέρη φυτών, συμπεριλαμβανομένων υπολειμμάτων βλαστών και φυλλώματος, – καταστροφή ή – άλλη χρήση ή διάθεση, με την προϋποθεση ότι έχει διαπιστωθεί ότι δεν υπάρχει εμφανής κίνδυνος διάδοσης του οργανισμού και υπό την προϋπόθεση της χορήγησης έγκρισης από τις αρμόδιες επίσημες αρχές.

Οι κατάλληλες μέθοδοι απολύμανσης των αντικειμένων που αναφέρονται στο άρθρο 6 παράγραφος 3 του παρόντος πρέπει να είναι ο καθαρισμός και, κατά περίπτωση, η απολύμανση, έτσι ώστε να μην υπάρχει εμφανής κίνδυνος μετάδοσης του οργανισμού και πρέπει να εφαρμόζονται υπό την εποπτεία των αρμόδιων επισήμων αρχών.

Η σειρά μέτρων που εφαρμόζουν οι αρμόδιες αρχές εντός των οριοθετημένων ζωνών που καθορίστηκαν σύμφωνα με το άρθρο 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο iv) και στοιχείο γ) σημείο iii) και αναφέρονται στο άρθρο 6 παράγραφος 4, του παρόντος περιλαμβάνει: 4.1. Σε περιπτώσεις όπου οι περιοχές παραγωγής χαρακτηρίζονται ως μολυσμένες βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο ii) του παρόντος: